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1、蛋白质含量测定蛋白质含量测定考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法实验十一实验十一实验目的实验目的1.掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量的原理和操作步骤含量的原理和操作步骤2.进一步熟练分光光度计的原理和进一步熟练分光光度计的原理和操作方法操作方法3.掌握标准曲线的制作和使用掌握标准曲线的制作和使用o双缩脲（双缩脲（NHNH3 3CONHCONHCONHCONH3 3）: :凡具有凡具有两个酰胺基或两两个酰胺基或两个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 .
2、.oFolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法） FolinFolin酚试剂中酚试剂中的磷钼酸盐的磷钼酸盐, ,磷钨酸盐被蛋白质中的磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙酪氨酸和苯丙氨酸氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。正比。Folin-Folin-酚法的灵敏度是双缩脲法的酚法的灵敏度是双缩脲法的100100倍倍. .o19761976年由年由BradfordBradford建立的考马斯亮兰法建立的考马斯亮兰法: :染料主要染料主要是与蛋白质
3、中的碱性氨基酸（特别是是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和精氨酸）和芳香族氨基酸残基芳香族氨基酸残基相结合。在相结合。在595nm595nm下测定的吸光下测定的吸光度值度值A595A595，与蛋白质浓度成正比，与蛋白质浓度成正比 . .灵敏度高比灵敏度高比LowryLowry法约高四倍法约高四倍 实验原理o1976年由年由Bradford建立的考马斯亮蓝法，是建立的考马斯亮蓝法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.o考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染料，在游离状态
4、下呈棕红染料，在游离状态下呈棕红色，在酸性溶液中当它与蛋白质结合后，变为蓝色，在酸性溶液中当它与蛋白质结合后，变为蓝色，使染料最大吸收峰位置，由色，使染料最大吸收峰位置，由465nm变为变为595nm，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和，染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合。芳香氨基酸残基结合。o在在595nm测定的吸光度，与蛋白质浓度成正比。测定的吸光度，与蛋白质浓度成正比。Coomassie Dye-Based 蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHC
5、CH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+ Bradford 法的突出特点法的突出特点:(1)(1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg1mg，这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜，这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大，蛋白质色变化很大，蛋白质- -染料复合物有更高的染料复合物有更高的吸光系数。吸光系数。 (2)(2)测定快速，简洁，完成一个样品的测定，测定快速，简洁，完成一个样品的测定，只要只要5 5分钟左右分钟左右 。由于染料与蛋白质结合的。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要过程，大约只要2 2分钟即可完成分钟
6、即可完成, ,其颜色可以其颜色可以在在1 1小时内保持稳定（且在小时内保持稳定（且在5 5分钟至分钟至2020分钟之分钟之间，颜色的稳定性最好）间，颜色的稳定性最好）(3).(3).干扰物质少。干扰物质少。缺点:(1) 各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同蛋白质时有较大的偏差不同，因此不同蛋白质时有较大的偏差 ；(2)有一些去污剂等物质干扰此法的测定；有一些去污剂等物质干扰此法的测定；(3) 标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白定律进行计算而只能用标准
7、曲线来测定未知蛋白质的浓度。质的浓度。 此方法比紫外吸收法高此方法比紫外吸收法高10-20倍倍,凯氏定氮凯氏定氮法比较复杂法比较复杂,但较准确但较准确,往往以定氮法测定的蛋白往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质质作为其他方法的标准蛋白质.器材与试剂器材与试剂n可见光分光光度计可见光分光光度计n试管试管n标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置）配置n考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料试剂：称染料试剂：称100mg考马斯考马斯亮兰，溶于亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至的磷酸，用水稀释至
8、1升。升。(三)操作方法o(1)取取6支试管，支试管，1支作空白支作空白,4支加标准蛋白溶液，支加标准蛋白溶液，1支支留作未知样品。分别加入各种试剂：留作未知样品。分别加入各种试剂：试管编号试管编号123456标准蛋白溶液（标准蛋白溶液（mL)00.20.40.60.8待测样品待测样品（mL)10.9%Nacl （mL)10.80.60.40.2 0染液（染液（mL)444444蛋白质浓度蛋白质浓度（ug/mL）020406080？o(2)加完试剂加完试剂2-5分钟后混匀分钟后混匀,即可开始用比色即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处处的光吸收值
9、的光吸收值A595 ，空白对照为，空白对照为1号管。号管。o用标准蛋白质为横坐标，用吸光值用标准蛋白质为横坐标，用吸光值A595为纵为纵坐标，作图坐标，作图 ，即得一标准曲线。由此标准曲，即得一标准曲线。由此标准曲线，根据测出的为止样品吸收值线，根据测出的为止样品吸收值A595值，即值，即可查出样品蛋白质含量。可查出样品蛋白质含量。标准曲线的制作o坐标纸法坐标纸法o电脑软件法电脑软件法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能的最低与最高值，度选择一般应能包括待测样品的可能的最低与最高值，可选择可选择5种浓度
10、。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。并应与被测液同样条件下显色测定。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。准曲线。 用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度，用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用一般浓度的全距占用
11、了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。相同的格数。标准曲线的制作-坐标纸 绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通氏定律，则系通过原点的直线。过原点的直线。 若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。两边。 绘制完毕以
12、后，应在座标纸上注明实验项目的名称，绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、单色光波长、日期、所使用比色计的型号和仪器编号、单色光波长、日期、室温。室温。 一般应作一般应作2-3次以上的平行测定，重复性良好曲线方次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。可应用。 绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。 电脑作图-Excel为例o
13、首先，将数据整理好输入首先，将数据整理好输入Excel，并选取完，并选取完成的数据区，并点击图表向导；成的数据区，并点击图表向导；o点击图表向导后会运行图表向导如下图，先点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选在图表类型中选“XY散点图散点图”，并选了图表，并选了图表类型的类型的“散点图散点图” o点击点击“下一步下一步”，如果发现图不理想，就要，如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击可以点击“系列系列”来更改来更改. o完成了散点图，现在需要根据数据进行回归完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归
14、方程，绘制出标准曲线。其分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击按右键，点击“添加趋势线添加趋势线”。 o点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，后按右键，选趋势线格式， o在显示公式和显示在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。再点确定。公式和相关系前点一下，勾上。再点确定。公式和相关系数都出来了数都出来了 。四四. .注意事项注意事项（1）如如果果测测定定要要求求很很严严格格，可可以以在在试试剂剂加加入入后后的的5-20 min内内测测定定光光吸吸收收，因因为为再再这这段段时时间间内颜色最稳定。内颜色最稳定。（2）测测定定中中，蛋蛋白白-染染料料复复合合物物会会有有少少部部分分吸吸附附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。 （3）测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。）测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。讨论和分析讨论和分析
