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1、酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验enzyme linked enzyme linked immunosorbent assayimmunosorbent assay，ELISA ELISA 技术技术讲座讲座安徽省安徽省动物疫病物疫病预防与控制中心防与控制中心王王 非非2021年年9月月16日日一、免疫检测的根底知识一、免疫检测的根底知识二、二、ELISAELISA的根本知识的根本知识三、本次三、本次ELISAELISA实验操作解读实验操作解读主要内容主要内容1抗原抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应对的物质。抗原是能在机体中引起特异性免疫应对的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生
2、抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于大于5000的蛋白质，例如完好的病毒粒子、细菌等。的蛋白质，例如完好的病毒粒子、细菌等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激素、产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激素、药物等。抗原的反响性取决于抗原决议簇，或称为药物等。抗原的反响性取决于抗原决议簇，或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决议簇，例如细表位。一个抗原分子可带有不同的决议簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带
3、有多个抗原决议簇。菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决议簇。2抗体抗体抗体的构造抗体的构造抗体是能与抗原特异性抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五分五类，即，即IgG、IgA、IgM、IgD和和IgE。与免疫。与免疫测定有关的定有关的Ig主要主要为IgG和和IgM。Ig由两个由两个轻链L和两个重和两个重链H的的单体体组成。成。Ig的的轻链是一是一样的，有的，有kappa和和Lambda两种型两种型别。 五五类Ig的重的重链构造不同，构造不同，这决决议了它了它们的抗原性也的抗原性也不同。不同。IgG和和IgM的重的重链分分别称称为ga
4、mma链和和mu链。重链和轻链的重链和轻链的N N端的氨基酸陈列顺序因各种抗体而异，端的氨基酸陈列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用称为可变区，分别用VHVH和和VLVL表示。两者构成抗体的抗表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决议簇匹配，发生特异原结合部位，只与相应的抗原决议簇匹配，发生特异性结合见图，是抗体专注性结合性结合见图，是抗体专注性结合抗原的构造根底。抗原的构造根底。 机体被微生物感染后，先产生机体被微生物感染后，先产生IgMIgM抗体，然后产生抗体，然后产生IgGIgG抗体。经过一段时间，抗体。经过一段时间，IgMIgM抗体量逐渐减少而消逝，抗体量逐渐减少而消逝，
5、而而IgGIgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可继续数年之久。抗体可长期存在，在疾病痊愈后可继续数年之久。1.11.1抗原抗体反响抗原抗体反响 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体抗原与抗体结合构成抗原抗体复合物的合构成抗原抗体复合物的过程是一种程是一种动态平衡，其反响式平衡，其反响式为：Ag+AbAgAb 抗体的抗体的亲和力和力affinityaffinity，可以用平衡常数，可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgAbK=AgAbAgAb ,AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。高有关。高亲和力抗体的抗原和力抗体的抗原结合点与抗原的决合点与抗原的决议簇在空
6、簇在空间构型上非构型上非常适宜，两者常适宜，两者结合合结实，不易解离。解离后的抗原或抗体，不易解离。解离后的抗原或抗体均能均能坚持原有的构造和活性。持原有的构造和活性。1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决议簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决议簇与抗体的结合位点之间。化学构造和空间构型互补关系，具有高度的特异性。之间。化学构造和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分别待检物。测定某一特定的物质，而不需先分别待检物。1.1.31.1.3最适比例最适比例 在恒定量的抗体中参与递增量的抗原构成抗体复合物沉淀的量见图。曲线在恒定量的抗体
7、中参与递增量的抗原构成抗体复合物沉淀的量见图。曲线的顶峰部分是抗原抗体比例最适宜的范围，称为等价带。在等价带前后分别为的顶峰部分是抗原抗体比例最适宜的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。假设抗原或抗体极度过剩，那么无沉淀物构成，在抗体过剩带和抗原过剩带。假设抗原或抗体极度过剩，那么无沉淀物构成，在免疫测定中称为带景象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫免疫测定中称为带景象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫学方法测定抗原时，应使反响系统中有足够的抗体量，否那么测得的量会小于学方法测定抗原时，应使反响系统中有足够的抗体量，否那么测得的量会小于实践含
8、量，甚至出现假阴性。实践含量，甚至出现假阴性。1.1.41.1.4敏感性敏感性化学比色法的敏感度化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml程度程度酶反响反响测定法的敏感度定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫免疫测定中凝胶分散法和定中凝胶分散法和浊度法的敏感度与度法的敏感度与酶反响法相仿反响法相仿标志的免疫敏感度可提高数千倍，达志的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml程度程度例如：用放射免疫例如：用放射免疫测定法或定法或酶免疫免疫测定法定法测定口蹄疫抗体，定口蹄疫抗体，其敏感度可达其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。1.21.2免疫测定在临床检验中的运用免疫测定
9、在临床检验中的运用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的运用范围就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的运用范围极广。极广。1) 1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。2) 2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。激素，包括小分子量的甾体激素等。3) 3) 抗生素和药物。抗生素和药物。4) 4) 病原体抗原，如胶体金测禽流感病毒。病原体抗原，如胶体金测禽
10、流感病毒。5) 5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。免疫标志技术免疫标志技术1.1.定定义：2.2. 将抗原将抗原- -抗体反响与抗体反响与标志技志技术相相结合，用放合，用放射性同位素、射性同位素、酶或或荧光素光素标志的知抗体或抗原，志的知抗体或抗原，经过检测标志物，志物，间接接测定未知的抗原或抗体。定未知的抗原或抗体。3.3.分分类：4.4.放射免疫放射免疫测定法：定法：131I131I，32P32P5.5.免疫免疫荧光技光技术：FITCFITC，PEPE6.6.免疫免疫酶测定法：定法：HRPHRP，APAP免疫酶测定法免疫酶测定法(En
11、zyme Immuno Assay,EIA)(Enzyme Immuno Assay,EIA) 用用用用酶标酶标志的抗原或抗体志的抗原或抗体志的抗原或抗体志的抗原或抗体进进展的抗原抗体反响。展的抗原抗体反响。展的抗原抗体反响。展的抗原抗体反响。 辣根辣根辣根辣根过过氧化物氧化物氧化物氧化物酶酶(HRP)(HRP)(HRP)(HRP)，碱性磷酸，碱性磷酸，碱性磷酸，碱性磷酸酶酶(AP)(AP)(AP)(AP) 特点：特点：特点：特点： 高度特异性：高度特异性：高度特异性：高度特异性：坚坚持抗原抗体反响的特异性持抗原抗体反响的特异性持抗原抗体反响的特异性持抗原抗体反响的特异性 高灵敏度：高灵敏度：
12、高灵敏度：高灵敏度：酶酶催化底物催化底物催化底物催化底物显显色的高效性，色的高效性，色的高效性，色的高效性，pgpgpgpg程度微量程度微量程度微量程度微量检测检测 定性定量定性定量定性定量定性定量检测检测：反响液：反响液：反响液：反响液颜颜色深浅或光密度色深浅或光密度色深浅或光密度色深浅或光密度值值 分分分分类类： 酶联酶联免疫吸附免疫吸附免疫吸附免疫吸附实验实验：可溶性抗原或抗体：可溶性抗原或抗体：可溶性抗原或抗体：可溶性抗原或抗体 酶酶免疫免疫免疫免疫组组化法：化法：化法：化法： 组织组织中或中或中或中或细细胞外表的抗原。胞外表的抗原。胞外表的抗原。胞外表的抗原。酶标抗体技术酶分子与抗原
13、或抗体分子共价结合酶标抗体与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原抗体发生特异性结合，并洗下未结合的物质。滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色。可根据颜色反响来断定有无相应的免疫反响。颜色反响的深浅与标本中相应抗原抗体的量成正比。此种有色产物可用肉眼或分光光度计加以测定。酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)Assay,ELISA)用用酶标志抗原或抗体志抗原或抗体检测液体血液、液体血液、细胞液中胞液中未知抗体或抗原的方法。未知抗体或抗原的方法。1.1.定定义2
14、.2.分分类间间接法接法接法接法Indirect ELISAIndirect ELISA：将知抗原吸附于固相将知抗原吸附于固相将知抗原吸附于固相将知抗原吸附于固相载载体，体，体，体，酶标酶标志二抗志二抗志二抗志二抗检测检测液相中未知抗体液相中未知抗体液相中未知抗体液相中未知抗体双抗体双抗体双抗体双抗体夹夹心法心法心法心法Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将知抗体吸附于固相将知抗体吸附于固相将知抗体吸附于固相将知抗体吸附于固相载载体，体，体，体，酶标酶标志一抗志一抗志一抗志一抗检测检测液相中的可溶性抗原液相中的可溶性抗原液相中的可溶性抗原液相中的可溶性抗原竞竞争法争法
15、争法争法Competitive ELISA) Competitive ELISA) ：将知抗体或抗原吸附于固相将知抗体或抗原吸附于固相将知抗体或抗原吸附于固相将知抗体或抗原吸附于固相载载体，体，体，体，酶标酶标志抗原或志抗原或志抗原或志抗原或抗体抗体抗体抗体检测检测液相中的可溶性抗原或抗体液相中的可溶性抗原或抗体液相中的可溶性抗原或抗体液相中的可溶性抗原或抗体1. ELISA1. ELISA的原理的原理 ELISA ELISA的根底是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的的根底是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标志。结合在固相载体外表的抗原或抗体仍坚持其免酶标志。结合在固相载体外表的抗原或抗体仍坚
16、持其免疫学活性，酶标志的抗原或抗体既保管其免疫学活性，疫学活性，酶标志的抗原或抗体既保管其免疫学活性，又保管酶的活性。又保管酶的活性。 在测定时，受检标本测定其中的抗体或抗原与固在测定时，受检标本测定其中的抗体或抗原与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗涤的方法使固相相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗涤的方法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。载体上构成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再参与酶标志的抗原或抗体，也经过反响而结合在固再参与酶标志的抗原或抗体，也经过反响而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质
17、的量呈一定的比例。一定的比例。 参与酶反响的底物后，底物被酶催化成为有色产物，参与酶反响的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进展定性或定量分析。色的深浅进展定性或定量分析。酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)Assay,ELISA)原理以原理以间接性接性ELISAELISA为例：例：显显色色色色3. ELISA3. ELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C
18、 C三部分三部分) )ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。底物。1 1已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂；已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂；2 2酶标志的抗原或抗体结合物；酶标志的抗原或抗体结合物；3 3酶的底物；酶的底物；4 4阴性对照品和阳性对照品，参考规范品；阴性对照品和阳性对照品，参考规范品；5 5结合物及标本的稀释液；结合物及标本的稀释液；6 6洗涤液；洗涤液；7 7酶反响终止液酶反响终止液ELISAELISA的试剂预备的试剂预备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋聚
19、苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保管原来的免疫学活性。白质抗原吸附其上后仍保管原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。近。3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coati
20、ng)(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合的，靠蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子构造上的疏水基团与固相载体外表的疏水基的是蛋白质分子构造上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体外表。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲不易吸附的
21、非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，参与生物素化的即用亲和素先包被载体，参与生物素化的DNADNA，这种包被方法均匀、结实，已扩展运用于各种抗原物质的定，这种包被方法均匀、结实，已扩展运用于各种抗原物质的定量测定。量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂例如乙醇脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂例如乙醇中溶解后参与中溶解后参与ELISAELISA板孔中
22、，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相外表。待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相外表。 优点：实验的特异性、敏感性均由此得以改善，反复性亦优点：实验的特异性、敏感性均由此得以改善，反复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决议簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成多肽抗原是抗原决议簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。普通只含有一个抗原决议簇，纯度高，
23、特异性也高，但由于分子普通只含有一个抗原决议簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体外表。的吸附，间接地结合到固相载体外表。3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其结合发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其结合发生在FcFc段上，抗体结合段上，抗体结合点暴露于外。点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培育液取材于抗血清或含单克隆抗体的培育液. .须除去杂抗体后才干须除去杂抗体后才干用于用于ELISAELISA，以保证实验的特异性
24、。，以保证实验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需求作吸收腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需求作吸收层析处置，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，层析处置，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可获得更好的效果。可获得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸碳酸盐缓冲液冲液pH7.2pH7.2的磷酸的磷酸盐缓冲液冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。冲液。 参与包被液后，在参与包被液后，在4-84-8冰箱中放置冰箱中放置过夜，夜，3737中保温中保温2 2小小时。包被。包被浓度随度随
25、载体和包被物的性体和包被物的性质可有很大的可有很大的变化，每化，每批批资料需料需经过实验与与酶结合物的合物的浓度度协调选定。普通蛋白定。普通蛋白质的包被的包被浓度度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 3.1.6 封锁封锁封锁封锁(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封锁就是让大量不相关的蛋白质充填这些再包被的过程。封锁就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封锁剂：常用
26、封锁剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度运用比较价廉，可以高浓度运用5%5%。 3.4 3.4 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为中，常用的稀释液为含含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。ELISAELISA的试剂预备的试剂预备B B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标志的抗体或抗原是即酶标志的抗体或抗原是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体或抗原的免疫
27、活性抗体或抗原的免疫活性 3 3结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG，以免在与酶结合时其，以免在与酶结合时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进展反响，合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进展反响，实验结果本底浅淡。在实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗原的方式不多，总中用酶标抗原的方式不多，总的要求是抗原必需是高纯度的。的要求
28、是抗原必需是高纯度的。3.2.23.2.2酶酶纯度高，催化反响的度高，催化反响的转化率高，化率高，专注性注性强，性，性质稳定，来源定，来源丰富，价丰富，价钱不不贵，受，受检标本中不存在一本中不存在一样的的酶。酶结合物保管活性部分和催化才干，底物易于制合物保管活性部分和催化才干，底物易于制备和保管，和保管，价价钱低廉，有色低廉，有色产物易于物易于测定等。定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和和脲酶等。等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量，分子量为4400044000，是一种
29、，是一种复合复合酶，由主，由主酶酶蛋白和蛋白和辅基基亚铁血血红素素结合而成，合而成，是一种是一种卟啉蛋白啉蛋白质。3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备酶标志抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸酶标志抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。盐氧化法。1戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基经过它而结合。有效结合率达60%-70%和反复性好。 交联反响是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有能够交联，影响效果。2过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子外表的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基构成c
30、hiff氏碱而结合。简便有效. 结合物中混有的游离酶普通不影响结合物中混有的游离酶普通不影响ELISAELISA中最后的酶活性测中最后的酶活性测定。但游离的抗体那么会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因定。但游离的抗体那么会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。效果更好。 制得结合物，最适的任务浓度就是指结合物稀释至这一浓度制得结合物，最适的任务浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最正确灵敏度，到达时，能维护一个低的本底，并获得测定的最正确灵敏度，到达最
31、适宜的测定条件和测定费用的节省。最适宜的测定条件和测定费用的节省。3.2.43.2.4结合物的保管结合物的保管 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保管一年左右。结合物溶液中定，冻干后可在普通冰箱中保管一年左右。结合物溶液中参与等体积的甘油，参与蛋白维护剂。另外再参与抗生素参与等体积的甘油，参与蛋白维护剂。另外再参与抗生素例如庆大霉素和防腐剂例如庆大霉素和防腐剂HRPHRP结合物加硫柳泵，结合物加硫柳泵，APAP结结合物可加叠氮钠。合物可加叠氮钠。3.2.5 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀用于稀释
32、高高浓度的度的结合物以配成任合物以配成任务液。液。为防止防止结合物在合物在反响中直接吸附在固相反响中直接吸附在固相载体上：体上：0.1%0.1%牛血牛血洁白蛋白，白蛋白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用适宜的盒均已用适宜的缓冲液配成任冲液配成任务液，液，运用运用时不需再行稀不需再行稀释，在，在4-84-8保管期可达保管期可达6 6个月。个月。试剂预备试剂预备 C C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反响后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反响后，在492nm49
33、2nm处有处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常用的底结合物最常用的底物。物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供供氢体，体， H2O2为受受氢体。体。DH2普通普通为无色化合物，无色化合物，经酶作用后成作用后成为有色的有色的产物。物。DH2如：如：邻苯二胺苯二胺(OPD)、四甲基、四甲基联苯胺苯胺(TMB)和和ABTS 。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成溶液性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与试剂，只需与H2O2H2O2溶液混和即成运用液。酶
34、反响终止后，溶液混和即成运用液。酶反响终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。采用。HRPHRP对氢受体的专注性很高，仅作用于对氢受体的专注性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过氧化、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物为磷酸酯酶，普通采用对硝基苯磷酸酯作为的底物为磷酸
35、酯酶，普通采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波优点有吸波优点有吸收峰。用收峰。用NaOHNaOH终止酶反响后，黄色可稳定一时间。终止酶反响后，黄色可稳定一时间。APAP也有发荧光底物磷酸也有发荧光底物磷酸4-4-甲基伞酮，可用于甲基伞酮，可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。3.5 3.5 酶反响终止液酶反响终止液常用的常用的HRPHRP反响终止液为硫酸，其浓反响终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板度按加量及比色液的最终体积而异，在板
36、式式ELISAELISA中普通采用中普通采用2mol/L2mol/L。4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative (negative control)control)是检验实验有效性的控制品，同时也作为判别结果是检验实验有效性的控制品，同时也作为判别结果的对照。的对照。阳性对照品的根本组成应尽量与检测标本的组成相一阳性对照品的根本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白维护剂的缓冲液为基质。致，多以含蛋白维护剂的缓冲液为基质。参与的量应与试剂的敏感度相称；参与的量应与试剂的
37、敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。估计标本物质的量。参考规范品参考规范品 定量测定如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等应含有制造定量测定如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等应含有制造规范曲线用的参考规范品，应包括覆盖可检测范围的规范曲线用的参考规范品，应包括覆盖可检测范围的4-54-5个个浓度，普通均配入含蛋白维护剂及防腐剂的缓冲液中浓度，普通均配入含蛋白维护剂及防腐剂的缓冲液中. .阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测的阴检测的阴性对照品中不可含性对
38、照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。 标本的采取和保管标本的采取和保管 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等运用。其他成份同血清。血浆和血清可同等运用。血清标本应防止溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物血清标本应防止溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以酶活性的物质，以HRPHRP为标志的为标志的ELISAELI
39、SA测定中，能够会添加非测定中，能够会添加非特异性显色。特异性显色。根本操作本卷须知根本操作本卷须知试剂试剂的的的的预备预备 按按按按试剂试剂盒盒盒盒阐阐明明明明书书的要求的要求的要求的要求预备实验预备实验中需用的中需用的中需用的中需用的试试剂剂。 ELISA ELISA 中用的蒸中用的蒸中用的蒸中用的蒸馏馏水或去离子水，包括用于洗水或去离子水，包括用于洗水或去离子水，包括用于洗水或去离子水，包括用于洗涤涤的，的，的，的，应为应为新新新新颖颖的和高的和高的和高的和高质质量的。自配的量的。自配的量的。自配的量的。自配的缓缓冲液运用冲液运用冲液运用冲液运用pH pH 计计丈量丈量丈量丈量较较正。从
40、冰箱中取出的正。从冰箱中取出的正。从冰箱中取出的正。从冰箱中取出的实验实验用用用用试剂应试剂应待温度与室温待温度与室温待温度与室温待温度与室温平衡后运用。平衡后运用。平衡后运用。平衡后运用。试剂试剂盒中本次盒中本次盒中本次盒中本次实验实验不需用的部分不需用的部分不需用的部分不需用的部分应应及及及及时时放放放放回冰箱保管。回冰箱保管。回冰箱保管。回冰箱保管。 在在ELISAELISA中普通有中普通有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，防板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意
41、不可溅出，不可产生气泡。止加在孔壁上部，并留意不可溅出，不可产生气泡。加样加样: :保温保温抗原抗体完成反响的保温抗原抗体完成反响的保温过程称程称为温育温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫属固相免疫测定，抗原、抗体的定，抗原、抗体的结合只在固相外表上合只在固相外表上发生。生。为什么什么ELISAELISA反响反响总是需求一定是需求一定时间的温育？的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温暖、室温暖44冰箱温度等。冰箱温度等。3737是是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合合
42、的适宜温度。的适宜温度。保温方式：保温方式：ELISAELISA仪器附有特制的器附有特制的电热块，水浴。，水浴。假假设用保温箱：用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底板放在湿盒内，在盒底垫湿的湿的纱布，最布，最后将后将ELISAELISA板放在湿板放在湿纱布上。反响板均不宜叠放，以保布上。反响板均不宜叠放，以保证各板各板的温度都能迅速平衡。的温度都能迅速平衡。室温温育的反响，操作室温温育的反响，操作时的室温的室温应严厉限制在限制在规定的范定的范围内，内，规范室温温度是指范室温温度是指20-2520-25，但，但详细操作操作时可根听可根听阐明明书的要的要求控制温育。求控制温育。应留意
43、温育的温度和留意温育的温度和时间应按按规定力求准确。定力求准确。为保保证这一点，一个人操作一点，一个人操作时，一次不宜多于两，一次不宜多于两块板同板同时测定。定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反响步骤，但却也决议着实验过程中虽不是一个反响步骤，但却也决议着实验的成败。的成败。ELSIAELSIA洗涤：到达分别游离的和结合的酶标志物的目的。洗涤：到达分别游离的和结合的酶标志物的目的。去除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物去除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的
44、吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：操作有流水冲洗式和浸泡式两种：1 1流水冲洗式流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已
45、有实验阐明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让已有实验阐明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔外表，洗涤效果更佳。水流冲击板孔外表，洗涤效果更佳。 2 2浸泡式浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液形状，从而脱离固相载体。水溶液形状，从而脱离固相载体。显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反响
46、。反响的显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反响。反响的温度和时间仍是影响显色的要素。在一定时间内，阴性孔可温度和时间仍是影响显色的要素。在一定时间内，阴性孔可坚持无色，而阳性孔那么随时间的延伸而呈色加强。适当提坚持无色，而阳性孔那么随时间的延伸而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进展。高温度有助于加速显色进展。TMBTMB受光照的影响。但为保证明验结果的稳定性，宜在规定的受光照的影响。但为保证明验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至随即逐渐减弱，至2 2小时后
47、即可完全衰退至无色。小时后即可完全衰退至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔未经任何反响仅加底物液以蒸馏水校零点，测读底物孔未经任何反响仅加底物液的孔和空白孔以生理盐水或稀释液替代标本作全过程的的孔和空白孔以生理盐水或稀释液替代标本作全过程的孔，以记录本次实验的试剂情况。其后可用空白孔以蒸馏孔，以记录本次实验的试剂情况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进展计算。进展计算。结果以光密度结果以光密度op
48、lical densityoplical density，ODOD，现按规定用吸光度，现按规定用吸光度absorbenceabsorbence，A A，两者含义一样。通常的表示方法是，将，两者含义一样。通常的表示方法是，将吸收波长写于吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表，表示方法为示方法为A492nmA492nm或或OD492nmOD492nm。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色比色仪简称称酶标仪，通常指，通常指测读ELISAELISA光度光度计。针对固相固相载体方式的不同，各有特制的适用于板、珠和小体方式的不同，各有特制的适
49、用于板、珠和小试管的管的设计。酶标仪的主要性能目的有：的主要性能目的有：测读速度、速度、读数的准确性、反复数的准确性、反复性、准确度和可性、准确度和可测范范围、线性等等。性等等。优良的良的酶标仪的的读数普数普通可准确到通可准确到0.0010.001，准确性，准确性为1%1%，反复性达，反复性达0.5%0.5%。操作操作时室温宜在室温宜在15-3015-30，运用前先，运用前先预热仪器器15-3015-30分分钟，测读结果更果更稳定。定。测读A A值时，要，要选用用产物的敏感吸收峰，如物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波波长。有的。有的酶标仪可用双波可用双波长式式测读。各种各
50、种酶标仪性能有所不同，运用中性能有所不同，运用中应详细阅读阐明明书。6 6 结果判别结果判别 6.1 6.1 定性测定定性测定定性定性测定的定的结果判果判别作出作出“有或有或“无的回答，分无的回答，分别用用“阳性阳性、“阴性表示。在阴性表示。在这种半定量种半定量测定中，将定中，将标本作一系列稀本作一系列稀释后后进展展实验，呈阳性反响的最高稀，呈阳性反响的最高稀释度即度即为滴度。根据滴滴度。根据滴度的高低，可以判度的高低，可以判别标本反响性的本反响性的强弱，弱，这比察看不稀比察看不稀释标本呈色的深浅判本呈色的深浅判别为强阳性、弱阳性更具定量意阳性、弱阳性更具定量意义。在在间接法和接法和夹心法心法
51、ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争争法法ELISAELISA中那么相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两中那么相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反响的反响的结果判果判别方法不同，分述于下。方法不同，分述于下。A.A.阳性断定值：阳性断定值： cut-off valuecut-off value普通为阴性对照普通为阴性对照A A值值加上一个特定的常数，以此作为判别结果阳性或阴性的规加上一个特定的常数，以此作为判别结果阳性或阴性的规范。范。B.B.标本标本/ /阴性对照比值：在实验条件包括试剂较难保阴性对照比值：在实验条件包括试剂较难保证恒定的情况下，这种判别法
52、较为适宜。在得出标本证恒定的情况下，这种判别法较为适宜。在得出标本S S和阴性对照和阴性对照N N的的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。间接法间接法4. ELISA4. ELISA的操作要点的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证证ELISAELISA必要条件。必要条件。严厉遵照规定操作，必能得出准确的结果。严厉遵照规定操作，必能得出准确的结果。猪口蹄疫病毒猪口蹄疫病毒VP1构造蛋白抗体构造蛋白抗体酶联免疫吸附免疫吸附实验3、本次、本次ELISA实验操作解读实验操作解读3.13.13.13.1实际实际根底：根底
53、：根底：根底： 利用合成利用合成利用合成利用合成肽肽抗原抗原抗原抗原为为固相免疫吸附固相免疫吸附固相免疫吸附固相免疫吸附剂剂来来来来检测检测血清中因感染血清中因感染血清中因感染血清中因感染FMDVFMDVFMDVFMDV而而而而产产生的特异性抗体。此合成生的特异性抗体。此合成生的特异性抗体。此合成生的特异性抗体。此合成肽肽是一是一是一是一单链单链复合体，他复合体，他复合体，他复合体，他们们具具具具有有有有FMDV VP1FMDV VP1FMDV VP1FMDV VP1病毒外壳外表蛋白病毒外壳外表蛋白病毒外壳外表蛋白病毒外壳外表蛋白质质特定抗原决特定抗原决特定抗原决特定抗原决议议区的氨基酸序列区
54、的氨基酸序列区的氨基酸序列区的氨基酸序列及构造，具病毒血清型之特异性。及构造，具病毒血清型之特异性。及构造，具病毒血清型之特异性。及构造，具病毒血清型之特异性。这这些合成些合成些合成些合成肽肽抗原和相抗原和相抗原和相抗原和相应应抗体抗体抗体抗体的的的的结结合力极高，因此合力极高，因此合力极高，因此合力极高，因此带给带给此此此此检验试剂检验试剂以极高的敏感性。以极高的敏感性。以极高的敏感性。以极高的敏感性。这这些代些代些代些代表表表表VP1VP1VP1VP1蛋白蛋白蛋白蛋白质质特定区域的合成抗原是特定区域的合成抗原是特定区域的合成抗原是特定区域的合成抗原是经经无数次特异性挑无数次特异性挑无数次特
55、异性挑无数次特异性挑选选所所所所选选出，因此其特异性亦非常出，因此其特异性亦非常出，因此其特异性亦非常出，因此其特异性亦非常优优越。越。越。越。这这些些些些长长度很短的特定区域合成度很短的特定区域合成度很短的特定区域合成度很短的特定区域合成抗原不具有抗原不具有抗原不具有抗原不具有对对其他非特异性抗体的交叉反响。本其他非特异性抗体的交叉反响。本其他非特异性抗体的交叉反响。本其他非特异性抗体的交叉反响。本产产品主要用于品主要用于品主要用于品主要用于评评价价价价经经FMDVFMDVFMDVFMDV疫苗免疫后疫苗免疫后疫苗免疫后疫苗免疫后动动物的免疫情况。物的免疫情况。物的免疫情况。物的免疫情况。3.
56、23.23.23.2试剂试剂盒操作原理盒操作原理盒操作原理盒操作原理间间接法：接法：接法：接法： 本本本本试剂试剂盒是采用口蹄疫病毒合成盒是采用口蹄疫病毒合成盒是采用口蹄疫病毒合成盒是采用口蹄疫病毒合成肽肽固相化抗原包被于微孔固相化抗原包被于微孔固相化抗原包被于微孔固相化抗原包被于微孔板的微孔外表上。板的微孔外表上。板的微孔外表上。板的微孔外表上。这这些多些多些多些多肽肽代表了口蹄疫病毒代表了口蹄疫病毒代表了口蹄疫病毒代表了口蹄疫病毒 VP1 VP1 VP1 VP1区中具有高区中具有高区中具有高区中具有高度抗原性的蛋白片段。在度抗原性的蛋白片段。在度抗原性的蛋白片段。在度抗原性的蛋白片段。在实
57、验实验中，在相中，在相中，在相中，在相应应的反响孔中参与稀的反响孔中参与稀的反响孔中参与稀的反响孔中参与稀释释的的的的对对照和待照和待照和待照和待检检血清，血清，血清，血清，经经孵育后，假孵育后，假孵育后，假孵育后，假设样设样品中含有口蹄疫病毒特品中含有口蹄疫病毒特品中含有口蹄疫病毒特品中含有口蹄疫病毒特异性抗体，那么将与多异性抗体，那么将与多异性抗体，那么将与多异性抗体，那么将与多肽肽抗原抗原抗原抗原结结合而吸附于反响孔外表，合而吸附于反响孔外表，合而吸附于反响孔外表，合而吸附于反响孔外表，经经洗洗洗洗涤涤除去未除去未除去未除去未结结合抗体和合抗体和合抗体和合抗体和样样品其他品其他品其他品其
58、他组组分后；再参与辣根分后；再参与辣根分后；再参与辣根分后；再参与辣根过过氧化物氧化物氧化物氧化物酶酶标标志的基因重志的基因重志的基因重志的基因重组组蛋白蛋白蛋白蛋白A/GA/GA/GA/G，同已，同已，同已，同已结结合在反响孔内的合在反响孔内的合在反响孔内的合在反响孔内的样样品中的口品中的口品中的口品中的口蹄疫病毒抗原抗体复合物蹄疫病毒抗原抗体复合物蹄疫病毒抗原抗体复合物蹄疫病毒抗原抗体复合物发发生特异性生特异性生特异性生特异性结结合；再合；再合；再合；再经经洗洗洗洗涤涤除去未除去未除去未除去未结结合的合的合的合的酶结酶结合物，在各孔内参与合物，在各孔内参与合物，在各孔内参与合物，在各孔内参
59、与TMBTMBTMBTMB底物液，将底物液，将底物液，将底物液，将产产生生生生酶酶分解分解分解分解TMBTMBTMBTMB的的的的蓝蓝色色色色产产物，物，物，物，颜颜色的深浅与待色的深浅与待色的深浅与待色的深浅与待测样测样品中口蹄疫病毒构造蛋白品中口蹄疫病毒构造蛋白品中口蹄疫病毒构造蛋白品中口蹄疫病毒构造蛋白VP1VP1VP1VP1特异性抗体含量成正比，参与硫酸溶液特异性抗体含量成正比，参与硫酸溶液特异性抗体含量成正比，参与硫酸溶液特异性抗体含量成正比，参与硫酸溶液终终止反响后，用止反响后，用止反响后，用止反响后，用酶标仪酶标仪450nm450nm450nm450nm波波波波长测长测定各反响孔
60、中的定各反响孔中的定各反响孔中的定各反响孔中的ODODODOD值值。 3.33.33.33.3试剂试剂盒作用与用途：盒作用与用途：盒作用与用途：盒作用与用途： 用于用于用于用于检测检测猪口蹄疫猪口蹄疫猪口蹄疫猪口蹄疫VP1VP1VP1VP1构造蛋白抗体。与猪口蹄疫非构造构造蛋白抗体。与猪口蹄疫非构造构造蛋白抗体。与猪口蹄疫非构造构造蛋白抗体。与猪口蹄疫非构造蛋白蛋白蛋白蛋白NS)NS)NS)NS)抗体抗体抗体抗体酶联酶联免疫吸附免疫吸附免疫吸附免疫吸附试剂诊试剂诊断断断断试剂试剂盒盒盒盒结结合运用，可区合运用，可区合运用，可区合运用，可区分口蹄疫病毒感染分口蹄疫病毒感染分口蹄疫病毒感染分口蹄疫
61、病毒感染动动物和疫苗免疫物和疫苗免疫物和疫苗免疫物和疫苗免疫动动物。物。物。物。VP1试剂盒检测结果+-NS试剂盒检测结果+感染动物感染动物-疫苗接种动物正常动物3.5操作步操作步骤： 1.运用前将运用前将试剂盒恢复到室温，防止阳光直射或放盒恢复到室温，防止阳光直射或放置在置在30以上以上环境中；境中； 2.取出取出样品稀品稀释板，做好阳性和阴性板，做好阳性和阴性对照孔照孔标志，志，各各为2孔，其他孔，其他为检测孔，各孔，各1孔；孔； 3.加稀加稀释液液200l。再在各孔中参与。再在各孔中参与10 l对照或被照或被检血清；血清； 4.取出包被板，将稀取出包被板，将稀释后的血清，加至抗原包被板的
62、后的血清，加至抗原包被板的相相应孔中，加盖或封膜，置孔中，加盖或封膜，置372 下孵育下孵育60 5分分钟；操作步操作步骤： 5.配置洗配置洗涤任任务液；液； 6.洗洗涤，每孔，每孔300 l，洗，洗涤6次，拍干；次，拍干； 7.酶结合物任合物任务液配制，液配制，100倍稀倍稀释，现配配现用；用； 8.各孔中参与各孔中参与100 l酶结合物任合物任务液，加盖或封膜，液，加盖或封膜，置置372 下孵育下孵育30 2分分钟； 9.反复反复6； 10.TMB底物任底物任务液配制：液配制： TMB底物底物A液、液、 TMB底底物物B液等量配制，液等量配制，现配配现用；用；操作步操作步骤： 11.各孔中
63、参与各孔中参与100 l TMB底物任底物任务液，加盖或封膜，液，加盖或封膜，置置372 下孵育下孵育15 1分分钟； 12.各孔中参与各孔中参与100 l 终止液，并悄然振止液，并悄然振荡混匀；混匀； 13.在在15分分钟内，用内，用酶标仪测定在定在450nm波波长下得下得OD值。3.6结果断定：果断定： 1.阴性阴性对照平均照平均OD值应0.2，每个阳性孔，每个阳性孔OD值0.5，且，且2.0。否那么，。否那么，实验无效。无效。临界界值=0.23阳性阳性对照照孔平均孔平均OD值； 2.被被检样品孔品孔OD值临界界值时，判，判为VP1构造蛋白抗构造蛋白抗体阴性；被体阴性；被检样品孔品孔OD值临界界值时，判，判为阳性；阳性； 3.判判为阳性阳性样品，运用品，运用2个孔个孔进展反复展反复检测。检测结果出果出现至少至少1个孔个孔为阳性，那么断定阳性，那么断定VP1构造蛋白抗体构造蛋白抗体阳性，否那么阴性。阳性，否那么阴性。
