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1、一轮复习基因工程一轮复习基因工程一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术一、基因工程的原理及技术1 1 1 1、原理：、原理：、原理：、原理：基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术重组技术重组技术生物体外生物体外生物体外生物体外基基基基 因因因因DNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平剪切剪切剪切剪切拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入表达表达表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物人类需要的基因产物考点归纳考点归纳1(2010全国全国，5)下列叙述符合基因工程概念的是下列叙述符合基因工程概念的
2、是 () AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴淋巴细胞中的抗体基因细胞中的抗体基因 B将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干能产生人干 扰素的菌株扰素的菌株 C用紫外线照射青霉菌，使其用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株获得青霉素高产菌株 D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整整合到细菌合到细菌DNA上上解析解析：基因工程是在生物体外，通过对基因工程是在生物体外，通过对DNA分子
3、进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使目的基因在受体细胞内表达，导入受体细胞内进行无性繁殖，使目的基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。所以产生出人类所需要的基因产物。所以B为基因工程，而为基因工程，而A为动为动物细胞工程，物细胞工程，C为诱变育种，为诱变育种，D无人为因素不属于基因工程。无人为因素不属于基因工程。答案：答案：B2基因工程的基本工具的比较基因工程的基本工具的比较切割目的基因和载体切割目的基因和载体拼接拼接DNA片段，形成重片段，形成重组组DNA两核苷酸
4、的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键酯键(1)识别特定的核苷识别特定的核苷酸序列酸序列(2)在特定位点上切在特定位点上切割割(1)EcoliDNA连接酶连接酶只能连接黏性末端只能连接黏性末端(2)T4DNA连接酶能连连接酶能连接黏性末端和平末端接黏性末端和平末端EcoR限制酶限制酶Sma限制酶限制酶EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶携带目的基因携带目的基因进入受体细胞进入受体细胞(1)能在宿主细胞内稳能在宿主细胞内稳定存在并大量复制定存在并大量复制(2)有多个限制酶切割有多个限制酶切割位点位点(3)具有特殊的标记基具有特殊的标记基因因质粒、质
5、粒、噬菌体的衍生噬菌体的衍生物、动植物病毒物、动植物病毒考点归纳考点归纳限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶-“分子手术刀分子手术刀” DNADNA连接酶连接酶-“-“分子缝合针分子缝合针”2(2010江苏生物，江苏生物，27)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图图1、图、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：(1)(1)一个图一个图1 1所示的质粒分子经所示的质粒分子经SmaSma切割前后，分别含有切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。(3)(3)用图中的质粒和外
6、源用图中的质粒和外源DNADNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma Sma 切割，原因是切割，原因是_ _ 。(4)(4)与只使用与只使用EcoREcoR相比较，使用相比较，使用BmaHBmaH和和HindHind两种限两种限制酶同时处理质粒、外源制酶同时处理质粒、外源DNADNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止_ _ 0、2Sma会破坏质粒的抗性基因和外源会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因中的目的基因 质粒和含目的基因的外源质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化片段自身环化(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，为了获取重组质粒，将切割后的质
7、粒与目的基因片段混合，并加入并加入_酶。酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_ 。(7)为了从为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。表达的初步检测。DNA连接连接鉴别和筛选含有目的基因鉴别和筛选含有目的基因的细胞的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质蔗糖为唯一含碳营养物质 解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。解析：本题综合考查基因
8、工程的过程及应用。(1)(1)质粒是双链环状质粒是双链环状DNADNA分分子，在子，在SmaSma切割前没有游离的磷酸基团，切割前没有游离的磷酸基团，SmaSma作用于两个核苷酸之作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的间的磷酸二酯键，切割产生的DNADNA片段末端是平末端，因而质粒经切割片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有后含有2 2个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。 (3)(3)据图据图1 1可知，可知，SmaSma切割的位点在抗生切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2 2可知可
9、知SmaSma切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用SmaSma切割。切割。 (4)(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。 (5)(5)基因表达载体的构建过程中需加基因表达载体的构建过程中需加DNADNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸
10、。连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。 (7)(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖而可在含有蔗糖( (唯一碳源唯一碳源) )的培养基中培
11、养。的培养基中培养。1.1.1.1.目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取2.2.2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建3.3.3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4.4.4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定二、基本步骤：二、基本步骤：二、基本步骤：二、基本步骤：考点归纳考点归纳1.1.目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取常用方法：常用方法：从基因文库获取目的基因从基因文库获取目的基因从基因文库获取目的基
12、因从基因文库获取目的基因 基因组文库（一种生物的基因组文库（一种生物的所有基因所有基因） 部分基因文库：如部分基因文库：如cDNA文库（文库（部分基因部分基因）利用利用利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因原理：生物体外原理：生物体外原理：生物体外原理：生物体外DNADNA双链复制的原理双链复制的原理双链复制的原理双链复制的原理通过通过通过通过DNADNA合成仪直接人工合成合成仪直接人工合成合成仪直接人工合成合成仪直接人工合成基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。基因
13、较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。 考点归纳考点归纳启动子启动子终止子终止子目的基因目的基因标记基因标记基因2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的：是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可目的：是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代以遗传给下一代(核心）核心）3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳
14、定和表达的过程（叫转化）。程（叫转化）。程（叫转化）。程（叫转化）。3.将目的基因导入受体细胞中的方法的比较将目的基因导入受体细胞中的方法的比较农杆菌转化法农杆菌转化法, ,基因基因枪法，花粉管通道法枪法，花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2Ca2处理法处理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导导入植物细胞入植物细胞整合到受整合到受体细胞的染色体体细胞的染色体DNADNA表达表达目的基因表达载体目的基因表达载体提纯提纯取卵取卵( (受精受精卵卵)显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育获得获得具有新性状的动物具
15、有新性状的动物Ca2Ca2处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNADNA分子分子4.目的基因的检测内容和方法的比较目的基因的检测内容和方法的比较目的基因是否插入目的基因是否插入受体细胞染色体的受体细胞染色体的DNA上上DNA分子杂交分子杂交技术技术(DNA和和DNA之间之间)是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNA核酸分子杂交核酸分子杂交技术技术(DNA和和mRNA之间之间)同上同上目的基因是否翻译目的基因是否翻译出蛋白质出蛋白质蛋白质分子杂交蛋白质分子杂交(抗原抗
16、原抗体之抗体之间间)同上同上包括抗虫或抗病的接种实验；基因工程产品与天然产品进包括抗虫或抗病的接种实验；基因工程产品与天然产品进行活性比较，以确定功能是否相同等行活性比较，以确定功能是否相同等3(20102010浙江理综，浙江理综，2 2)在用基因工程技术构建抗除草剂的在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是转基因烟草过程中，下列操作错误的是 () A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B用用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C将重组将重组DNA分子导入烟草原生质体分子导入烟草原
17、生质体 D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞解析：限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟解析：限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒的遗传物质是草花叶病毒的遗传物质是RNARNA，不能用限制性核酸内切酶切割，不能用限制性核酸内切酶切割，A A项错误；项错误；DNADNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，和载体，B B项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，是去除细胞壁的原生质体，C C项正确；项正确；目的基
18、因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，选转基因细胞，D D项正确。项正确。答案：答案：A A4(2010福建理综，福建理综，32节选节选)红细胞生成素红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红目前临床上使
19、用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如下图。，其简要生产流程如下图。请回答：请回答：(1)图中图中所指的是所指的是_技术。技术。(2)图中图中所指的物质是所指的物质是_，所指的所指的物质是物质是_。(4)检测检测rhEPO的体外活性需用抗的体外活性需用抗rhEPO的单的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的克隆抗体。分泌该单克隆抗体的_细细胞，可由胞，可由rhEPO免疫过的小鼠免疫过的小鼠B淋巴细胞与淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。小鼠骨髓瘤细胞融合而成。PCR mRNA rhEPO 杂交瘤杂交瘤 5(2010天津理综，天津理综，7节
20、选节选)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所直线所示为三种限制酶的酶切位点。示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：据图回答：(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。的培养基上进行。(2)能
21、使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是_(填字填字母代号母代号)。A启动子启动子 BtetR C复制原点复制原点 DampR(3)过程过程可采用的操作方法是可采用的操作方法是_(填字母代号填字母代号)。A农杆菌转化农杆菌转化 B大肠杆菌转化大肠杆菌转化C显微注射显微注射 D细胞融合细胞融合Hind和和BamH 氨苄青霉素氨苄青霉素 A C (6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号填字母代号)技术。技术。A核酸分子杂交核酸分子杂交 B基因序列分析基因序列分析C抗原抗原抗体杂交抗体杂
22、交 DPCRC 解析解析：(1)由图示可知：需用由图示可知：需用Hind和和BamH限制酶同时酶限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后tetR四环素抗性基因结四环素抗性基因结构被破坏而构被破坏而ampR结构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养结构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段特殊启动子是一段特殊的的DNA序列，是序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可调控基聚合酶识别和结合的位点，可调控基因的特异性表达。因的特异性表达。(3)过程过程表示把重组载体导入受体细胞表示把重组载体导入受体细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。(6)人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白，可用抗原物即人乳铁蛋白，可用抗原抗体杂交法检测该蛋白是否存抗体杂交法检测该蛋白是否存在。在。结束结束
