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1、无菌检验的操无菌检验的操作及注意事项作及注意事项l 生物制品（另有规定者外）都生物制品（另有规定者外）都不应该有外源微生物污染。灭活不应该有外源微生物污染。灭活疫苗不得含有活的本菌或本毒。疫苗不得含有活的本菌或本毒。各类微生物制品必须按规定作无各类微生物制品必须按规定作无菌检验或纯粹检验。全部操作应菌检验或纯粹检验。全部操作应在无菌条件下进行。在无菌条件下进行。l一、准备：一、准备：l 应随机取样并注意代表性。制造疫应随机取样并注意代表性。制造疫苗用的原菌液，毒液和其它配苗组织乳苗用的原菌液，毒液和其它配苗组织乳剂，稳定剂及半成品的无菌或纯粹检验，剂，稳定剂及半成品的无菌或纯粹检验，应每瓶（罐
2、）分别抽样进行，抽样量为应每瓶（罐）分别抽样进行，抽样量为2-10ml。成品的无菌或纯粹检验应按每。成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行，每批按瓶数百分之批或每个亚批进行，每批按瓶数百分之一抽样，但不应少于一抽样，但不应少于5瓶，最多不超过瓶，最多不超过10瓶，分别进行检验。（所抽样品部门必瓶，分别进行检验。（所抽样品部门必须按前、中、后的代表属性）须按前、中、后的代表属性）l(1)(1)在检验前两天，将所用的培养基按在检验前两天，将所用的培养基按规程规定的种类、数量准备妥当，而且规程规定的种类、数量准备妥当，而且须经须经48h以上的培养鉴定。以上的培养鉴定。l(2)(2)培养基如发现混
3、浊，污染或其它异常培养基如发现混浊，污染或其它异常现象时均不得使用。现象时均不得使用。l(3)(3)工作服、鞋帽必须经高压灭菌或甲醛工作服、鞋帽必须经高压灭菌或甲醛熏蒸灭菌。熏蒸灭菌。l(4)(4)检验用的器具必须高压两次，这些检验用的器具必须高压两次，这些工作均须在前一天准备妥当。工作均须在前一天准备妥当。l(5)样品瓶塞消毒，如用带腊分装的瓶子，样品瓶塞消毒，如用带腊分装的瓶子，必须用小刀仔细刮掉封腊，再用汽油、必须用小刀仔细刮掉封腊，再用汽油、短毛刷刷净残余腊清理干净，经充分溶短毛刷刷净残余腊清理干净，经充分溶解后，再将解后，再将5%碘酒棉盖子塞上，然后罩碘酒棉盖子塞上，然后罩上塑料盖或
4、胶塞，以防碘酒迅速挥发，上塑料盖或胶塞，以防碘酒迅速挥发，消毒消毒2h以上。以上。l(6)(6)把所用培养基逐管仔细排选，以后顺把所用培养基逐管仔细排选，以后顺次置入试管架内，并以玻璃笔或油记号次置入试管架内，并以玻璃笔或油记号笔标好瓶号，管号编号，记明接管日期，笔标好瓶号，管号编号，记明接管日期，把每种培养基多放把每种培养基多放1-2支备用。把酒精灯、支备用。把酒精灯、火柴等先放好备用。火柴等先放好备用。l二操作：二操作： (1)首先更衣，将样品、试管架用具移入无菌室。首先更衣，将样品、试管架用具移入无菌室。(2)操作：在双手不接触针头、注射器内壁等处，操作：在双手不接触针头、注射器内壁等处
5、，不要引起污染的原则下取出注射器，并立即安装好，不要引起污染的原则下取出注射器，并立即安装好，而后去掉样品瓶的碘酒棉。左手拿样品瓶（若冻干而后去掉样品瓶的碘酒棉。左手拿样品瓶（若冻干苗先用注射器在酒精灯控制下吸取灭菌两次的馏水苗先用注射器在酒精灯控制下吸取灭菌两次的馏水适量注入样品瓶内）并稍加振荡，右手持注射器，适量注入样品瓶内）并稍加振荡，右手持注射器，当瓶塞通过火焰后，立即将针头沿胶塞孔壁刺入瓶当瓶塞通过火焰后，立即将针头沿胶塞孔壁刺入瓶内，抽取适量样品，逐管接规定量，首先接种肉汤内，抽取适量样品，逐管接规定量，首先接种肉汤大管，厌气大管，而后逐次接种小管，接种完了将大管，厌气大管，而后逐
6、次接种小管，接种完了将注射器妥善放入消毒锅内，如此逐瓶进行检验。注射器妥善放入消毒锅内，如此逐瓶进行检验。l (3) (3)全部接种完后，熄灭酒精灯，将全部接种完后，熄灭酒精灯，将肉汤，厌气大管，用原纸帽盖好，除霉肉汤，厌气大管，用原纸帽盖好，除霉菌培养置菌培养置25恒温培养箱培养外，其它恒温培养箱培养外，其它所有培养物送入所有培养物送入37温室培养温室培养3-53-5天。天。l (4) (4)根据规程规定的天数进行移植，要根据规程规定的天数进行移植，要领同上，并通过无菌火焰后，吸取培养领同上，并通过无菌火焰后，吸取培养物约物约1ml，而后接种逐管。，而后接种逐管。l三清场处理三清场处理l将用
7、过的注射器煮沸消毒，一般煮将用过的注射器煮沸消毒，一般煮沸开锅后沸开锅后30分钟。分钟。l无菌室内所有用具整理好，放回原无菌室内所有用具整理好，放回原位，而后全面整理如初，无菌室用的工位，而后全面整理如初，无菌室用的工作服，鞋帽等脱掉放回原处。作服，鞋帽等脱掉放回原处。l将把消毒好的注射器等用具清洗干将把消毒好的注射器等用具清洗干净包好送高压灭菌备用。净包好送高压灭菌备用。l四观察：四观察：l（1 1）所有培养物每天逐管仔细观察一次。）所有培养物每天逐管仔细观察一次。l（2 2）无检瓶管无论任何培养基，均不得）无检瓶管无论任何培养基，均不得有任何细菌生长，液体培养基因疫苗种有任何细菌生长，液体
8、培养基因疫苗种类不同表现各异。如血清应澄清，透明类不同表现各异。如血清应澄清，透明如初，羊三联联苗，牛、马出败菌等因如初，羊三联联苗，牛、马出败菌等因含铝胶，所以在含铝胶，所以在24h24h前观察时，培养物一前观察时，培养物一般稍量混浊，般稍量混浊，48h48h通常均下沉，有的已完通常均下沉，有的已完全下沉管底，培养基上半部或全部，可全下沉管底，培养基上半部或全部，可呈现较透明或完全透明。如加有牛奶或呈现较透明或完全透明。如加有牛奶或明胶保护剂的，鸡明胶保护剂的，鸡系、鸡系、鸡系，羊痘，系，羊痘，l猪瘟冻干苗等，如若不污染苗在猪瘟冻干苗等，如若不污染苗在24-48h观察时，管底有乳白絮状小量沉
9、淀，上观察时，管底有乳白絮状小量沉淀，上透明。如若污染上部混浊，混浊度与污透明。如若污染上部混浊，混浊度与污染苗多少、种类而异。染苗多少、种类而异。l（3 3）纯粹检验瓶管判定较难，更须仔细）纯粹检验瓶管判定较难，更须仔细观察，由于菌苗种类不同表现也有所不观察，由于菌苗种类不同表现也有所不同。同。l A . A . 炭疽炭疽苗：在普通琼脂上生长很苗：在普通琼脂上生长很快，检验时可以从正面和背面进行观察快，检验时可以从正面和背面进行观察一般一般24h24h可全面生长，灰白色半透明的，可全面生长，灰白色半透明的，较干燥的菌苔，表面平坦，上部边缘较较干燥的菌苔，表面平坦，上部边缘较薄，薄，3-53-
10、5天在菌苔表面形成，密集的天在菌苔表面形成，密集的l子集落，初针尖大小的隆起小包，后变子集落，初针尖大小的隆起小包，后变成平凹团状形态，表面不平，在肉汤中成平凹团状形态，表面不平，在肉汤中24小时能生长良好，既无菌膜亦不平均小时能生长良好，既无菌膜亦不平均混浊，震摇时，有散在渣状物游离其中，混浊，震摇时，有散在渣状物游离其中，易被摇散，稍呈混浊。在厌气肉肝汤中易被摇散，稍呈混浊。在厌气肉肝汤中亦可生长，但较差除呈现混浊外，无其亦可生长，但较差除呈现混浊外，无其他任何现象。他任何现象。l B . B . 布氏杆菌猪布氏杆菌猪号冻干苗：号冻干苗：l在普通琼脂和蛋白胨上均能生长，一般在普通琼脂和蛋白
11、胨上均能生长，一般在在4848小时生长既得显著，底部往往呈现小时生长既得显著，底部往往呈现较圆隆起的菌苔上部呈乳白色平滑，较圆隆起的菌苔上部呈乳白色平滑， l湿润露滴状完全透明并呈微蓝色荧光的湿润露滴状完全透明并呈微蓝色荧光的菌苔，在肉汤中一般菌苔，在肉汤中一般24小时即可生长，小时即可生长，48小时生长显著无菌膜亦无菌块，均混小时生长显著无菌膜亦无菌块，均混浊，但有时表面沿管壁周围出现轻微的浊，但有时表面沿管壁周围出现轻微的乳白色菌环，但易摇散，震摇时，沉淀乳白色菌环，但易摇散，震摇时，沉淀管底的菌体呈纽带状缓缓上升，再震时管底的菌体呈纽带状缓缓上升，再震时即平均散开，没有絮状菌丝或菌块在厌
12、即平均散开，没有絮状菌丝或菌块在厌气肉肝汤中生长较差，但呈较轻的平均气肉肝汤中生长较差，但呈较轻的平均混浊，其他无任何现象。在马铃薯斜面混浊，其他无任何现象。在马铃薯斜面及糖发酵管上均生长良好。及糖发酵管上均生长良好。l五鉴定：五鉴定：l 发现可疑菌落时，可按下列原则鉴定。发现可疑菌落时，可按下列原则鉴定。l（1）镜检：将可疑菌落或可疑管，在无镜检：将可疑菌落或可疑管，在无菌的条件下涂片，一般用革兰氏染色后菌的条件下涂片，一般用革兰氏染色后镜检。镜检。l（2）移植：将可疑菌落或瓶管，移植于移植：将可疑菌落或瓶管，移植于同种或适于生长的培养基内进行观察。同种或适于生长的培养基内进行观察。l（3
13、3）分离：将可疑菌落或瓶管，根据生）分离：将可疑菌落或瓶管，根据生长情况，用马丁琼脂平板，普通琼脂平长情况，用马丁琼脂平板，普通琼脂平板，或血平板进行划线分离培养。板，或血平板进行划线分离培养。 l l （4 4） 判定：各种产品的培养物，在全判定：各种产品的培养物，在全部观察过程中，如无可疑现象时，观察期部观察过程中，如无可疑现象时，观察期满，即可判为无菌或纯粹通过，但如发现满，即可判为无菌或纯粹通过，但如发现可疑现象或杂菌时，除按规程规定重检外，可疑现象或杂菌时，除按规程规定重检外，需要鉴定的应立即进行鉴定，允许有杂菌需要鉴定的应立即进行鉴定，允许有杂菌的疫苗或活菌苗，还要按规程做杂菌记数的疫苗或活菌苗，还要按规程做杂菌记数及病原性鉴定。及病原性鉴定。谢谢 谢谢 ！
