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1、第四节第四节 HPLC指纹图谱建立的关键技术要求指纹图谱建立的关键技术要求一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定）一、药材样品来源（中间体和注射剂另有规定） 应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。供试品的取样参照中华人民共和国药典供试品的取样参照中华人民共和国药典2010年版中规定的中药材年版中规定的中药材取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按按1：10取样。取样。二、供试品制备二、供试品制备 必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组必须确保中药材的主要
2、化学成分在指纹图谱中的体现。多种有效组分应分别提取制备。分应分别提取制备。三、参照物的制备三、参照物的制备 选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。宜的内标物作为参照物。四、测定方法四、测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。立多张指纹图谱。注意方法学考察。注意方法学考察。1、指纹图
3、谱、指纹图谱 第一，指纹图谱记录时间一般为第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供小时，但应提供2小时的记录图。小时的记录图。第二，第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。2、共有指纹峰的标定、共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹的相对保留时间。根据指纹的相对保留时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指批次的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。纹峰。
4、3、共有指纹峰面积的比值、共有指纹峰面积的比值（1）以参照物峰面积作为）以参照物峰面积作为1 （要求能出现稳定的峰）（要求能出现稳定的峰） ，计算各共有指纹，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标物）峰面积与参照物峰面积的比值（参照物可以是对照品也可以是内标物）。（2）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰）以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为（要求面积相对较大、较为稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其，计算其他各共有指纹峰面积的比值。他各共有指纹峰面积的比值。（3）各共有
5、峰的面积比值必须相对固定。）各共有峰的面积比值必须相对固定。（4）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积）共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积 20%的的共有峰共有峰，其差，其差值不得值不得20%；若；若20% 面积面积 10%共有峰共有峰，其差值不得，其差值不得25%； 若若面积面积 10%的的共有峰共有峰，峰面积比值不作要求峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时，但必须标定相对保留时间。未达到基线分离的间。未达到基线分离的共有峰共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。同时标定该组各峰的相对保留时间。4、非共有峰面积、非
6、共有峰面积 非共有峰总面积不得非共有峰总面积不得 总面积的总面积的10%。5、方法学考察、方法学考察（1）稳定性）稳定性 主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。考察色谱峰的相对保留时间、峰面积的一致性，确定检测时间。（2）精密度）精密度 主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的
7、相对标准偏差对标准偏差RSD不得大于不得大于3%。（3）重现性）重现性 主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差对保留时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于不得大于3%。6、其他注意问题、其他注意问题（1）样品定容）样品定容 一般制成样品的标示浓度单位为一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或或mg/ml。（2）放置）放置
8、供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。小时。（3）有效数字）有效数字 相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点相对保留时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点后后3位。位。（4）留样）留样 注意留样的数量不少于实验实际用量的注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。倍。（5）参照物）参照物 复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能阐明参照物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色
9、谱中。的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。 （6）量化的含义）量化的含义 是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量量”方面的总体差方面的总体差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在“量量”的相对程度。的相对程度。（7）相似度软件）相似度软件 2004年年SFDA中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件，一中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件，一
10、般成品指纹图谱相似度计算结果在之间为符合要求。般成品指纹图谱相似度计算结果在之间为符合要求。图图2 福建太子参福建太子参HPLC指纹图谱指纹图谱图图1 福建莲子福建莲子HPLC指纹图谱指纹图谱第五节第五节 研究实例研究实例 丹参丹参HPLC指纹图谱构建指纹图谱构建一、药材来源（一、药材来源（GAP基地）与鉴定基地）与鉴定二、色谱条件与系统适应性试验二、色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸乙酸（5：95）为流动相；检测波长）为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流；柱温为室温；流速为速为1ml/min。四、供试溶液的
11、制备四、供试溶液的制备 40目，目，10批次，各批次，各1g（精密称取），蒸馏水提取，（精密称取），蒸馏水提取，趁热过滤，得提取液趁热过滤，得提取液100ml，加，加10%盐酸调盐酸调pH为为2，再用，再用乙酸乙酯乙酸乙酯40ml萃取萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流流动相溶解，作为供试品溶液，动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过分析前用微孔滤膜过滤。滤。五、测定五、测定 分别取各批次药材供试品分别取各批次药材供试品10 l，注入，注入HPLC仪，记录仪，记录1h色谱。色谱。 供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有供试品指纹图谱应与质量标
12、准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。良好的相似性。 指纹图谱应有指纹图谱应有12个特征峰。个特征峰。相对保留时间相对保留时间/min（特征峰序号）（特征峰序号） （1）、（）、（2）、（）、（3）、（）、（4）、（）、（5）、（）、（S）、（）、（6）、）、（7）、（）、（8）、（）、（9）、（）、（10）（）（11）。）。特征指纹峰面积积分相对比值特征指纹峰面积积分相对比值 30%(1)、0.72(2)、0.19130%(3)、0.29725%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)、0.139(8)、0.35425%(9)、0.41125%(10)、0.054(11)。仪仪器器Agilent HPLC及及3D色色谱谱工作站；色工作站；色谱谱柱：柱：Zorbax C18（ 250mm）色）色谱谱分析柱分析柱.
