《生物化学教学ppt课件》第十一章-核酸的生物合成--演示文稿x

《《生物化学教学ppt课件》第十一章-核酸的生物合成--演示文稿x》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《生物化学教学ppt课件》第十一章-核酸的生物合成--演示文稿x（160页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 第 十 章核 酸 的 生 物 合 成第一节 DNA的生物合成 一 DNA的半保留复制 1953年，Watson与Crick共同提出了DNA双螺旋模型，并就其复制过程进行了推测： DNA在其复制过程中，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开； 每条单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，它们保持了原DNA链上的碱基顺序。 因此，DNA的复制过程就是一个半保留复制的过程。 1958年，Meselson与Stahl利用N的同位素标记，首先证明了DNA的复制过程的确就是一个半保留复制的过程。 他们先使大肠杆菌长期在以15NH4CL为唯一氮源的培养基中生长，使其DNA全部变成

2、15NDNA。然后再将细菌转入普通培养基（含14NH4CL）中，并将各代的细菌DNA抽提出来进行氯化铯密度梯度离心。半保留复制 在DNA的复制过程中，在酶的催化作用下，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开； 按照碱基配对原则，以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物，每条DNA单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，新的DNA双链保持了原DNA链上的碱基顺序。参考DNADNA复制复制（ replicationreplication） DNADNA复复制制是是指指以以亲亲代代DNADNA分分子子的的双双链链为为模模板板，按按照照碱碱基基配配对对的的原原则则，合合成成出出与与亲亲

3、代代DNADNA分分子子相相同同的的两两个个双双链链DNADNA分分子子的过程。的过程。1半保留复制是双链DNA复制的普遍形式；2即使是单链DNA分子，其复制过程中也要先形成双链的复制型（RF）;3要求原DNA双链解开，每一单链为模板，依碱基配对原则，合成另一条互补链。关于“模板”的定义 模板：能提供合成一条互补链所需精确信息的核酸链。 有学者提出，模板的定义宜为“用于合成（另）一种大分子所用的大分子模型”； 也有学者提出，模板的定义宜为“能提能提供合成（另）一种大分子所需精确信息的供合成（另）一种大分子所需精确信息的大分子模型大分子模型”；4复制、转录及逆转录，在形成双螺旋分子时均需碱基配对

4、；5碱基、核苷、核苷酸单体之间不形成碱基对，而只是在双螺旋时因空间关系而形成。6 DNA半保留复制机制可说明DNA在代谢上的稳定性。 经许多代复制后，DNA的多核苷酸链仍保持完整，并于后代不被分解。 DNA较细胞的其它成份要稳定得多。二复制的单位 （一）复制子 1复制子 复制子指基因组中能够独立进行复制的单位。 每个复制子都含有控制复制的起点，可能还有终止复制的终点。 复制过程是在起始阶段受到控制的。 一旦复制开始，即进行下去，直到整个复制子完成复制。2复制叉 复制时复制时DNA双链在起点处会形成叉双链在起点处会形成叉子样的结构子样的结构，此即复制叉，此即复制叉。 随复制叉的移动，完成DNA的

5、复制过程。 因此，复制叉也被认为是DNA复制的“生长点”。 由于DNA复制时会形成复制叉，导致DNA双链在其解链区域看起来象一个泡状结构或象一只眼睛，故有时又将此泡状结构称作“复制泡”或“复制眼”。3原核生物染色体DNA只有一个复制子 原核生物染色体DNA在其复制时，一般是头一次复制尚未结束，就又在新生链的复制子的起点开始新一轮复制。 E.coli的DNA复制一次需40min。 但在迅速生长的原核生物中，第一次复制尚未完成，第二次复制就在同一个始点上开始，从而，使原核生物可以用更快的速度繁殖。就单个的复制叉的移动速度而言，就单个的复制叉的移动速度而言，原核生物的较真核生物的移动要快原核生物的较

6、真核生物的移动要快 但由于原核生物染色体原核生物染色体DNA只有一个复制子，只有一个复制子，而真核生物染色体而真核生物染色体DNA却有多个复制子却有多个复制子， 因此真核生物染色体真核生物染色体DNA复制的总速度反而比复制的总速度反而比原核生物染色体原核生物染色体DNA复制的总速度要快复制的总速度要快。 在真核生物染色体的不同位置上有多个复制起点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有20003000个复制起点。 从这些起始点开始向相反方向复制，就形从这些起始点开始向相反方向复制，就形成多个复制泡。成多个复制泡。 这一状况已用电子显微镜观察得到证实。 4复制子的大小并非绝对不变，这因生

7、物种类而异，也与生长条件、染色体结构等因素有关，且同一DNA分子上不同复制子的大小不均一。（二）复制的方向 复制的方向可以朝一个或两个方向进行。这是由在复制的起点形成的复制叉的个数决定的： 如果形成一个复制叉，则复制的方向是一个，这时的复制也就是所谓的“单向复制”； 如果形成二个复制叉，则复制的方向是二个，这时的复制也就是所谓的“双向复制”。 复制的多模式复制的多模式 单起点、单方向单起点、单方向多起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向单起点、双方向多起点、双方向多起点、双方向 原核生物的染色体与质粒DNA、真核生物的细胞器DNA均为环状的双链分子，它们都在一个固定的起点开始复制，大多数为双

8、向的。 复制一般是对称的，即两条链同时开始复复制一般是对称的，即两条链同时开始复制。制。 但是，有些则否，即一条链复制后再进行另一条链的复制。三 原核生物DNA的复制（DNA 指导下的DNA合成）（一）DNA的聚合反应 1956年，Kornberg首先从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，此后在不同的生物中都找到了DNA聚合酶。1. DNA的聚合反应的条件 （1） DNA模板； （2） 底物dNTP(N=A,G,C,T)； （3） DNA聚合酶及其活性所需要的Mg2+；酶的活性部位紧密结合Zn2+； （4）与模板DNA互补的一小段多聚核苷酸引物，要露出其3-OH。 引物一般为引物一般为RNA。但是少

9、数情况是DNA或tRNA。2. 聚合反应 n1dATP+n2dGTP+n3dCTP+n4dTTP+DNA（模板） DNA-(n1dAMP-n2dGMP-n3dCMP-n4dTMP)+(n1+n2+n3+n4)PPi3 聚合反应的机理 引物上的3-OH对进入的底物dNTP(N=A,G,C,T)上的 -P进行亲核攻击，形成3，5-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。 所需能量来自 -与 -磷酸基之间的高能键的断裂。 而进入的底物dNTP上的碱基要与模板上相应的碱基配对则是DNA聚合酶催化反应进行的前提。4 聚合反应的特点 （1） 只能以dNTP(N=A,G,C,T)为底物，而不能是dNDP或dNMP(N=A

10、、G、C、T)； （2） 要有模板的指导，并遵守碱基配对原则； （3） 要有引物及其上的3-OH存在； DNA聚合酶只能催化dNTP加到引物上的3-OH上，而不能使dNTP自身发生聚合。 （4） DNA 链的生长方向为53。 （5） 产物的性质与模板的相同。 以不同来源的DNA为模板，同样引起和促进新的DNA的酶促合成。 产物产物DNA的性质的性质完全不取决于完全不取决于DNA聚合聚合酶的来源，也与四种脱氧核苷酸的比例无关，酶的来源，也与四种脱氧核苷酸的比例无关，而而仅仅取决于仅仅取决于DNA模板模板。 产物DNA与模板双螺旋DNA具有相同的碱基组成，也就是说DNA聚合酶能使两条模板DNA链都

11、进行复制。（二）DNA聚合酶 1 DNA聚合酶 I 大肠杆菌中共有三种DNA聚合酶，这是由Kornberg首先从大肠杆菌中提取的，也是人类发现的第一个DNA聚合酶，也叫Kornberg酶。 （1） 只有一条多肽链，分子量为109，000，活性部位含有Zn；The search for an enzyme that could synthesize DNA began in 1955. Work by Arthur Kornberg and colleagues led to the purification and characterization of DNA polymerase from

12、 E. coli cells, a single-polypeptide enzyme now called DNA polymerase I (Mr 103,000; encoded by the polA gene). Much later, investigators found that E. coli contains at least four other distinct DNA polymerases. （2） 是多功能酶，主要具有以下功能。 a 53聚合酶活性 催化DNA 链的合成延长。 与其它DNA聚合酶一样，只能催化DNA链的延长，而不能启动DNA链的合成。b 35核酸外

13、切酶活性 此即从3端向5端水解DNA 链的活性。 当酶与模板结合时酶与模板结合时会引起酶构会引起酶构象的变化象的变化，使酶能够正确识别进入的底物核苷酸与模板核苷酸之间的碱基配对与否。 一旦在合成过程中有错误的核苷酸掺有错误的核苷酸掺入入而不能与模板链上的碱基配对而不能与模板链上的碱基配对时，此酶便可用其用其35核酸外切酶活性核酸外切酶活性将错误的核苷酸切除而保证正确合成DNA链。 因此，该功能也被认为是“校正功能”。该酶的该酶的35外切酶活性只对单链而不是外切酶活性只对单链而不是双链的双链的3-端起作用端起作用 在正常的聚合条件下，该活性受到抑制，而当碱基配对出现错误时，该酶的聚合反应停止，而

14、35核酸外切酶活性出现并切除错配的碱基，然后此外切酶活性停止而恢复酶的聚合酶活性以继续合成DNA链。 可见，在DNA复制的时候，碱基配对受到双重的核对： 聚合酶对碱基的选择作用聚合酶对碱基的选择作用和和35核酸核酸外切酶活性对错配碱基的校正作用外切酶活性对错配碱基的校正作用。c. 53核酸外切酶活性从5端向3端水解DNA 链而得到核苷酸或寡核苷酸 它只作用于双链DNA中的单链。有时还可有时还可以跳过几个核苷酸起作用以跳过几个核苷酸起作用，如切除紫外照射引起的嘧啶二聚体。 该酶一般在切除引物或修复DNA损伤时起作用。它也被称为修复酶。 有学者提出该酶在DNA成熟过程中起作用。d. 将DNA聚合酶

15、 I 用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶有限水解 可以得到分子量分别为75，000和36，000的两个片段。 大片段具有聚合酶活性与35核酸外切酶活性； 小片段则具有53核酸外切酶活性。Protease cleavage DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.2.DNA聚合酶 II只有一条多肽链，分子量120，000 有有53聚合酶活性和

16、聚合酶活性和35外切酶活性外切酶活性（即具有校正功能）（即具有校正功能），但无无53外切酶活性外切酶活性。 该酶催化合成DNA的特点与DNA聚合酶I基本相同。需要Mg2+、NH4+的激活。如果要使其催化DNA合成的速度达到最大，则需要有缺口的双链DNA为模板-引物，且此缺口需约长达50-200bp（似应为核苷酸？）。此缺口不能过大，否则酶活性会下降。 该酶也不是复制酶，而是修复酶。3. DNA聚合酶 III 目前认为它是大肠杆菌细胞中真正负责催化DNA 链的合成延长的酶。具有多个亚基。是多功能酶。 有有55 33聚合酶活性；有聚合酶活性；有33 55外切酶外切酶活性（即具有校正功能）活性（即具

17、有校正功能）；无无55 33外切酶外切酶活性活性。 它与DNA聚合酶 II 都最适宜作用于带有小片段缺口（小于100bp）的双链DNA，而DNA聚合酶I则最适宜作用在具有大段单链区的双链DNA乃至于带有很短引物的单链DNA。原核生物原核生物DNA-pol DNA-pol DNA-pol 功功能能5 3 聚合活性聚合活性+3 5 外切酶活性外切酶活性+5 3 外切酶活性外切酶活性+-分子量分子量109 000120 000140 000每个菌体中所含每个菌体中所含的酶分子数的酶分子数4004020聚合速率聚合速率（核苷酸数（核苷酸数/分分/酶）酶）100060 000 滞后链合成的模板形成环，复

18、制叉上的二聚滞后链合成的模板形成环，复制叉上的二聚体体DNA聚合酶聚合酶全酶同时合成两条子链。全酶同时合成两条子链。（三）DNA连接酶 DNA聚合酶只能催化DNA链的合成延长，并不能催化DNA 链之间的连接 催化连接两条DNA 链的功能由DNA连接酶来行使。 I. E（哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌）+ATP =E-AMP +PPi E （大肠杆菌）+ NAD+ = E-AMP + NMNII.E-AMP + 3ATGT5 5TA-OH P-CA 3AT-GT5= 5TA-OH AMP-P-CA3 III. 3AT GT5 5TA-OH AMP-P-CA3 =3A-T-G-T5 5T-A-C-

19、A3 DNA连接酶催化DNA双链之切口处的5-磷酸基与3-羟基之间形成3，5-磷酸二酯键。 对切口处的核苷酸残基是什么碱基组成DNA连接酶并无要求， 而只要求切口处的只要求切口处的5-磷酸基与磷酸基与3-羟基应羟基应当位于相邻位置当位于相邻位置。 在反应中要消耗能量，在大肠杆菌中由在反应中要消耗能量，在大肠杆菌中由NAD+提供，提供，而哺乳动物与噬菌体感染的大肠而哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌中则由杆菌中则由ATP提供提供。 DNA连接酶不能连接游离的两条连接酶不能连接游离的两条DNA。 T4 DNA连接酶则可以作用于上述切口处，而且可以连接无单链粘性末端的平头双链DNA，但是不能连接游离的单

20、链DNA。（四）DNA的半不连续复制 1. 半不连续复制和冈崎片段 （1）半不连续复制 DNA 双链在其复制过程中，所产生的两条子代DNA 双链里，有一条的互补链是按53方向（与复制叉的移动方向相同）连续合成的。 此为前导链（又叫先导链）前导链（又叫先导链）； 而另一条的互补链是按53方向（与复制叉的移动方向相反）不连续合成的，即先合成若干短片段，再经酶的作用将这些短片段连起来而形成大片段直到形成完整的互补链。 此为滞后链（或随后链）滞后链（或随后链）。 由于产生的两条子代DNA 双链中的互补链的合成过程从总的来看是一条连续而一条不连续，因此DNA 的复制过程也是一个半不连续复制的过程。 这种

21、现象究其原因在于DNA聚合酶只能催化合成53DNA新链，而不能催化合成35DNA新链。（2） 冈崎片段 1968年，冈崎发现DNA 复制时首先合成的是小片段DNA，接着才出现较大的DNA片段，证明DNA 的复制过程是一个半不连续复制的过程。 因此，将DNA 复制时首先合成的小片段命名为冈崎片段。2 冈崎片段和引物RNA合成 冈崎片段的合成不仅需要dNTP(N=A,G,C,T)等底物，还需要一个与模板DNA碱基顺序互补的短片段引物RNA。 （1） 引物RNA的合成 a. 引发：引物RNA的合成过程。 b. 引发体：引物RNA的合成系统。 c. 引物酶（引物合成酶）：催化合成引物RNA的酶。为一单

22、链，是引发体的成分之一，只在其中起作用。 d. 冈崎片段合成时，引发体沿滞后链的模板移动，与复制叉的移动方向一致，而与冈崎片段合成的方向相反。 移动到一定位置上即可引发引物RNA的合成。 移动和引发均需由ATP供给能量。 e. 引物RNA以5-三磷酸结尾。 f. 冈崎片段的合成不需特异的起始部位，因为冈崎片段只具有暂时的功能。 在复制后期，冈崎片段将连接成DNA大分子。 （2） 冈崎片段和滞后链的形成 引发体引发体沿模板朝复制叉的移动方向移动，断断续续地引发滞后链的引物RNA的合成。 DNA聚合酶聚合酶 III在引物的3-OH端逐个加上与模板碱基配对的脱氧核苷酸以合成冈崎片段。 再以DNA聚合

23、酶聚合酶 I 的53核酸外切核酸外切酶活性酶活性逐个清除引物RNA上的核苷酸单位（也有学者提出由RNase H来行使此功能），并立即以前面的冈崎片段为引物，由DNA聚合酶聚合酶 I 的53聚合酶活性聚合酶活性补上与模板碱基配对的脱氧核苷酸单位; 最后，由DNA连接酶连接酶连接切口而形成完整的互补链。 DNA双链形成双螺旋不需要能量（？）3 DNA 双链的分离 （1） DNA解链酶（DNA解螺旋酶） 该酶在复制叉的前方解开DNA 双链一小段。 每解开一个碱基对，要消耗两个ATP， 即使2ATP2ADP+2Pi （2） 单链结合蛋白（SSB） 它与解开螺旋的DNA 单链结合，可以稳定解开的DNA

24、单链，并防止复性，保护DNA 单链部分不被核酸酶降解。 它主要结合在A-T碱基对较密集的部位。 有学者提出，SSB能降低天然DNA的熔解温度，促进DNA解链。 原核生物的单链结合蛋白与DNA 单链的结合有正协同效应，即当第一个单链结合蛋白与DNA 单链结合后，后续的单链结合蛋白与DNA 单链的结合则越加容易。而真核生物的则否。（3）DNA旋转酶（Gyrase） 又称DNA拓朴异构酶2（Type II topoisomerase），由两个A亚基（105，000）和两个B亚基（95，000）组成。 它兼有内切酶和连接酶活力，能迅速使DNA链断开又接上。 当ATPADP+Pi供能时，该酶使松驰态的D

25、NA转变为超螺旋态。 无ATP时，又可使超螺旋态DNA转变为松驰态。可协助解链酶使DNA模板解旋。（4）DNA复制体（Replisome） 在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，在DNA链上形成离散的复合物，彼此配合，进行高度精确的DNA复制。这一结构即为DNA复制体。 DNA复制体只是与复制叉DNA特殊结构相结合的蛋白质复合物。 DNA聚合酶、解链酶、旋转酶、引发体等均为其组成成份。 （5）复制的终止不需特定信号，也不需特殊的蛋白质参与。关于关于 复复 制制 的的 终终 止（参考）止（参考）大肠杆菌为环形大肠杆菌为环形DNADNA。复制叉遇到多重拷贝复制叉

26、遇到多重拷贝TerTer（20bp20bp）后，）后，TusTus与与TerTer结合，复制叉停止前进。结合，复制叉停止前进。两个复制叉间的几百个两个复制叉间的几百个DNADNA以一种未知的机以一种未知的机制复制。制复制。由拓扑异构酶由拓扑异构酶将连环体分开。将连环体分开。四 真核生物DNA的合成 由于真核生物的情况比较复杂，因此总的研究不如原核生物的详细。 （一） DNA聚合酶 现已发现了几种，都需要以dNTP(N=A,G,C,T)为底物，需Mg 2+激活，也需要模板和具有3-OH的引物链，DNA 链的生长方向也为53。 在DNA聚合酶、中，只有DNA聚合酶有35核酸外切酶活性，此外就绝无其

27、它外切酶活性。真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-DNA-polpol 延长后随链延长后随链DNA-DNA-polpol 可能是可能是DNADNA修复修复酶酶DNA-DNA-polpol 参与参与线粒体线粒体DNADNA复制复制DNA-DNA-polpol 延长前导链延长前导链DNA-DNA-polpol 校读、修复、填补缺口校读、修复、填补缺口真核生物中真正负责复制作用：真核生物中真正负责复制作用：DNADNA聚合酶聚合酶- -， （二） DNA连接酶 以ATP为能量来源，与大肠杆菌中的作用机制相似。 （三） 在DNA的合成过程中，也存在冈崎片段，拓扑异构酶、单链结合蛋白等。

28、关于DNA序列的测定酶法 关于关于DNADNA测序的测定测序的测定化学法化学法 化学法测序由化学法测序由MaxamMaxam、和、和GilbertGilbert于于19771977年所发明。其基本原理是用特异的年所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于化学试剂作用于DNADNA分子中不同碱基，然分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用用4 4组不同的特异反应，就可以使末端标组不同的特异反应，就可以使末端标记的记的DNADNA分子切成不同长度的片段，其末分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和端都是该特异的碱基。经变性胶电泳

29、和放射自显影得到测序图谱。放射自显影得到测序图谱。 4 4组特异的反应如下组特异的反应如下: : (1) G (1) G反应反应 用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯( (dirnethyldirnethyl sulfate,DMSsulfate,DMS) )使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的N N7 7原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。落，多核苷酸链可在该处断裂。 (2) G+A(2) G+A反应反应 用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环嘌呤环上的上的N N原子质子化，从而使其糖首键变得原子质子化，从而使其糖首键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。不稳定，再用

30、哌啶使键断裂。 (3)T+C(3)T+C反应反应 用肼使用肼使T T和和C C的嘧啶环断的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。裂，再用哌啶除去碱基。 (4) C(4) C反应反应 当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与与肼反应，并被哌啶除去。肼反应，并被哌啶除去。PCR技术的原理第二节 DNA的损伤与修复 有些物理化学因子，如紫外、电离辐射、化学诱变剂等可使细胞DNA受到损伤，引起生物的突变或致死。 一 光复活修复（一） 紫外照射此起的DNA损伤 紫外照射可使同一单链DNA中相邻的两个嘧啶之间产生一个环形丁烷，因而形成嘧啶二聚体，其中以胸腺嘧啶二聚体（TT）为主要。 DNA中所含T越多，尤其是

31、排列中相邻的机会越多，紫外线剂量越大，所形成的TT量越多，这会导致DNA复制和转录功能受到阻碍，则细菌对紫外作用越敏感，（二） 光复活修复 由光复活酶来完成。 光复活酶在暗处即可识别、结合DNA上的受损伤部位嘧啶二聚体，形成酶-DNA复合物。经可见光照射，酶便活化，将二聚体切开，酶再释放，受损部位得以修复。 光复活作用是一种高度专一的修复方光复活作用是一种高度专一的修复方式。式。它只作用于紫外线引起的它只作用于紫外线引起的DNADNA嘧啶二聚嘧啶二聚体体。 光复活酶在生物界分布很广，从低等光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有，而单细胞生物一直到鸟类都有，而高等的哺高等的哺乳

32、类却没有乳类却没有。 这说明在生物进化过程中该作用逐渐这说明在生物进化过程中该作用逐渐被别的修复系统所取代，并丢失了这个酶。被别的修复系统所取代，并丢失了这个酶。二切除修复 不需见光，属DNA损伤的暗复活作用。这是一个暗过程。在一系列酶的作用下，将DNA分子中的受损伤部位切除，以完整的一条链为模板，合成出被切去的部份，再使DNA恢复正常结构。 此过程共分四个步骤： （1）由专一的核酸内切酶识别嘧啶二聚体的部位后，在靠近二聚体5-端处切断单链DNA，露出3-OH（不含二聚体）； （2）DNA聚合酶以完整的互补链为模板，在断口处进行局部的修复合成； （3）5-核酸外切酶切去含嘧啶二聚体的寡核苷酸片

33、段；（4）连接酶将新合成的DNA链与原来的DNA链连在一起。 此为“先补后切”过程，而“先切后补”则为（2）和（3）步互换。 大肠杆菌DNA聚合酶I兼有53核酸外切酶活性，故切除、修复可为同一种酶承担。第三节 细菌的限制（聚）修饰系统 一细菌的限制性核酸内切酶 细菌体内能识别DNA特定核苷酸顺序的核酸内切酶，即细菌的限制性核酸内切酶。 它是分析DNA的解剖刀，是DNA体外重组的重要工具，是分析巨大DNA分子的重要手段。二细菌的修饰作用 即细菌DNA上的某些碱基，在修饰酶作用下发生改变，此即细菌的修饰作用。这种作用有严格的种的特异性，从而不被自身的限制核酸内切酶降解。 常见的修饰作用为甲基化作用

34、，主要的修饰酶为甲基化酶。此作用在宿主细胞中往往多次出现，并在整个细胞生活期中保持完整。三细菌的限制修饰系统 该系统由限制性核酸内切酶和修饰酶组成，它可以降解入侵的异种DNA而不降解自身的DNA，从而可以防止异种DNA侵入自身细胞后的复制与转录，稳定自身的遗传性 .第四节 RNA的生物合成 一原核生物的转录及转录后加工 (一) 转录（DNA指导下的RNA合成） 即以DNA为模板，在酶的作用下合成RNA的过程。 （二） 原核生物的转录特点 1 底物NTP(N=A,G,C,U)； 2 RNA聚合酶(RNA polymerase)，纯酶活性基团的有效部分结合有Zn2+； 3 模板DNA； 4 合成方

35、向 在单核苷酸的3-OH上逐个加上与模板碱基配对的核苷酸，与模板的方向相反，朝53方向延长RNA链。 5 不需要引物。6 转录时的聚合反应 n1ATP+ n2GTP+n3CTP+n4UTP +DNA（模板） （n1AMP-n2GMP-n3CMP-n4UMP） +(n1+n2+n3+n4)PPi + DNA（模板）7 只以双链DNA中的一条单链作为模板进行转录 其中，能够作为转录模板的DNA单链叫做模板链(template strand )或反意义链(antisense strand)、（-）链(minus strand)。 而另一条DNA单链则叫做非模板链(nontemplate strand

36、)或有意义链(sense strand)、（+）链(plus strand)、编码链(coding strand)。 转录时并非全部DNA都要转录是有选择性的、不对称的。同一染色体上各基因的模板链并不是都在同一条单链DNA上。 8 RNA聚合酶无校正功能。 9 合成的第一个核苷酸常常是GTP(pppG)或ATP(pppA)，其5-三磷酸基在转录过程中保持完整，不产生PPi。 大肠杆菌中以GTP为多。（三） RNA聚合酶的组成与功能 1 完整的RNA聚合酶的亚基组成 2全酶； 起始因子； 2核心酶； 不同的细菌中，、 亚基分子量较恒定，而因子分子量变化较大。 从亚基组成形式来看，从亚基组成形式来

37、看，大肠杆菌中只有大肠杆菌中只有一种一种RNA聚合酶。聚合酶。2 各亚基的功能 （1） 亚基：与模板的结合、酶的滑动及碱基识别有关。 （2）亚基：与因子同核心酶的结合有关，并参与RNA合成的引发、延伸，与促进第一个磷酸二酯键的形成有关。 （3）亚基：参与酶和底物的结合，参与因子与核心酶的结合，此外还结合两个酶必需的Zn原子。 （4）因子：本身无催化活性，也不能单独与DNA结合，但可识别DNA上的RNA合成的起始信号，在RNA合成中起起动作用。原核生物的原核生物的RANRAN聚合酶聚合酶亚亚 基基分子量分子量功能功能36 51236 512决定那些基因被转录决定那些基因被转录150 618150

38、 618 与转录全过程有关（催化）与转录全过程有关（催化） 155 613155 613结合结合DNADNA模板（开链）模板（开链）70 26370 263辨认起始点辨认起始点（5）核心酶的功能 单独的核心酶也能催化单独的核心酶也能催化RNA的合成，的合成，但但片段长短不一片段长短不一，因为转录的起点不固定，与DNA的结合无序列特异性。 加入因子，则可使之在特定部位结合。 因为因子可以改变酶与DNA之间的亲和力（即静电结合力，酶为碱性蛋白，DNA为酸性分子），使酶与DNA上的特定部位即启动子结合的亲和力增强，使核心酶能够特异结合在DNA上的特定部位即启动子上。 全酶与不同的启动子序列间的结合能

39、力不一样，这导致不同的基因有不同的转录效率。 不同的因子导致RNA聚合酶（应为核心酶？）识别不同的启动子，从而表达不同的基因。参考 另外，细菌的RNA聚合酶 可有单体=聚合体互变，这与离子强度有较大关系。 在低离子强度下具有可逆的凝聚作用。（四） 转录的过程 1 启动子与转录因子 （1） 启动子 指RNA聚合酶识别、结合及开始转录的一段DNA序列。 （至少）包括三个部位。 a 开始识别部位：RNA聚合酶的识别信号，于-35bp附近。 b 牢固结合部位：酶的紧密结合点，于-10bp左右，此处A-T碱基对较多，有助于DNA双链局部解开。 c 转录起始点：模板与酶的辨认结合模板与酶的辨认结合 RNA

40、 RNA聚合聚合酶保护区酶保护区 （2）转录因子 参与RNA聚合酶所进行的转录活动的辅助因子（蛋白质）。 2 终止子及终止因子、抗终止因子 （1）终止子 提供转录终止信号的DNA序列。 （2）终止因子 协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）。 （3）抗终止因子 能阻止终止子的作用，使酶得以越过终止子而继续转录的蛋白质。 RNA聚合酶能越过终止子继续转录，这种现象叫通读 。（4）终止子的类型 a 不依赖于rho（）的终止子 它又称简单终止子。 该终止子区域含有一个富含G-C碱基对的回文结构，以该终止子区域为模板转录出来的RNA之3-端有一个polyU，可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板

41、，其后即为转录的终点。 可以分析到，在转录的最后阶段，由转录出来的RNA之3-polyU序列与模板之间形成的rU-dA碱基配对极弱，导致该RNA-DNA杂交链在RNA聚合酶于终止子区域暂停时解开。b 依赖于rho（）的终止子 该终止子区域含有一个不富含G-C碱基对的回文结构，且以该终止子区域为模板转录出来的RNA之3-端无polyU。3 RNA聚合酶催化的转录过程 总的分为起始，延伸和终止三个阶段。 （1） 起始 RNA聚合酶全酶与DNA上的启动子结合后，DNA双螺旋局部解链。 此时，模板链根据碱基配对原则与进入的核糖核苷酸互补识别结合。 一般将转录时DNA上第一个核苷酸掺入的位置叫作转录起点

42、，以“+1”表示。 转录进RNA的第一个核苷酸多为pppA或pppG。 第一个核苷酸掺入后，在DNA 上转录的启动子区域即形成一个启动子-RNA聚合酶全酶-核糖核苷三磷酸复合物，转录正式开始。 当第二个核糖核苷酸与模板结合后，即在RNA聚合酶的催化下与第一个核苷酸反应结合，脱下PPi。此时即生成了新生RNA链上的第一个磷酸二酯键。（2） 延伸 当在RNA聚合酶作用下生成了RNA中的第一个磷酸二酯键后，因子即离开RNA聚合酶的核心酶，转录的起始阶段即告结束。 这时，因子的离开使核心酶的构象发生变化，以至于核心酶失去了专一性识别、结合DNA特异序列的能力，与模板结合不紧密，易于沿模板移动，并按碱基

43、配对原则依照模板序列来选择核苷酸合成RNA。 在合成RNA时，核心酶结合的DNA区域双链打开，呈泡状结构，常称之为转录鼓泡转录鼓泡。 新生的新生的RNA链区域会在鼓泡中与模链区域会在鼓泡中与模板板DNA结合形成结合形成RNA-DNA杂交链杂交链。 随着转录鼓泡的前进，RNA链不断合成、延长并被置换出来。 一般讲，在DNA上核心酶覆盖约长达60bp的区域，DNA双链的解链区约长达17bp，而RNA-DNA杂交链约长达12bp。 随着核心酶的移动，DNA双螺旋在转录方向的前方不断解开，而后面的模板DNA的互补DNA链则不断取代RNA-DNA杂交链中的RNA链以恢复DNA双螺旋。 实验表明，大肠肝菌

44、实验表明，大肠肝菌RNARNA聚合酶以大聚合酶以大约每秒钟约每秒钟50-9050-90个核苷酸的速度合成个核苷酸的速度合成mRNAmRNA。 RNARNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备核对功能，因此具备核对功能，因此RNARNA转录的准确性比转录的准确性比DNADNA复制（误差率约在复制（误差率约在1010-9-9-10-10-10-10）要求低）要求低得多，其误差率约在得多，其误差率约在1010-4-4-10-10-5-5范围内。范围内。（3） 终止 当核心酶沿模板DNA转录到终止子区域时，终止子对核心酶的转录活动产生终止作用。 由于原核生物中的终止子有两种类型

45、，因而终止子的终止作用有不同的特点。a. 简单终止子的转录其序列特点是在转录终点前有一段序列的模板链富含A，而在这一段的前面又有一段富含GC碱基对的回文序列。当该终止子区域作为模板进行转录后，所得RNA产物中相应于模板回文序列的区域会发生链内的GC配对而形成较为牢固的发夹结构，这个结构足以使核心酶的移动减慢或暂停RNA的合成； 所得RNA产物内相应于模板链中富含A的区域则为一段富含U的序列，这段序列与模板链之间的结构较弱，容易导致转录产物RNA脱离模板DNA。b. 依赖于因子的终止子的转录 它虽然也有一段回文序列，但其中并不富含GC碱基对，而且在转录终点前方没有一段富含A的模板链。该终止子区域

46、作为模板转录出来的产物RNA，虽然也能形成发夹结构，但不牢固。它不象上面以简单终止子区域为模板的转录产物那样有一段富含U的序列，因而它与模板之间的结合不算弱。这种转录产物虽然能够使核心酶的移动暂停，但还另外需要因子的帮助才能最终终止转录过程。 大肠杆菌的蛋白具有RNA-DNA解螺旋酶活性和依赖于RNA的NTPase活性。它为六聚体，亚基分子量约46KD， 它可以结合在新生的RNA链上，利用其NTPase活性水解NTP获得能量，沿着RNA链向核心酶移动。 当它与暂停在终止子区域的核心酶结合并相互作用后，则转录终止，并使RNA-DNA杂交链解链，将产物RNA与核心酶释放。（五） 转录后加工 原核生

47、物的mRNA不需要加工，转录尚未结束，蛋白质的生物合成就已经开始，即所谓边转录边翻译边转录边翻译。 原核生物的mRNA一般为多顺反子mRNA，即它作为模板时可以编码多条多肽链。 真核生物的则为单顺反子mRNA，即它作为模板时只能编码一条多肽链。二 真核生物的转录及转录后加工 （一） RNA聚合酶 真核生物的RNA聚合酶的性质总的来说与原核生物的相似，但有其特点。 一般根据-鹅膏覃碱对酶的抑制程度而将RNA聚合酶分成以下三种。酶的名称 对-鹅膏覃碱的 分布 催化合成的前体 敏感程度RNA聚合酶I（A） 不敏感 核仁 rRNA前体RNA聚合酶II（B） 敏感 核质 mRNA前体 （对低浓度的） （

48、hnRNA）RNA聚合酶III（C） 中度敏感 核质 tRNA前体与 （对高浓度的） 5SRNA真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶PolPolPol 对终止子的情况了解不多，也有启动子。有转录因子。 线粒体与叶绿体中也有RNA聚合酶，其也有类似的起始因子以及与大肠杆菌中RNA链延伸类似的方式。转录过程所需的蛋白质因子转录过程所需的蛋白质因子 转转录录过过程程（二） 转录后加工 真核生物中编码蛋白质的基因以单个基因为转录单位，产物为单顺反子mRNA。 基因中大多数有内含子，也作为模板进行转录，但在转录后的加工过程中被去除。 在真核生物的转录产物中，hnRNA（即核不均一RNA）是mRNA前

49、体。 hnRNA的碱基组成与总DNA的碱基组成类似，故又被称为类似DNA的RNA（D-RNA）。 hnRNA的半衰期短，比细胞质mRNA更不稳定。mRNA在核内产生并加工成熟后才转到细胞质。 其加工过程包括以下方面： 1 5-端形成特殊的帽子结构； 2 3-端切断并加上poly(A)尾巴； 3 经拼接清除内含子； 4 链内部核苷被甲基化。 其中，拼接过程有核内小分子RNA(snRNA)的协助。 snRNA可以和hnRNA中内含子区域的末端的碱基互补，导致外显子能够正确的靠在一起，有利于酶促除去转录产物中的内含子区域及拼接转录产物中的外显子部分。 加工后，成熟的mRNA才离开细胞核。此时，mRN

50、A与两种特殊的蛋白质结合，这些蛋白质可能引导mRNA通过细胞核膜上的孔进入细胞质。加工后剩下的RNA碎片被酶解。第五节 RNA的生物合成的抑制剂一 DNA模板功能的抑制剂 指能够与DNA结合，使DNA失去模板功能，从而抑制其复制和转录的物质。 例如线菌素D，有一扁平部分，可插入DNA中的dG=dC之间，使DNA模板局部变形，阻止RNA聚合酶的移动而抑制RNA链的延长。 低浓度的抑制转录，而高浓度的则抑制复制。二 RNA聚合酶的抑制剂 它经抑制RNA聚合酶来抑制转录。 如利福平，它可与原核生物RNA聚合酶的亚基非共价结合，阻止原核生物RNA的合成，阻止起动，不阻止延长。 利福平利福平阻止第一个核

51、苷三磷酸与RNA聚合酶的结合，也阻止因子的结合。但是它不抑制真核生它不抑制真核生物的转录。物的转录。 -鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱主要抑制真核RNA聚合酶以阻断真核生物mRNA合成。对原核生物对原核生物RNA聚合酶抑制极聚合酶抑制极弱。弱。第六节 逆转录作用 在酶的作用下， 以RNA为模板，按RNA中核苷酸顺序合成DNA。 这与通常转录过程中遗传信息由DNA到RNA的方向相反，故将此过程叫做逆转录逆转录，也叫做RNA指指导的导的DNA合成合成。 这是从致癌RNA病毒中发现的，并发现了催化此反应进行的酶。因此，将该病毒叫做逆转录病逆转录病毒毒，而将该酶叫做逆转录酶（或反向转录酶）。逆转录酶（或反向转录酶）

52、。 逆转录酶以RNA为模板合成DNA时，也同样以dNTP(N=A,G,C,T)为底物； 逆转录遵守碱基配对原则；要有引物及其上的3-OH存在；DNA 链的生长方向为53。 以病毒的单链RNA为模板时，引物常常为宿主细胞的tRNA。 以同一类型病毒以同一类型病毒RNA为模板时，逆转录为模板时，逆转录酶的活性最强。酶的活性最强。 但是逆转录酶可以带有适当引物的任何种逆转录酶可以带有适当引物的任何种类的类的RNA作为模板合成出作为模板合成出DNA。这种DNA叫做互补DNA（其英文简称为cDNA）。逆转录酶是一种多功能酶，有以下酶活性 1 具有RNA指导的DNA聚合酶活性 以RNA为模板合成一条互补的DNA，形成DNA-RNA杂种分子； 2 具有DNA指导的DNA 聚合酶活性 在新生的DNA链上合成另一条互补的DNA，形成双链DNA分子； 3 具有核糖核酸酶H的活性 专门水解DNA-RNA杂种分子中的RNA，可以朝35与53两个方向行使核酸外切酶作用。 结构： 亚基+ 亚基。 由 酶解而来。带Zn2+。 完