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1、.n我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。n致病菌：能够引起人类发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。 . 一、生物学特性一、生物学特性 是是一一大大群群在在血血清清学学上上相相关关的的革革兰兰氏氏阴阴性性杆杆菌菌，无无芽芽孢孢、无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。最最适适生生长长温温度度为为35 35 37 37 ，最最适适pHpH为为7.27.27.47.4，较较抗寒，抗寒，能耐受较高盐浓度能耐受较高盐浓度。第一节第一节 沙门氏菌沙门氏菌检验技术检验技术. 目前至少有目前至
2、少有6767种种O O抗原和抗原和25002500个以上血清型个以上血清型, , 根据其对宿主的致病性根据其对宿主的致病性, , 可分可分为三类为三类伤寒杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌副伤寒杆菌( (甲、乙、丙甲、乙、丙) )人人肠热症肠热症鼠伤寒杆菌鼠伤寒杆菌肠炎杆菌肠炎杆菌 猪霍乱杆菌猪霍乱杆菌儿童伤寒儿童伤寒人、动物人、动物急性胃肠炎急性胃肠炎猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌 败血症败血症沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella). 二、检验所需器材二、检验所需器材.三、检验程序三、检验程序.沙门氏菌检验程序沙门氏菌检验程序2010.
3、四、操作方法四、操作方法n分五个步骤：分五个步骤：1.前增菌前增菌n2.选择性增菌选择性增菌n3.选择性平板分离选择性平板分离 n4.生化实验生化实验n5.血清型分型鉴定血清型分型鉴定n .检测检测沙门氏菌沙门氏菌方法分方法分5个步骤：个步骤：1.1.前增菌：前增菌： 在含有营养的在含有营养的非选择性培养基非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。生理状态。 沙门氏菌检测中前增菌的目的是沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌使沙门氏菌恢复其活力。恢复其活力。 检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到
4、损伤而处于濒死状态。.2.选择性增菌选择性增菌n 在含在含选择性抑制剂选择性抑制剂的培养基中，样品进的培养基中，样品进一步增菌。一步增菌。n沙门沙门沙门氏菌检测中增菌的目的沙门氏菌检测中增菌的目的是是使使沙门氏沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率。门氏菌的检出率。.n3.选择性平板分离选择性平板分离n 划线接种于：划线接种于：nBS和和XLD琼脂平板或琼脂平板或HE琼脂平板各一个，于琼脂平板各一个，于36+1分别培养分别培养1824小时小时(XLD、HE)或或
5、4048小时小时(BS)。 n 这一步采用这一步采用固体固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。.亚硫酸亚硫酸铋琼脂铋琼脂(BS(BS琼脂琼脂) )上典型特征上典型特征.木糖赖氨酸脱氧胆盐（木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂上典型特征.HEHE琼脂琼脂上上典型特征.4.4.生物化学试验筛选生物化学试验筛选n 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。接种于三糖铁琼脂培养基中。 n 排除大多数非沙门氏菌。也提供了排除大多数非沙门氏菌。也
6、提供了沙门氏菌培养物菌属沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。的初步鉴定。.TSI(三糖铁三糖铁)培养基培养基大肠杆菌和沙门氏菌大肠杆菌和沙门氏菌.沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）.靛基质对照管对照管 阴性阴性() 阳性阳性().P150（1）A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶酸脱羧酶3项中有项中有1项异常，按表项异常，按表可判定为沙门氏菌属可判定为沙门氏菌属。如有。如有2项项异常，为非沙门氏菌属。异常，为非沙门氏菌属。（2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛
7、基质阳性变体：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果结合血清学鉴定结果进行判定。进行判定。（3）A3：补做：补做ONPG。ONPG阴性阴性为沙门氏菌，同时为沙门氏菌，同时赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶羧酶阳性，阳性，甲型副伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。为赖氨酸脱羧酶阴性。（4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。.醇发酵试验.阳性（黄）阳性（黄） 阴性阴性邻硝基酚邻硝基酚半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPG试验）试验） .5.5.血清学分型鉴定血清学分型鉴定 提供培养物
8、菌种的鉴定。提供培养物菌种的鉴定。 用分离出的沙门氏菌与已知用分离出的沙门氏菌与已知A-FA-F多价多价O O血清及血清及H H因子进行玻片凝集试验。因子进行玻片凝集试验。1 1）抗原的准备抗原的准备2 2）O O抗原的鉴定抗原的鉴定 用用AFAF多价多价O O血清做玻片凝集试验，以生理血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。盐水做对照。3 3）H H抗原的鉴定抗原的鉴定 4 4）ViVi抗原的鉴定抗原的鉴定 . 第二节 金黄色葡萄球菌检验技术 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌.近年来，美国疾病控制中心报告，近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，由金黄色葡萄球菌引起的感染
9、占第二位，仅次于大肠杆菌。仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占，加拿大则更多，占45%，我国每年，我国每年发生的此类中毒事件也非常多发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学. 金黄色葡萄球葡萄球菌 表皮葡萄球菌属属分类：分类： 腐生葡萄球菌 金黄色金黄色葡萄球菌食物中毒系葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于进食含毒素型食物中毒。是由于进食含有一种
10、或多种含葡萄球菌肠毒素有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起。常见的菌为的食物所引起。常见的菌为金黄金黄色葡萄球菌色葡萄球菌。.一、生物学特性n 革革兰兰氏氏阳阳性性需需氧氧或或兼兼性性厌厌氧氧菌菌，为为球球菌菌，排排列列成成葡葡萄萄状状，无无芽芽孢孢、鞭鞭毛毛，不不运运动动；大大多多数数无无荚膜。荚膜。n 最最适适生生长长温温度度3737，最最适适pHpH为为 7.47.4， 对对 热热 抵抵 抗抗 力力 较较 强强 ，8030min8030min才能被杀死。才能被杀死。n 可可在在10%-10%-15%15%氯氯化化钠钠和和40%40%胆胆汁中生长汁中生长.生物学特性生物学特性-培养特征
11、培养特征大多数菌株产生类大多数菌株产生类胡萝卜胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化可能也有变化 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，基红反应阳性，VP反应弱阳性。反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。明胶。具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素
12、等高度敏感。素、红霉素等高度敏感。.致病性 金黄色葡萄球菌是人金黄色葡萄球菌是人类类化脓感染化脓感染中最常见的病中最常见的病原菌，临床表现多种多样，原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、可引起肺炎、胃胃肠炎、心肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。毒症等全身感染。 .致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死
13、；起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；葡萄球菌；e.e.肠毒素：产生数种引起急性
14、胃肠炎的蛋白质性肠毒素，肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有有A、B、C1C3、D、E、G、H共共9种。肠毒素种。肠毒素A是最常见的。是最常见的。 金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性.葡萄球菌皮肤感染.二、检验所需培养基n10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤 n7.5 %氯化钠肉汤氯化钠肉汤n血琼脂平板血琼脂平板nBaird-Parker 琼脂平板琼脂平板n脑心浸出液肉汤脑心浸出液肉汤(BHI) n兔血浆兔血浆n磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液n营养琼脂小斜面营养琼脂小斜面n革兰氏染色液革兰氏染色液n无菌生理盐水无菌生
15、理盐水 .三、检验程序nGB 4789.10-2010标准标准n第一法第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；n第二法第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；色葡萄球菌的计数；n第三法第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。.第一法第一法.检样检样25g样品样品+ 225ml 7.5%NaCl肉汤或肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤血平板血平板36124hr镜
16、镜检检营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验报告结果报告结果定性定性检测检测36124hr36124hr3616hrBP平板平板第一法第一法. 第二法第二法 Baird-Parker平板法检验程序平板法检验程序 定量检测定量检测定量检测定量检测（平板法）（平板法）（平板法）（平板法）适适用用于于检检测测金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌数数不不小小于于10/g（mL）的食品）的食品.25g样品样品+225ml生理盐水生理盐水选三个连续梯度，每个梯度各取选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入加入3管胰酪胨大豆肉汤管胰酪胨大豆肉汤36145-48hrBP平板平板血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验查查MP
17、N表表定量定量检测检测（MPNMPN法）法）法）法）36145-48h 报告结果报告结果 适用于检测可能含适用于检测可能含有有少量少量金黄色葡萄金黄色葡萄球菌，却带有球菌，却带有大量大量竞争菌竞争菌的样品的样品梯度稀释梯度稀释第三法第三法 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPN检验程序检验程序 .金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测测定方法测定方法国标方法注意事项国标方法注意事项现象观察：染色镜检（形态、现象观察：染色镜检（形态、染色染色） 表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。 Baird-Parker琼琼脂脂平平板板（BP平平板板）
18、 、血血平平板板 、血血浆浆凝凝固固酶试验酶试验 多多数数产产肠肠毒毒素素的的菌菌株株在在血血琼琼脂脂平平板板上上能能形形成成溶溶血血圈圈，并并能能产产生血浆凝固酶生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。重要指标。.四、操作方法1.增菌培养法（1）检样处理检样处理 将将25g（mL）检样加于检样加于225mL灭菌生灭菌生理盐水中理盐水中的灭菌器内，制成的灭菌器内，制成1：10检样混悬液。检样混悬液。（2）增菌增菌培养培养 吸取液体检样吸取液体检样5ml，接种于，接种于50mL75氯化钠肉汤氯化钠肉汤50ml进行增菌进行增菌。（3）分离培养分离培
19、养 将上述培养物，分别划线接种到将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板平板和血平板。血平板血平板 36 1 培养培养 18 h24 h。 Baird-Parker 平板平板 36 1 培养培养 18 h24 h 或或 45 h48 h。 .（4）观察菌落形态）观察菌落形态 Baird-Parker 平板平板、血平板上挑取血平板上挑取可疑可疑菌落菌落。 金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径平板上，菌落直径为为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈
20、。用接种针接触菌落围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。菌落；但无混浊带及透明圈。 在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。.B-P平板.BairdParker(BP培养基培养基/贝尔德帕克平板贝尔德帕克平板) 用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。￥7（9
21、0mm).血平板血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其血平板上其典型菌落典型菌落呈金黄色，有时也为呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。滑，有溶血圈。.血平板血平板.（5）革兰氏染色镜检革兰氏染色镜检 （6）血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 挑取挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别个或以上，分别接种到接种到 5 mL BHI 和营养琼脂斜面，和营养琼脂斜面，36 1 培养
22、培养 18 h24 h。 取取新鲜配置兔血浆新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入，放入小试管中，再加入 BHI 培养物培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小时温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。
23、 也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培培养养 18 h48 h，重复试验。，重复试验。.检测步骤-鉴定 金黄色葡萄球菌可以产生金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶凝固酶，因此对其，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。鉴别的主要实验是测定其凝固酶。 对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步实验来进一步确认确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实
24、验、耐热核酸酶实验等。葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。.血浆凝固酶试验：吸取吸取1:4新鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，放入小试管中，再加入培养再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物养物0.5mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置361温箱或水浴温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现，如呈现凝块凝块,即将试管倒置或即将试管倒置或倾斜时，呈现凝块者，被认为阳倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉
25、性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。汤作为对照。.【方法】【方法】（1）玻片法）玻片法 （2）试管法）试管法【结果判断】【结果判断】（1）玻片法：）玻片法：510s内出现凝集者为阳性。内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。观察。【应用】【应用】本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。.一、动物学试验主要用幼猫和猴。一、动物学试验主要用幼猫和猴。二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以
26、和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素方法主要有：方法主要有：1.免疫琼脂扩散法免疫琼脂扩散法2.反向间接血凝试验反向间接血凝试验3.免疫荧光法免疫荧光法4.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法金黄色葡萄球菌肠毒素的检测金黄色葡萄球菌肠毒素的检测.对分型进行简单的了解。对分型进行简单的了解。、血清学分型：、血清学分型：金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。多糖抗原。蛋白抗原主要为葡萄球菌蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（蛋白（
27、SPA)，是一种表面抗，是一种表面抗原，原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。多糖抗原为半抗原，有型特异性。、噬菌体分型。、噬菌体分型。、根据肠毒素分型。、根据肠毒素分型。、根据血浆凝固酶分型。、根据血浆凝固酶分型。金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型.第三节第三节 志贺氏菌检验技术志贺氏菌检验技术 志贺氏菌属志贺氏菌属（shigella）是人类细菌性痢疾最）是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。 通常志贺氏杆通常志贺氏杆菌菌(Bacillus，shig
28、ae)仅指仅指I型痢疾志贺氏菌。型痢疾志贺氏菌。 志贺氏杆菌是日本志贺诘在志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离年首次分离得到的，因此而得名。得到的，因此而得名。.n 本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般般5656- -6060经经1010分钟即被杀死。在分钟即被杀死。在3737水中存活水中存活2020天，在冰块中存活天，在冰块中存活9696天，蝇肠内可存活天，蝇肠内可存活9 9-
29、-1010天，天，对化学消毒剂敏感，对化学消毒剂敏感，1%1%石碳酸石碳酸1515- -3030分钟死亡。分钟死亡。n .一、生物学特性一、生物学特性n 1 1形态特性形态特性 n 本属细菌为两侧本属细菌为两侧平行、末端钝圆的平行、末端钝圆的革兰革兰氏阴性杆菌氏阴性杆菌短杆菌。短杆菌。无无芽胞，无荚膜，无鞭毛。芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。多数有菌毛。n 与肠杆菌科各属细与肠杆菌科各属细菌的菌的主要区别为不运动。主要区别为不运动。 .2培养特性培养特性n1)需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。n2)对营养要求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。对营养要
30、求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。n3)在在10-40范围内可生长。最适温度为范围内可生长。最适温度为37左右。最适左右。最适pH值为值为7.2。 n4）在固体培养基上，培养）在固体培养基上，培养18-24小时后小时后，形成圆形成圆形、隆起、透明，直径形、隆起、透明，直径2-3mm、表面光滑、湿润、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落。边缘整齐的菌落。 .3生化特性生化特性n注：阳性；阴性；/多数阴性，少数阳性；（）迟缓阳性；d有不同生化型。福氏志贺氏6型生化特性与A群和C群相似。.4血清学特性血清学特性n 利用利用O O抗原的复杂性可将志贺氏菌分成抗原的复杂性可将志贺氏菌分成A A、B B、C
31、C、D D四群，每一群又可利用四群，每一群又可利用O O抗原进行分型。抗原进行分型。志贺氏菌志贺氏菌四个亚群各具有不同的抗原构造，都是由菌体抗原四个亚群各具有不同的抗原构造，都是由菌体抗原(O)(O)及表面抗原及表面抗原(K)(K)所组成。所组成。n .二、检验所需器材二、检验所需器材.n 检样检样 n25 g（或（或25 mL）样品）样品+志贺氏菌增菌肉汤志贺氏菌增菌肉汤225 mL n 41.5 ， n 16 h20 h厌氧培养厌氧培养 n XLD MAC或志贺氏菌显色培养基或志贺氏菌显色培养基n 36 ，20 h48 h n 挑取可疑菌落挑取可疑菌落n n TSI，半固体，营养琼脂斜面，
32、半固体，营养琼脂斜面 n n 血清学分型血清学分型 生化鉴定生化鉴定 n n 志贺氏菌属分群及分型结果志贺氏菌属分群及分型结果 n 报告报告 三、检验程序三、检验程序GB4789.5-2012.四、操作方法四、操作方法n 1.1.增菌增菌2.2.分离分离3.3.初步生化试验初步生化试验 4.4.生化试验及附加生化试验生化试验及附加生化试验 5.5.血清学鉴定血清学鉴定 .1.增菌增菌 n 以无菌操作取检样以无菌操作取检样25 g25 g（mLmL），加入装有），加入装有灭菌灭菌225 mL225 mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以转刀片式均质器以8
33、000r/min8000r/min- -10000r/min10000r/min均质；均质；均质袋用拍击式均质器连续均质均质袋用拍击式均质器连续均质1 min1 min- -2 min2 min，液体样品振荡混匀即可。于，液体样品振荡混匀即可。于41.5 41.5 ，厌氧培养，厌氧培养16h16h- -20h20h。 .2.分离分离 n 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于于XLDXLD琼脂平板和琼脂平板和MACMAC琼脂平板或志贺氏菌显琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于色培养基平板上，于36 36 1培养培养20h20h- -24h24h，观察各个平板上
34、生长的菌落形态。宋，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至观察，则继续培养至48 h48 h再进行观察。再进行观察。 .志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板选择性琼脂平板 志贺氏菌的菌落特征志贺氏菌的菌落特征 MAC琼脂琼脂 无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 XLD琼脂琼脂 粉红色至无色，半透明
35、、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 . 3.3.初步生化试验初步生化试验 n 挑取平板上的可疑菌落；接种三糖挑取平板上的可疑菌落；接种三糖铁和营养琼脂斜面和半固体培养基各铁和营养琼脂斜面和半固体培养基各1 1管。管。志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层产酸、不产气，斜面产碱，不产产酸、不产气，斜面产碱，不产H H2 2S S。无。无动力，固体管内沿穿刺线生长。动力，固体管内沿穿刺线生长。 .4.生化试验n -半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。n 必要时还需加做靛基质、甘
36、露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验。n 生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。n 表2 志贺氏菌属四个群.5.5.血清学试验血清学试验 n 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查。nP166 n表6-8 福氏志贺氏菌各型和亚型抗原和群抗原n表6-9 志贺氏菌属四个群的生化特征.第四节第四节 肉毒梭肉毒梭状芽孢杆状芽孢杆菌菌检验技术检验技术.一、生物学特性一、生物学特性l1.1.肉毒梭菌肉毒梭菌n 肉毒梭菌属于肉毒梭菌属于厌氧性厌氧性梭状芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，形成芽孢，形成芽孢，比菌体宽，呈梭状
37、，比菌体宽，呈梭状，为革兰氏阳性粗大杆菌，两端钝为革兰氏阳性粗大杆菌，两端钝圆，无荚膜，周身有圆，无荚膜，周身有4 48 8根鞭毛，能运动。根鞭毛，能运动。282837 37 生长良好，最适生长良好，最适pH6pH68 8，当，当pHpH值低于值低于4.54.5或大于或大于9.09.0时，或当环境温度低于时，或当环境温度低于15 15 或高于或高于55 55 时，时，肉毒肉毒梭菌芽孢不能繁殖，也不产生毒素。梭菌芽孢不能繁殖，也不产生毒素。.n肉毒梭菌加热肉毒梭菌加热8080，30min30min或或100 100 10min10min即可杀死。即可杀死。但其芽孢抵抗力强，煮沸后要但其芽孢抵抗力
38、强，煮沸后要6h6h，1052h1052h，11036min11036min，12041204- -5min5min才能才能将其杀死。将其杀死。.n 肉毒梭菌生命力很强，并广泛存在于自然界，肉毒梭菌生命力很强，并广泛存在于自然界，特别是土壤中，易污染食品，于适宜条件下可在特别是土壤中，易污染食品，于适宜条件下可在食品中产生剧烈的肉神经毒素（又称食品中产生剧烈的肉神经毒素（又称肉毒毒素肉毒毒素），），能引起以能引起以神经麻痹神经麻痹为主要症状且为主要症状且死亡率极高死亡率极高的食的食物中毒。物中毒。.n 肉毒素是目前所知的最强烈的细菌外毒素。故肉肉毒素是目前所知的最强烈的细菌外毒素。故肉毒梭菌的
39、毒梭菌的检验目标主要是其毒素检验目标主要是其毒素。均以毒素的检测及。均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。定型试验为判定的主要依据。n 引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。食品等。n 在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，中国主要以发酵食品最多，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱中国主要以发酵食品最多，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱等。等。.中毒时症状及中毒时症状及来来源源：症状：症状： 最最初初为为头头晕晕、无无力力、随随即即出出现现眼眼肌肌痉痉挛挛，继继之之张口、伸舌困难，最后出现呼吸肌麻痹等。张
40、口、伸舌困难，最后出现呼吸肌麻痹等。来来源源： 带带菌菌土土壤壤、尘尘埃埃及及粪粪便便。尤尤其其是是带带菌菌土土壤壤污污染染多种食品原料。多种食品原料。.二、检验所需器材.三、检验程序lP171图6-5l毒素检测.第五节第五节 常见产毒霉菌的鉴定技术常见产毒霉菌的鉴定技术. 主要霉菌毒素主要霉菌毒素黄曲霉毒素黄曲霉毒素黄变米毒素黄变米毒素镰刀菌毒素镰刀菌毒素杂色曲霉毒素杂色曲霉毒素棕曲霉毒素棕曲霉毒素展青霉毒素展青霉毒素青霉酸青霉酸交链孢霉毒素交链孢霉毒素.思考题思考题n1 1. .我国卫生部颁布的食品微生物指标有我国卫生部颁布的食品微生物指标有 、 和和 三项。三项。n2.2. 食品微生物致
41、病菌的具体含义是什么？食品微生物致病菌的具体含义是什么？n3.3.沙门氏菌检测中前增菌的目的是沙门氏菌检测中前增菌的目的是 。n4.4.沙门氏菌检测中增菌的目的是沙门氏菌检测中增菌的目的是 。n5.5.检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为 。n6.6.多数产肠毒素的菌株在多数产肠毒素的菌株在 ，并能，并能 ，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。n7.7.志贺氏菌志贺氏菌 可分成可分成A A、B B、C C、D D四群。四群。n8.肉毒梭菌的检验目标主要是肉毒梭菌的检验目标主要是 。.n5、乳糖初发酵试验通常在（）检测中用到。nA乳酸菌B.酵母菌C.细菌总数D.大肠杆菌.n3、活菌计数法检测细菌总数应选择平均菌落数在（）的稀释度，乘以稀释倍数报告之。nA1020之间B.200500之间C.30300之间D.510之间n10、菌落总数检验中若有两个以上稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，如何报告？.
