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1、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具(1)(1)你你还还记记得得我我们们吗吗？氢键氢键磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶别名：别名：操作环境：操作环境：原理：原理：操作水平：操作水平：结果：结果： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过并通过体外体外DNADNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在和生物产品。由于基因工程是在DNADNA分子水平上分子水平上进行设进行设计
2、和施工的，因此计和施工的，因此又叫做又叫做DNADNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因重组基因重组DNA分子水平分子水平定向定向地改造生物的遗传性状，获得地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。人类所需要的品种。基因工程的概念：基因工程的概念：基因工程的产物基因工程的产物普通棉花普通棉花普通棉花普通棉花抗虫棉抗虫棉抗虫棉抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫基因无抗虫基因) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载
3、体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )转基因棉花植株转基因棉花植株 1 .1、DNADNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具“分子手术刀分子手术刀”-“分子缝合针分子缝合针”-“分子运输车分子运输车”-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶运运载体载体 1、简称：简称：2、分布：、分布：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”主要在主要在原核生物原核生物中中限制酶限制酶寻根问底寻根问底(P4)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是
4、什么吗？ 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限限制酶制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到核生物中主要起到切割外源切割外源DNA、使之失效使之失效，从而达到从而达到保护自身保护自身的目的的目的。限制酶在原核生物中的作用限制酶在原
5、核生物中的作用3、特点、特点:一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”识别特定核苷酸列识别特定核苷酸列,特定位点特定位点切割切割（专一性）（专一性）断裂：断裂：磷酸二酯键磷酸二酯键限制酶的识别特点限制酶的识别特点以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列上碱基呈反向对称，重复排列如：如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCCEcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端GobackGoback什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它
6、们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端作用：作用：结果：结果：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”切割切割DNA产生黏性未端和平末端产生黏性未端和平末端3、特点、特点:4、作用：、作用：5、结果：、结果：1、简称：、简称：2、分布：、分布：工具工具1：限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶主要在主要在原核生物原核生物中中限制酶限制酶识别特定核苷酸列识别特定核苷酸列,切割特定切点切割特定切点（专一性）（专一性）切割切割DNA产生黏性未端或平末端产生黏性未端或平末端要想获得某个特定性状的
7、基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。思考思考? ?GobackGobackGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTT
8、AAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因
9、片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G酶切酶切酶切酶切思考与探究思考与探究 P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，含有某种限制酶的通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限制这种限制酶的酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基化酶，或者通过甲基
10、化酶将将甲基转移甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制限制酶不能将其切开酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的某种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，被切断，并且可以防止外源并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 1、作用、作用: 把把DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA，2、作用原理：、作用原理：催催化化磷磷酸酸二二酯酯键键形形成成,不是氢键不是氢键二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间
11、的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶3、类型：、类型：EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和 平末端平末端平末端平末端寻根问底寻根问底(P6)DNA连
12、接酶与连接酶与DNA聚合酶聚合酶是一回事吗是一回事吗?为什么为什么?将将单个核苷酸单个核苷酸连接到连接到已有的核酸片段上，已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键作用作用对象对象DNA复制复制基因重租基因重租4、 DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶比较聚合酶比较3、类型类型Ecoli DNA 连接酶连接酶 来源：大肠杆菌来源：大肠杆菌作用特点：只连接作用特点：只连接黏性末端黏性末端 T4DNA 连接酶连接酶 来源：来源：T4噬菌体噬菌体作用特点：连接作用特点：连接黏性末端和平末端黏性末端和平末端 2、作用原理：、作用原理
13、：催化催化磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成1、作用、作用: ：工具2：DNA连接酶 把把DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA，4、 DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶比较聚合酶比较 P7. P7.思考与讨论：思考与讨论：限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNADNA片段片段: :你是否能你是否能用用DNADNA连接酶将它们连接起来？连接酶将它们连接起来？ CTGCAGACTGCGGCGCTTAAGACGTCGCCGGTCAAATTCG和和能连接形成能连接形成ACTGGTCA和和能连
14、接形成能连接形成GCTTAAAATTCGCGGCGCCG和和能连接形成能连接形成和和能连接形成能连接形成CTGCAGGACGTC反反向向对对称称4、DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？ 迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都连接酶都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链接单链DNA的酶。的酶。思考与探究思考与探究 P7 1、载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中复制复制或整合到受体细胞或整合到受体细胞的的染色体染色体
15、DNADNA上复制上复制具有一至多个具有一至多个限制酶切点限制酶切点，以便与，以便与 外源基因连接外源基因连接具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行筛选。，便于进行筛选。对受体细胞无害对受体细胞无害 三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”2、常用的载体：、常用的载体：质粒（最常用质粒（最常用) ) 噬菌体的衍生物，噬菌体的衍生物， 动植物病毒等动植物病毒等能能能能复制复制复制复制并带着并带着并带着并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有有有有切割位点切割位点切割位点切割位点有有有有标记基因标记基
16、因标记基因标记基因3、质粒、质粒本质：小型本质：小型本质：小型本质：小型环状环状DNA分子。分子。分布：许多细菌分布：许多细菌分布：许多细菌分布：许多细菌工具工具3 3：运载体：运载体1 1、需要的条件、需要的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制有某些标记基因，便于筛选 对受体细胞无害2 2、常用运载体、常用运载体： 质粒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物或某些动植物病毒3、质粒 3、天然的、天然的DNA分子可以直接用做基因工分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？程载体吗？为什么？ 不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定不可以，作为基因工程使
17、用的载体必需满足一定不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件条件条件条件, ,且且且且都都都都要进行人工要进行人工要进行人工要进行人工改造后改造后改造后改造后才能用于基因工程操作。才能用于基因工程操作。才能用于基因工程操作。才能用于基因工程操作。思考与探究思考与探究 P71、在基因工程中，切割运载体和、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需使片段，需使用（用（）A.同种限制酶同种限制酶B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶D.两种连接酶两种连接酶反馈练习：反馈练习：2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是、不
18、属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD3 3、下列不适合用于基因工程的运载体、下列不适合用于基因工程的运载体是（是（ ） A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒选选我我C4、下列说法正确的是、下列说法正确的是：（：（ ） A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶
19、、运载体连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为进行大量复制的过程可称为“克隆克隆”选选我我D审题审题5、以下是两种限制酶切割后形成的、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接连接酶通常是酶通常是 。 （2） 和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两
20、者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常片段，所用的连接酶通常是是 。反馈练习：反馈练习：再见再见1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现2)工具酶的发现工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为可能技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年年罗罗思思和和赫赫林林斯斯基基发发现现细细菌菌质质粒粒有有自自我我复复制制能能力力,为基因转移为基因转移找到一种运载工具找到一种运载工具.1970年年阿阿尔尔伯伯(W.Arber)、内内森森斯斯(D,Nathans)、史史密密斯斯(H.C.Smith)细菌中细菌中发现了第一个限制酶发现了第一个限制酶197
21、7年科学家又年科学家又发明了发明了DNA序列分析方法序列分析方法1965年桑格年桑格发明了氨基酸序列分析技术发明了氨基酸序列分析技术4)DNA体外重组的实现体外重组的实现1972年年伯伯格格(P.Berg)首首先先在在体体外外进进行行了了DNA改改造造的的研研究究,成成功功地地构构建建了了第第一个人工体外重组一个人工体外重组DNA分子分子.1973年年博博耶耶和和科科恩恩使使重重组组DNA转转入入大大肠肠杆杆菌菌中中,转转录录出出相相应应的的mRNA,并并使使外外源源基基因因可可以以在在原原核核细细胞胞中中成成功表达功表达,至此表明至此表明基因工程正式问世基因工程正式问世.1973年科学家才将
22、质粒作为基因的载体使用年科学家才将质粒作为基因的载体使用这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验1973年科恩第一个建成年科恩第一个建成“基因工程菌基因工程菌”，并创，并创立基因工程模式立基因工程模式1973年称这年称这“基因工程元年基因工程元年”，科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术专利技术5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功1980年第一个转基因小鼠问世年第一个转基因小鼠问世1982年年采采用用显显微微注注射射技技术术培培养养目目出出”超超级级小小鼠鼠”1983年培育出第一例转基因烟草年培育出第一例转基因烟草1988年年穆穆里里斯斯发发明明了了PCR技技术术,使使基基因因工工程程技技术术得得到到了了进进一一步步的的发发展展和和完完善善.获获1993年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖1993年年中中国国农农业业科科学学院院的的科科学学成成功功之之路路地地培培育育出出抗抗棉铃虫的转基因抗虫棉棉铃虫的转基因抗虫棉6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明技术的发明结束结束
