发酵工程韦革宏杨祥第4章1节 培养基：培养基：培养基是指一切可供微生物细胞（也包括培养基是指一切可供微生物细胞（也包括动植物细胞）生长繁殖和积累代谢产物所需的人工动植物细胞）生长繁殖和积累代谢产物所需的人工配制的营养物质和原料的总和配制的营养物质和原料的总和同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件必须的条件 发酵培养基的概念 第一节 发酵营养基质的组成 一、碳源营养l微生物从总体上说几乎可以分解利用地球上的一切有机物，但其碳源谱个体差异较大总的来说，发酵上常用的碳源集中在糖类、脂类和烃类三种，糖类最常用 一、碳源营养 1.葡萄糖l优势：广谱碳源，几乎所有的微生物都能利用l劣势：初糖效应、影响DO，且其代谢对很多发酵产物有干扰l解决方法：流加或连续发酵2.其他糖类l果糖＞双糖＞多糖＞有机酸、醇、酯、烃l常用价格便宜的，如淀粉，但需预处理 一、碳源营养3.糖蜜l糖蜜(molasses)是制糖工业的下脚料将提纯的甘蔗汁或甜菜汁熬成带有结晶的糖膏，用离心机分出结晶糖，重复多次，至不能结晶，此母液即糖蜜l典型糖蜜的成分和性状，见下页表4-3. 比较比较比较比较项目项目项目项目含糖含糖含糖含糖量量量量含水含水含水含水量量量量蛋白蛋白蛋白蛋白含量含量含量含量灰分灰分灰分灰分( (无机无机无机无机盐盐盐盐) )PHPH值值值值色泽色泽色泽色泽气味气味气味气味特点特点特点特点45%45%～～～～50% 50% 18%18%～～～～36% 36% 0.1%0.1%～～～～8% 8% 4%4%～～～～12.512.5% % 5 5～～～～7.5 7.5 黄色黄色黄色黄色至褐至褐至褐至褐色色色色糖味、糖味、糖味、糖味、焦糖焦糖焦糖焦糖味味味味表表4-3 典型糖蜜的成分和性状典型糖蜜的成分和性状 一、碳源营养l由于我国制糖工业在南方和北方所用原料不同，所以糖蜜也主要有甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种。
l糖蜜的品质因不同产地、不同产区土质、不同气候、不同原料品种、不同收获季节、不同制糖方法与工艺条件而有很大差异l糖蜜主要应用在氨基酸、抗生素、酒精等发酵工业上 一、碳源营养4.脂类l含义：主要指各种长链脂肪酸l常用物质：各种动物油和植物油，如各种菜油、豆油、棉子油、葵花子油、猪油、鱼油等l常用菌种：如解脂假丝酵母等l使用注意事项：乳化问题、供氧问题 一、碳源营养5.烃类l常用物质：常以石油各个组分为原料l常用菌种：即“石油微生物”，如热带假丝酵母、解脂假丝酵母、嗜油毕赤氏酵母、脱蜡球拟酵母以及某些假单胞菌等l发酵行业：石油脱蜡、SCP生产 二、氮源营养l凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源微生物整体利用的氮源范围则称氮源谱l象碳源谱一样，微生物的氮源谱也比较广大，但个体间差异较碳源谱小，NCHO型最易利用l除极少数具有固氮能力的微生物以外，微生物的氮源都来自自然界中的无机氮或有机氮物质，因此我们可以将氮源分为无机氮源和有机氮源两种 二、氮源营养1.无机氮源l常用物质：氨水、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等l特点：利用速度快，很多是速效氮源 某些利用后会改变培养基pH值，称这些氮 源为生理酸、碱性物质l氨水简介l缺点：有些微生物不能利用 二、氮源营养2.有机氮源l常用物质：主要是各种成分复杂的工农业下脚料，如各种豆粉、玉米粉、棉子饼粉、花生饼粉、各种蛋白粉、鱼粉、蚕蛹粉、某些发酵的废菌丝体粉、酿酒工业的酒糟以及实验室常用的牛肉膏、蛋白胨等等l特点：营养丰富，常为迟效氮源 二、氮源营养2.有机氮源1.玉米浆–概念：玉米浆是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的。
目前主要应用于抗生素工业–玉米浆由于浸泡使得营养十分丰富–使用注意：酸性(pH值约为4)，质量波动 二、氮源营养2.尿素–亦称脲，CO(NH2)2，相当于碳酸的二酰氨，外观为白色晶体或粉末，是动物蛋白质代谢后的产物–应用范围：广泛，尤其在抗生素和氨基酸发酵中–使用注意1.中性氮源2.含氮量高（46%）3.微生物必须能分泌脲酶4.营养简单 二、氮源营养3.蛋白胨–概念：外观呈淡黄色的粉剂，是具有某种类似肉香的特殊气味，平均分子量在2000左右的氮素混合物–使用注意1.营养成分的波动2.一般仅用于实验室3.防止吸潮 三、无机盐及微量元素l概念：指除碳、氮元素外其他各种重要元素及其供体l划分：大量元素(10-3～10-4mol/L) 主要是P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等 微量元素(10-6～10-8mol/L) 主要是Cu、Zn、Mn、Mo和Co等l使用：大量元素：盐；微量元素：有机碳(氮)源、高倍贮液 三、无机盐及微量元素1.磷元素l细胞内存在：磷酸基团，以酯键与各种细胞组分相连接l作用：1.细胞膜组分2.活化糖类分子3.共价修饰4.桥接核苷酸5.组成ATP 三、无机盐及微量元素l常用供体：K3PO4·3H2O、K3PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等l注意事项：1.“磷酸盐调节”现象2.有机碳(氮)源的使用 三、无机盐及微量元素2.硫元素l细胞内存在：多以巯基或杂环硫形式存在l作用：1.蛋白质构象形成必需2.构成含硫维生素l供体：硫酸盐l注意事项：1.有机碳(氮)源的使用2.产物含硫的发酵 三、无机盐及微量元素3.钙元素l细胞内存在：二价离子(Ca2+)形式l作用：1.很多酶的辅因子或激活剂2.渗透压调节剂l供体：CaCl2l注意事项：1.不要与磷酸盐同时添加2.可以用CaCO3作为备用碱 三、无机盐及微量元素4.镁元素l细胞内存在：二价离子(Mg2+)形式l作用：1.很多酶的辅因子或激活剂2.叶绿素组分l供体：MgSO4l注意事项：1.注意发酵培养基的pH值 三、无机盐及微量元素5.钾元素l细胞内存在：一价离子(K+)形式l作用：1.很多酶的辅因子或激活剂l供体：KH2PO4和K2HPO4 三、无机盐及微量元素6.钠元素l细胞内存在：一价离子(Na+)形式l作用：1.调节渗透压2.某些特殊微生物所需l供体：NaH2PO4，Na2SO4，NaCll注意事项：1.培养原生质体时注意盐浓度 三、无机盐及微量元素7.铁元素l细胞内存在：二价离子(Fe2+)形式存在，常与蛋白质结合l作用：1.呼吸链重要组分l供体：FeSO4·7H2Ol注意事项：1.注意不要过量添加 三、无机盐及微量元素8.微量元素l细胞内存在：多以蛋白结合离子方式存在l作用：1.多为某酶的核心组分l供体：在机碳(氮)源中含有，或使用高倍贮液l注意事项：1.绝对不可过量，在一些特殊发酵中要严格控制 表表4-7 主要无机元素的来源和功能主要无机元素的来源和功能(引自周德庆等,1993) 四、水l作用：1.起到溶剂与运输介质的作用2.参与细胞内一系列化学反应3.维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象4.高比热、高汽化热、高沸点、固态低密度l供体：去离子水、蒸馏水、双蒸水或自来水l注意：1.自来水中的氯2.特殊发酵行业的要求 五、生长因子l概念：生长因子是一类对微生物必不可少的小分子有机物质。
l范围：–广义：维生素、碱基、卟啉及其衍生物以及某些氨基酸等–狭义：仅指维生素l主要维生素：各种B族维生素常见维生素生理功能参见表4-9. 表表4-9 常见维生素生理功能常见维生素生理功能 五、生长因子l使用：一般也不需单独添加，常在有机碳(氮)源中含有l常用供体：1.酵母膏2.高倍维生素贮液l生物素简介–生物素（biotin）是含硫原子的一元环状弱酸，是一种重要的生长因子 五、生长因子l生物素简介–作用：是细胞内许多需ATP的羧化反应中羧基的载体，羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原子结合，如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应中–使用：谷氨酸发酵中一般都使用生物素缺陷型的菌株，发酵时控制生物素“亚适量”，一般为5 μg/L左右–常用供体：纯品或由玉米浆或豆饼水解液提供 六、前体物质l概念：–前体是指一些添加到培养基中的物质，它们并不促进微生物的生长，但能直接通过微生物的生物合成过程结合到产物分子上去，自身结构基本不变，而产物产量却因此有较大提高 l主要应用：–氨基酸发酵和抗生素发酵l使用注意：–过量有毒，应先估算，再由实验确定用量 七、产物促进剂和抑制剂 l产物促进剂指在发酵过程中添加的，既不是营养物又不是前体物质，但是却能提高产量的物质；而产物抑制剂主要是一些对生产菌代谢途径有某种调节能力的物质。
这两者都是对发酵过程有某种调节作用，使发酵过程按照预定的路线进行或更有效率l例如α-甘露糖苷酶发酵中加入甘露聚糖，四环素发酵中加入2-巯基苯骈噻唑，甘油发酵加入亚硫酸氢钠等 微生物碳源谱l微生物整体可以利用的碳源总范围称碳源谱(Spectrum of Carbon Sources)，例如：–糖类：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纤维二糖，纤维素，半纤维素，甲壳素，木质素等–脂类：各种植物油、动物油，磷脂等–有机酸类：乳酸，柠檬酸，延胡索酸，低级脂肪酸，高级脂肪酸，氨基酸等–其他：如乙醇、石蜡、碳酸盐等 类类类类型型型型元素水平元素水平元素水平元素水平 化合物水平化合物水平化合物水平化合物水平 培养基原料水平培养基原料水平培养基原料水平培养基原料水平有有有有机机机机碳碳碳碳C·H·O·N·XC·H·O·N·X复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、花生饼牛肉膏、蛋白胨、花生饼牛肉膏、蛋白胨、花生饼牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉等粉等粉等粉等C·H·O·NC·H·O·N多数氨基酸、简单蛋白多数氨基酸、简单蛋白多数氨基酸、简单蛋白多数氨基酸、简单蛋白质等质等质等质等一般氨基酸、明胶等一般氨基酸、明胶等一般氨基酸、明胶等一般氨基酸、明胶等C·H·OC·H·O糖、有机酸、醇、脂类糖、有机酸、醇、脂类糖、有机酸、醇、脂类糖、有机酸、醇、脂类等等等等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等糖蜜等糖蜜等糖蜜等C·HC·H烃类烃类烃类烃类天然气、石油及其不同馏天然气、石油及其不同馏天然气、石油及其不同馏天然气、石油及其不同馏份、石蜡油等份、石蜡油等份、石蜡油等份、石蜡油等无无无无机机机机碳碳碳碳C(?)C(?)————C·OC·OCOCO2 2COCO2 2C·O·XC·O·XNaHCONaHCO3 3NaHCONaHCO3 3、、、、CaCOCaCO3 3、等、等、等、等表表4-1 微生物的碳源谱微生物的碳源谱 表表4-2 谷氨酸发酵水解糖液质量要求谷氨酸发酵水解糖液质量要求 表表4-5 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的含糖区别甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的含糖区别 表表4-4 不用加工方法对糖蜜质量的影响不用加工方法对糖蜜质量的影响 类类类类型型型型 元素水平元素水平元素水平元素水平化合物水平化合物水平化合物水平化合物水平培养基原料水平培养基原料水平培养基原料水平培养基原料水平有有有有机机机机氮氮氮氮N·C·H·O·XN·C·H·O·X复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、饼粕牛肉膏、酵母膏、饼粕牛肉膏、酵母膏、饼粕牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等粉、蚕蛹粉等粉、蚕蛹粉等粉、蚕蛹粉等N·C·H·ON·C·H·O尿素、一般氨基酸、简单蛋白尿素、一般氨基酸、简单蛋白尿素、一般氨基酸、简单蛋白尿素、一般氨基酸、简单蛋白质等质等质等质等尿素、蛋白胨、明胶等尿素、蛋白胨、明胶等尿素、蛋白胨、明胶等尿素、蛋白胨、明胶等无无无无机机机机氮氮氮氮N·HN·HNHNH3 3、铵盐等、铵盐等、铵盐等、铵盐等(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4等等等等N·O·XN·O·X硝酸盐等硝酸盐等硝酸盐等硝酸盐等KNOKNO3 3等等等等N NN N2 2空气空气空气空气表表4-5 微生物的氮源谱微生物的氮源谱 生理酸性物质和生理碱性物质生理酸性物质和生理碱性物质 (NH4)2SO4→2NH3+H2SO4NaNO3+8[H]→NH3+2H2O+NaOH例如硫酸铵和碳酸钠：例如硫酸铵和碳酸钠：经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源称为生理经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源称为生理酸性物质；经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮酸性物质；经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮源称为生理碱性物质。
源称为生理碱性物质 图片来自阿里巴巴网氨水简介l概念：氨水是氨溶于水得到的水溶液，为无色透明的液体，含氮12％～16％，易挥发，具有特殊的强烈刺激性臭味氨水是一种弱碱(pH值10左右)l应用：广泛，尤其是在氨基酸、抗生素等发酵工业中l功用：除做氮源还可兼做pH调节剂l注意：过滤除菌 表表4-6 玉米浆中各种氨基酸的含量玉米浆中各种氨基酸的含量 (引自甘在红等, 2007) 表表表表4-8 4-8 一些微生物的生长因子一些微生物的生长因子一些微生物的生长因子一些微生物的生长因子 羧基与生物素的关系羧基与生物素的关系羧基与生物素的关系羧基与生物素的关系肽链赖氨酸残基肽链赖氨酸残基肽链赖氨酸残基肽链赖氨酸残基丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶图图图图4-1 4-1 生物素在细胞内的作用生物素在细胞内的作用生物素在细胞内的作用生物素在细胞内的作用 表表4-10 常见培养基原料生物素含量常见培养基原料生物素含量 (引自俞俊棠引自俞俊棠,唐孝宣唐孝宣.生物工艺学生物工艺学) 表表4-11 一些氨基酸和抗生素发酵的前体物质一些氨基酸和抗生素发酵的前体物质 (引自贺小贤引自贺小贤,2003) 脱氢四环素脱氢四环素2-2-巯基苯骈噻唑巯基苯骈噻唑巯基苯骈噻唑巯基苯骈噻唑在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂，可使金霉素产量在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂，可使金霉素产量在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂，可使金霉素产量在金霉素链霉菌的四环素发酵中加入抑氯剂，可使金霉素产量降至降至降至降至5%5%以下。
以下 2ATP 2ADP2ADP2ATPCO2NaHSO3NADH+H＋＋NAD﹢H2OPi葡葡萄萄糖糖二磷二磷酸果酸果糖糖3-磷酸甘磷酸甘油醛油醛磷酸二羟丙磷酸二羟丙酮酮丙酮酸丙酮酸乙乙醛醛乙醛乙醛HSO3α-磷酸甘油磷酸甘油甘甘油油酵母酵母酵母酵母ⅡⅡⅡⅡ型发酵型发酵型发酵型发酵 ( (甘油发酵甘油发酵甘油发酵甘油发酵) ) 。