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1、生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用n生物技术的概念生物技术的概念n在植物病理学中应用的生物技术在植物病理学中应用的生物技术生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用n什么是生物技术？什么是生物技术？我们的祖先早就在几千年前就已经学会利用发酵、酿酒、制酱、我们的祖先早就在几千年前就已经学会利用发酵、酿酒、制酱、育种等传统生物技术，但是当代概念的生物技术与之有着根本的育种等传统生物技术，但是当代概念的生物技术与之有着根本的区别。当代生物技术是应用现代生物科学及某些工程原理，利用区别。当代生物技术是应用现代生物科学及某些工程原理，利用生
2、命有机体（从微生物到高级动物）及其组成（含器官组织、细生命有机体（从微生物到高级动物）及其组成（含器官组织、细胞、细胞器甚至基因）来发展新产品或新工艺的一种技术体系。胞、细胞器甚至基因）来发展新产品或新工艺的一种技术体系。从严格的意义上讲，生物技术是以生命科学为基础，利用生物的从严格的意义上讲，生物技术是以生命科学为基础，利用生物的特性或功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与特性或功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的综合性技术工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的综合性技术领域。领域。 从下个世纪人类面临的能源、食
3、品和环境三大危机来看，生物技从下个世纪人类面临的能源、食品和环境三大危机来看，生物技术具有巨大潜势。术具有巨大潜势。 生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用n在植物病理学中应用的生物技术在植物病理学中应用的生物技术组织培养脱毒技术组织培养脱毒技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术转基因抗病植物转基因抗病植物生物技术在植物病理学中的应用组织培养脱毒技术基本程序n无菌条件下取茎尖或根尖无菌条件下取茎尖或根尖0.5mm0.5mm分生组织，分生组织，至培养基上培养成试管苗至培养基上培养成试管苗nELISAELISA检测是否带毒检测是否带毒n将无毒苗切段快繁将无毒
4、苗切段快繁n经练苗后移栽防虫网室内经练苗后移栽防虫网室内n长成后收集微型薯长成后收集微型薯生物技术在植物病理学中的应用组织培养脱毒技术n马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8 8个技术要点个技术要点茎尖培养试管苗茎尖培养试管苗试管苗病毒检测试管苗病毒检测试管苗的切段快繁试管苗的切段快繁培养瓶选择合适的封口塑料培养瓶选择合适的封口塑料改善光质条件改善光质条件注意培养室温度控制和经常消毒注意培养室温度控制和经常消毒选择生长健壮的脱毒苗作为扩繁材料选择生长健壮的脱毒苗作为扩繁材料使用使用B B9 9培养壮苗培养壮苗生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之一个技术
5、要点之一n茎尖培养试管苗茎尖培养试管苗取健康薯在室内催芽（取健康薯在室内催芽（38for 14dfor 14d），无菌条），无菌条件下剥取带件下剥取带1-2个叶原基的生长点，接种到培养个叶原基的生长点，接种到培养基上，培养温度基上，培养温度21-25 ，200Lx200Lx。n培养基配方：培养基配方：MS+6-MS+6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA6-BA）0.05mg/L+0.05mg/L+萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）0.1mg/L+0.1mg/L+赤霉素（赤霉素（GA3GA3）0.1mg/L+3%0.1mg/L+3%蔗糖蔗糖生物技术在植物病理学中的应用植物组织培养流程植物组织培养流程
6、生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之二个技术要点之二n试管苗病毒检测试管苗病毒检测聚丙烯凝胶电泳法聚丙烯凝胶电泳法- -检测纺锤块茎类病毒检测纺锤块茎类病毒酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法- -检测检测PVXPVX、PVYPVY等病毒等病毒指示植物接种法指示植物接种法- -辅助方法辅助方法生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之三个技术要点之三n试管苗的切段快繁试管苗的切段快繁采用简化的采用简化的MSMS培养基培养基n成分：大量元素、微量元素、铁盐、成分：大量元素、微量元素、铁盐、3
7、%3%食用白糖、食用白糖、琼脂和自来水。琼脂和自来水。n该培养基的优点：该培养基的优点：6-8d6-8d即可生根，叶芽萌发率高，即可生根，叶芽萌发率高，植株健壮。植株健壮。生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之四个技术要点之四n培养瓶选择合适的封口塑料培养瓶选择合适的封口塑料- -聚丙烯制成的聚丙烯制成的耐高压盖子耐高压盖子生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之四个技术要点之四n培养瓶选择合培养瓶选择合适的封口塑料适的封口塑料- -聚丙烯制成聚丙烯制成的耐高压盖子的耐高压盖子生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培
8、养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之五个技术要点之五n改善光质条件改善光质条件尽量利用散射尽量利用散射光，即将培养光，即将培养室建成玻璃温室建成玻璃温室状室状生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之六个技术要点之六n注意培养室温度注意培养室温度控制和经常消毒控制和经常消毒室温室温20-2520-25为为宜，宜，26 26 顶部顶部易烧苗，易烧苗，33 33 瓶苗停止生长。瓶苗停止生长。培养室经常用福培养室经常用福尔马林和高锰酸尔马林和高锰酸钾熏蒸消毒，每钾熏蒸消毒，每7d7d一次。一次。生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个
9、技术要点之七个技术要点之七n选择生长健壮选择生长健壮的脱毒苗作为的脱毒苗作为扩繁材料扩繁材料健壮的试管苗健壮的试管苗转接后，生长转接后，生长整齐健壮，繁整齐健壮，繁殖效率高，可殖效率高，可形成良性循环。形成良性循环。生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒马铃薯组织培养脱毒8个技术要点之八个技术要点之八n使用使用B9培养壮苗培养壮苗脱毒苗移栽前的脱毒苗移栽前的最后一次转接，最后一次转接，可在可在MSMS简化培养简化培养基中加入生长延基中加入生长延缓剂缓剂B B9 910-15mg/L10-15mg/L，加，加B B9 9的脱毒苗的脱毒苗生长健壮，节间生长健壮，节间短，叶色深绿，短，叶色深
10、绿，移栽成活率高。移栽成活率高。生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组培苗的练苗移栽 n试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。入自然环境，必须进行炼苗。n一般移植前，先将培养容器打开，于室内一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放自然光照下放3 3天，然后取出小苗，用自来天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。准备好的基质中，基质使用前最好消毒。n移栽前要适当遮荫，保持较高的空气湿度。移栽前要适当遮荫，保持较高的空气湿度。 生物技术在植物
11、病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒苗移栽到温室马铃薯组织培养脱毒苗移栽到温室生物技术在植物病理学中的应用马铃薯组织培养脱毒生产的微型薯马铃薯组织培养脱毒生产的微型薯返回生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术n免疫反应原理免疫反应原理当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限。此外
12、，要把这法制备抗体效率低、产量有限。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。些不同的抗体分开也极困难。单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。突破。 生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术n单克隆抗体的基本概念单克隆抗体的基本概念 抗体主要由抗体主要由B B淋巴细胞合成。每个淋巴细胞合成。每个B B淋巴细胞有合成一淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的动物脾脏有上百万种不同的B B淋巴细胞系，含遗传基因淋巴细胞系，含遗传基因不同的不同的B B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激淋巴细胞合成不
13、同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的基因的B B细胞产生抗体。细胞产生抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。隆抗体。 生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术n基本原理基本原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克要制备单克隆抗体需先
14、获得能合成专一性抗体的单克隆隆B B淋巴细胞，但这种淋巴细胞，但这种B B淋巴细胞不能在体外生长。淋巴细胞不能在体外生长。实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有细胞的特性，它既具有B B淋巴细胞合成专一抗体的特性，淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来
15、源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下：其制备原理示意如下： 生物技术在植物病理学中的应用dcbad抗原决定簇抗原决定簇动物免疫动物免疫骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B淋巴细胞淋巴细胞细胞融合细胞融合abc杂种骨髓瘤细胞杂种骨髓瘤细胞选选a融合细胞克隆化培养融合细胞克隆化培养抗原抗原abaaaacd生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术n制备单克隆抗体的主要步骤制备单克隆抗体的主要步骤抗原制备抗原制备
16、 动物免疫动物免疫免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备 细胞融合细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化单克隆抗体的检定单克隆抗体的检定 分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的大量生产杂交瘤细胞系的冻存杂交瘤细胞系的冻存生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-抗原制备抗原制备n细菌细胞抗原的制备细菌细胞抗原的制备 生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-抗原制备抗原制备n可溶性抗原制备可溶性抗原制备
17、离心分离法离心分离法 盐析法盐析法 分子筛效应分子筛效应 离子交换色谱离子交换色谱 生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-抗原制备抗原制备n半抗原免疫原的制备半抗原免疫原的制备多糖、多肽、甾体激素、脂多糖、多肽、甾体激素、脂肪酸、类脂质、核苷酸、药肪酸、类脂质、核苷酸、药物（包括抗生素）以及其他物（包括抗生素）以及其他化学物品化学物品 载体有蛋白质类，多肽聚合载体有蛋白质类，多肽聚合物，大分子聚合物和某些颗物，大分子聚合物和某些颗粒。常用的蛋白有粒。常用的蛋白有BSA,HSA,多肽有多聚赖氨多肽有多聚赖氨酸（酸（poly-L-lysine） 青霉素半抗原的制备生物技术在植物
18、病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-动物免疫动物免疫n颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。得很好的免疫效果。 初次免疫初次免疫 110 1100.5ml (0.5ml (腹腔内注射腹腔内注射) )2-32-3周后周后第二次免疫第二次免疫 110 1100.5ml (0.5ml (腹腔内注射腹腔内注射) ) 3 3周后周后加强免疫加强免疫( (融合前三天融合前三天)110)1100.5ml ip0.5ml ip或或 iv( iv(静脉内注射静脉内注射) )取脾细胞融合取脾细胞融合生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术
19、-动物免疫动物免疫n可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。 初次免疫初次免疫 Ag Ag1-50g1-50g加福氏完全佐剂皮下多点注射加福氏完全佐剂皮下多点注射( (一般一般0.8-1ml0.8-1ml0.2ml0.2ml点点) )33周后周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ipip(ip(ip剂量不宜超过剂量不宜超过0.5ml)0.5ml)33周后周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ipip (5-7
20、 (5-7天后采血测其效价，检测免疫效果天后采血测其效价，检测免疫效果) )2-32-3周后周后加强免疫，剂量加强免疫，剂量50-500g50-500g为宜，为宜，ipip或或iviv33天后天后取脾细胞融合取脾细胞融合将可溶性抗原颗粒化或固相化，增强了抗原的免疫原性，同时降低抗原的使用量。将可溶性抗原颗粒化或固相化，增强了抗原的免疫原性，同时降低抗原的使用量。直接采用脾内注射。直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平。生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-细胞融合细胞融合n将骨
21、髓瘤细胞与脾细胞按将骨髓瘤细胞与脾细胞按110110或或1515的比例混合在一起，用的比例混合在一起，用不完全培养液洗不完全培养液洗1 1次，次，1200rpm1200rpm离心离心8 8分钟。分钟。n弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEGPEG的浓度。的浓度。n轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。n在室温下融合在室温下融合: :3030秒内加入预热的秒内加入预热的1ml451ml45PEG4000,PEG4000,含含5 5DMSODMSO，边加边搅，边加边搅拌。拌。作用作用9090秒钟，若冬天室温较低时可延长至
22、秒钟，若冬天室温较低时可延长至120120秒钟。秒钟。加预热的不完全培养液，终止加预热的不完全培养液，终止PEGPEG作用，每隔分钟分别加作用，每隔分钟分别加入入1ml1ml，2ml2ml，3ml3ml，4ml4ml，5ml5ml和和10ml10ml。n离心，离心，800rpm800rpm，6 6分钟。分钟。n弃上清，先用弃上清，先用6ml6ml左右左右2020小牛血清小牛血清RPMI1640RPMI1640轻轻混悬，切记轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。n根据所用根据所用9696孔培养板的数量，补加完全培养液，孔培养板的数量，补
23、加完全培养液，10ml10ml一块一块9696孔板。孔板。n将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的9696孔板，孔板，100l100l孔，孔，3737、5 5COCO2 2孵箱培养。孵箱培养。生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-选择杂交瘤选择杂交瘤nHAT HAT 选选择择培培养养液液：次次黄黄嘌嘌呤呤（H H）核核苷苷酸酸前前体体，使使cellcell通通过过替替代代途途径径合合成成DNA DNA ；氨氨基基蝶蝶呤呤（A A）叶叶酸酸拮拮抗抗物物，阻阻断断cellcell合合成成DNADNA的的主主要要途途径径 ；胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷（
24、T T）使使cellcell通过替代途径合成通过替代途径合成DNA DNA n在在HATHAT培培养养液液中中，未未融融合合的的骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞因因缺缺乏乏次次黄黄嘌嘌呤呤- -鸟鸟嘌嘌呤呤- -磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶，不不能能利利用用补补救救途途径径合合成成DNADNA而而死死亡亡。 未未融融合合的的淋淋巴巴细细胞胞虽虽具具有有次次黄黄嘌嘌呤呤- -鸟鸟嘌嘌呤呤- -磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶，但但其其本本身身不不能能在在体体外外长长期期存存活活也也逐逐渐渐死死亡亡。 只只有有融融合合的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞由由于于从从脾脾细细胞胞获获得得了了次次黄黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤磷磷酸酸
25、核核糖糖转转移移酶酶，并并具具有有骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞能能无无限限增增殖殖的的特特性性，因此能在因此能在HATHAT培养基中存活和增殖。培养基中存活和增殖。 n一一般般选选择择HATHAT选选择择培培养养液液维维持持培培养养两两周周后后，改改用用HTHT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。生物技术在植物病理学中的应用单克隆抗体技术单克隆抗体技术-杂交瘤阳性克隆的杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆筛选与克隆 n在在HATHAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进泌预定特异性单克隆
26、抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。行筛选和克隆化。n通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。养。n采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。克隆扩增。n经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。及其分子量后，及时进行冻存。 生物技术在植物病理学中的应用单克
27、隆抗体技术单克隆抗体技术-抗体的检测n一般在杂交瘤细胞布满孔底一般在杂交瘤细胞布满孔底1 11010面积时，即可开始检测特异性抗体，面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。筛选出所需要的杂交瘤细胞系。n检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有常用的方法有: :ELISAELISA（酶联免疫吸附测定）用于可溶性抗原（酶联免疫吸附测定）用于可溶性抗原( (蛋白质蛋白质) )、细胞和病、细胞
28、和病毒等毒等McAbMcAb的检测。的检测。RIARIA（ 放射免疫性鉴定）用于可溶性抗原、细胞放射免疫性鉴定）用于可溶性抗原、细胞McAbMcAb的检测。的检测。FACS(FACS(荧光激活细胞分类仪荧光激活细胞分类仪) ) 用于检查细胞表面抗原的用于检查细胞表面抗原的McAbMcAb检测。检测。IFAIFA（免疫荧光分析）用于细胞和病毒（免疫荧光分析）用于细胞和病毒McAbMcAb的检测。的检测。n可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。时机。生物技术在植物病理学中的应用酶联免疫吸附测定-ELISA生物技
29、术在植物病理学中的应用Indirect-ELISA操作过程操作过程 n包包被被抗抗原原(Ag)(Ag) 每每孔孔100100微微升升，每每样样品品两两次次重重复复，以以碳碳酸酸缓缓冲冲液液为为空空白白对对照照，设设正正负负对对照照。3737下下包包被被2 2小小时时，然然后后用用PH PH 7.4 7.4 PBSTPBST缓缓冲冲液液冲冲洗洗3535次次，注注意意避避免免各各孔孔互互混，每次冲洗至少混，每次冲洗至少5 5分钟。分钟。抗抗原原稀稀释释液液为为pH9.6pH9.6碳碳酸酸缓缓冲冲液液：1L1L蒸蒸馏馏水水中中加加NaNa2 2COCO3 3 1.59g 1.59g，NaHCONaH
30、CO3 3 2.93g 2.93g，NaNNaN3 3 0.2g 0.2g。pH7.4 pH7.4 PBSTPBST洗洗涤涤缓缓冲冲液液：NaCl NaCl 8g8g，KHKH2 2PO4 PO4 0.2g0.2g，NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O O 2.9g2.9g， KCl KCl 0.2g0.2g， NaNNaN3 3 0.2g0.2g，distilled water 1Ldistilled water 1L，Tween 20 0.5mlTween 20 0.5ml，NaNNaN3 3 0.2g 0.2g。 生物技术在植物病理学中的应用Indirect-ELIS
31、A操作过程操作过程 n加抗血清（加抗血清（AsAs）100100微升微升/ /孔，孔，37 137 1小时，小时，用上述方法冲洗。用上述方法冲洗。抗血清稀释液抗血清稀释液：pH7.4 PBS+2%PVP（砒咯烷酮）（砒咯烷酮）n加酶标物加酶标物100100微升微升/ /孔，孔，37 137 1小时，用上小时，用上述方法冲洗。述方法冲洗。 酶标物稀释液：酶标物稀释液：pH 7.4 PBST，一般稀释倍数为，一般稀释倍数为1：800或或1：1000或或 1：1200，事先可用底物标定，选择合适的酶浓度。，事先可用底物标定，选择合适的酶浓度。 生物技术在植物病理学中的应用Indirect-ELISA
32、操作过程操作过程 n加加底底物物（邻邻苯苯二二胺胺）100100微微升升/ /孔孔，暗暗处处反反应应20302030分钟。分钟。底底物物液液配配制制（现现用用现现配配）：0.1M枸枸橼橼酸酸（无无水水枸枸橼橼酸酸19.2g/L）24.3ml，0.2M磷磷酸酸氢氢二二钠钠(12个个水水磷磷酸酸氢氢二二钠钠71.6g/L或或无无水水磷磷酸酸氢氢二二钠钠28.4g)25.7ml，distilled water 50.0ml混混合合，即即为为100ml PH5.0磷磷酸酸枸枸橼橼酸酸（柠柠檬檬酸酸）缓缓冲冲液液。临临用用前前加加入入邻邻苯苯二二胺胺40mg暗暗处处搅搅动动至至溶溶解解，最最后后加加入入
33、0.15ml 30% H2O2，混混合合后后避避光光保保存存。注注意意配配制制底底物物的的整整个个过过程程需需在在避避光下进行。光下进行。 生物技术在植物病理学中的应用Indirect-ELISA操作过程操作过程 n加加2MH2SO42MH2SO4终止反应终止反应取取98% H2SO4 11ml加蒸馏水加蒸馏水89ml即为即为100ml 2M H2SO4 。n用酶联仪测用酶联仪测490nm490nm下的下的ODOD值。值。生物技术在植物病理学中的应用生物技术在植物病理学中的应用n返回生物技术在植物病理学中的应用转基因抗病育种转基因抗病育种生物技术在植物病理学中的应用转基因抗病育种的基本步骤转基
34、因抗病育种的基本步骤n目的基因的获得目的基因的获得n选择高效的转导方法选择高效的转导方法农杆菌介导法农杆菌介导法基因枪法基因枪法花粉管导入法花粉管导入法n组织培养组织培养n检测检测PCR法法-检测目的基因是否存在检测目的基因是否存在ELISA法法-检测目的基因的表达产物检测目的基因的表达产物-蛋白质蛋白质直接检验：接种病原物直接检验：接种病原物生物技术在植物病理学中的应用PCR-体外扩增DNAn模板模板DNAn引物引物ndNTPnMg 2+nTaqDNA聚合酶聚合酶生物技术在植物病理学中的应用PCR仪生物技术在植物病理学中的应用PCR反应程序设计反应程序设计n9494预变性预变性6min, 9
35、430s;6min, 9430s;使模板使模板DNADNA充分解链充分解链n5252退火退火45s45s，使引物分别连接到，使引物分别连接到33端和端和55端端n72 72 延伸延伸30s30s，在，在TaqDNATaqDNA聚合酶作用下，聚合酶作用下，DNADNA链延链延伸伸n4545个循环后，将获得大量目的个循环后，将获得大量目的DNADNA片断片断n终延伸终延伸727min727min生物技术在植物病理学中的应用PCR生物技术在植物病理学中的应用PCR产物的电泳检测生物技术在植物病理学中的应用影响影响PCR扩增结果的因素扩增结果的因素n模板模板DNA浓度浓度n引物浓度引物浓度ndNTP浓
36、度浓度nMg 2+浓度浓度nTaqDNA聚合酶浓度聚合酶浓度生物技术在植物病理学中的应用模板模板DNA浓度对扩增的影响浓度对扩增的影响 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M：DL2000marker；1-9： DNA用量10ng、20ng、30ng、50ng、100ng、 200ng、 300ng、 400ng、 500ng生物技术在植物病理学中的应用Mg2+浓度对扩增的影响浓度对扩增的影响 M 1 2 3 4 5 6 7 M：DL2000marker；1-7：Mg2+浓度0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM 生物技术在植物病理学中的应用dNTP浓度对扩增的影响浓度对扩增的影响 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M：DL2000marker；1-9： dNTP浓度0.1mM、0.15mM、 0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM生物技术在植物病理学中的应用TagDNA聚合酶浓度对扩增的影响聚合酶浓度对扩增的影响 M 1 2 3 4 5 6 7 M：DL2000marker； 1-7 ：Tag DNA聚合酶浓度0.5U、1U、1.5U、2U、3U、4U、5U 生物技术在植物病理学中的应用
