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1、第三章第三章 分子克隆工具酶分子克隆工具酶第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 甲基化酶甲基化酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶一、限制与修一、限制与修饰二、限制二、限制酶酶识别的序列的序列三、限制三、限制酶酶产生的末端生的末端四、四、线性性DNA末端末端对酶酶切的影响切的影响五、五、酶酶切反响条件切反响条件六、六、酶酶切位点的引入切位点的引入一、限制与修饰一、限制与修饰 细菌的限制与修饰系统细菌的限制与修饰系统(R/M(R/M系统系统) )由由限限制制酶酶限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶和和
2、修修饰饰酶酶甲甲基基化化酶组成。酶组成。R R / / M M系系统统的的作作用用：维维护护本本身身的的DNADNA不不受受切切割割；破破坏坏外源外源DNADNA使之迅速降解。使之迅速降解。 噬菌体在不同宿主中的转染频率。见噬菌体在不同宿主中的转染频率。见p17p17实实验验阐阐明明：K K菌菌株株和和B B菌菌株株中中存存在在一一种种限限制制造造 用，可排除外来的用，可排除外来的DNA.DNA.限制酶降解外源限制酶降解外源DNA，维护宿主遗，维护宿主遗传稳定的维护机制传稳定的维护机制识别本身遗传识别本身遗传物质和外来遗物质和外来遗传物质传物质AN6-MeAC5-MeC限制酶的发现限制酶的发现
3、 美美国国约约翰翰. .霍霍布布金金斯斯大大学学的的H.SmithH.Smith于于19701970年年偶偶尔尔发发现现，流流感感嗜嗜血血杆杆菌菌(Haemophilus (Haemophilus influenzae)influenzae)能能迅迅速速降降解解外外源源的的噬噬菌菌体体DNADNA，其其细细胞胞提提取取液液可可降降解解E.coli E.coli DNADNA，但但不不能能降降解解本本身身DNADNA，从从而而找找到到Hind Hind IIII限制性内切酶。限制性内切酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction (restriction endonuclease
4、)endonuclease)是是一一类类能能识识别别双双链链DNADNA中中特特殊殊核核苷苷酸酸序序列列，并并使使每每条条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。限制酶的生物学功能限制酶的生物学功能用用来来维维护护宿宿主主不不受受外外来来DNADNA的的感感染染，可可降降解解外外来来的的DNADNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。，从而阻止其复制和整合到细胞中。限制酶的种类限制酶的种类型酶型酶 (种类很少，只占种类很少，只占1%)三三亚亚基基双双功功能能酶酶，分分子子量量较较大大，反反响响需需Mg2+、ATP有特异识别位点但没有特异切割位点有特异
5、识别位点但没有特异切割位点型酶型酶 (占占90%以上以上)分子量较小，反响只需分子量较小，反响只需Mg2+；识识别别位位点点是是一一个个回回文文对对称称构构造造，切切割割位位点点在在回回文文对对称构造上；称构造上；多数多数型酶切割型酶切割DNA后构成粘性末端后构成粘性末端 型酶型酶 (种类更少，不到种类更少，不到1%)二二亚亚基基双双功功能能酶酶，能能识识别别特特定定顺顺序序，在在该该顺顺序序的的3端端2426 bp处切开处切开DNA，切割位点没有特异性。，切割位点没有特异性。 限制酶的命名原那么限制酶的命名原那么第第1 1个字母：大写，来自微生物属名第个字母：大写，来自微生物属名第1 1个字
6、母个字母第第2 2和和3 3字母：小写，来自微生物种名前两个字母字母：小写，来自微生物种名前两个字母其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号其它字母：大写或小写，来自微生物菌株号 罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号罗马数字：该菌株发现的限制酶的编号例例：EcoR EcoR I I 来来源源于于Escheria Escheria coli coli RY13RY13的的第第一一个个限制酶，其识别序列为：限制酶，其识别序列为：GAATTCGAATTC； 二、限制酶识别的序列二、限制酶识别的序列识别序列的长度识别序列的长度普通为普通为4848个碱基，最常见的为个碱基，最常见的为6 6个碱基个碱基. .
7、4 bp4 bp识别序列：识别序列：Sau3AI GATCSau3AI GATC5 bp5 bp识别序列：识别序列：EcoR CCWGG (W=A/T)EcoR CCWGG (W=A/T)6 bp6 bp识别序列：识别序列：EcoR GAATTCEcoR GAATTC7 bp7 bp识别序列：识别序列：BbvCI CCTCAGCBbvCI CCTCAGC8 bp8 bp识别序列：识别序列：NotI GCGGCCGCNotI GCGGCCGC当当DNADNA中可识别的序列在完全随机的情况下：中可识别的序列在完全随机的情况下：识识别别序序列列为为4 4个个碱碱基基时时，平平均均每每256256个个
8、(44)(44)碱碱基基中中会会出现一个识别位点；出现一个识别位点；识识别别序序列列为为6 6个个碱碱基基时时，平平均均每每40964096个个(46)(46)碱碱基基中中会出现一个识别位点。会出现一个识别位点。识别序列的构造识别序列的构造大大多多数数为为回回文文对对称称构构造造，切切割割位位点点在在DNADNA两两条条链链相相对称的位置。对称的位置。限制酶切割的位置限制酶切割的位置大多数在识别序列的内部，如大多数在识别序列的内部，如EcoRIEcoRI、SmaISmaI等；等；但但也也有有在在外外部部的的：有有两两端端、两两侧侧和和单单侧侧之之分分，如如Sau3AI (GATC)Sau3AI
9、 (GATC)。三、限制酶产生的末端三、限制酶产生的末端限制酶产生黏性末端限制酶产生黏性末端在在对对称称轴轴55侧侧切切割割底底物物，DNADNA双双链链交交错错断断开开产产生生55突出黏性末端，如突出黏性末端，如 EcoR I EcoR I；在在33侧侧切切割割，那那么么产产生生33突突出出黏黏性性末末端端，如如Pst Pst I I；限制酶产生平末端限制酶产生平末端在在回回文文对对称称轴轴上上同同时时切切割割DNADNA两两条条链链，产产生生平平末末端端，如如HpaHpa。限制酶产生非对称突出末端限制酶产生非对称突出末端当当识识别别序序列列为为非非对对称称序序列列时时，切切割割的的DNAD
10、NA产产物物的的末末端是不同的，如端是不同的，如BbvCBbvC的识别切割位点如下：的识别切割位点如下： CCTCAGCCCTCAGC GGAGTCG GGAGTCG同裂酶：识别一样序列的限制酶称为同裂酶。同裂酶：识别一样序列的限制酶称为同裂酶。同序同切酶：识别序列和切割位置都一样同序同切酶：识别序列和切割位置都一样HpaHpa与与MspMsp识别切割位点为识别切割位点为CCGGCCGGMobMob与与Sau3ASau3A识别切割位点为识别切割位点为GATCGATC同序异切酶：识别序列一样，但切割位点不同同序异切酶：识别序列一样，但切割位点不同KpnKpn：GGTACCGGTACCAcc65A
11、cc65：G GTACCG GTACC“同同工工多多位位酶酶：识识别别简简并并序序列列的的限限制制酶酶包包含含了了另另一种限制酶的功能。一种限制酶的功能。EcoR IEcoR I：GAATTCGAATTCApo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T)Apo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T)同尾酶同尾酶可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。同尾酶切割同尾酶切割DNADNA得到的产物可进展互补衔接。得到的产物可进展互补衔接。EcoREcoR： GAATTC GAATTCApo I: RAATTYApo I: RAATTYMfe I
12、: CAATTCMfe I: CAATTC稀切酶稀切酶有有较较长长的的识识别别序序列列和和富富含含GCGC或或ATAT的的识识别别序序列列的的限限制制酶称为稀切酶。酶称为稀切酶。在基因操作中运用稀切酶可以获得大的片段。在基因操作中运用稀切酶可以获得大的片段。四、线性四、线性DNA末端对酶切的影响末端对酶切的影响DNA末端长度的影响末端长度的影响限限制制酶酶切切割割DNA时时，识识别别序序列列两两端端必必需需有有一一定定数数量量的核苷酸，否那么难以发扬切割活性。的核苷酸，否那么难以发扬切割活性。普普通通在在识识别别序序列列末末端端有有3 4个个碱碱基基对对时时能能满满足足常常规规的的酶切需求。酶
13、切需求。位点偏爱位点偏爱(site preference)(site preference)某某些些限限制制酶酶对对不不同同位位置置的的同同一一识识别别序序列列表表现现出出不不同同的切割效率，这种景象称作位点偏爱。的切割效率，这种景象称作位点偏爱。pBR322pBR322质质粒粒上上有有4 4个个NarNar位位点点，在在规规范范条条件件下下1 1单单位位NarNar可可在在1h1h内内将将2 2个个位位点点完完全全切切割割，但但另另外外2 2个个位点在位点在5050单位单位16h16h内也不能切割完全。内也不能切割完全。呵斥位点偏爱的缘由呵斥位点偏爱的缘由在切割在切割DNADNA之前需求同时
14、与之前需求同时与2 2个识别位点作用；个识别位点作用；在在要要切切割割的的DNADNA序序列列上上有有两两个个明明显显不不同同的的结结合合位位点点，其中一个是为其中一个是为DNADNA切割时激活另一个的变构位点。切割时激活另一个的变构位点。五、酶切反响条件缓冲液缓冲液包括包括Tris-HClTris-HCl、Mg2+Mg2+、DTTDTT、BSA(BSA(小牛血清蛋白小牛血清蛋白) )限限制制酶酶缓缓冲冲液液按按离离子子强强度度的的差差别别分分为为高高、中中、低低3 3种类型种类型H Buffer (100 mM NaCl)H Buffer (100 mM NaCl)；M Buffer (50
15、 mM)M Buffer (50 mM)；L Buffer (0 mM)L Buffer (0 mM)反响温度：大多数为反响温度：大多数为37 37 反响时间：通常为反响时间：通常为1h1h或更多或更多终止酶切的方法：终止酶切的方法：10 mM EDTA10 mM EDTA；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质；加热失活；苯酚抽提除去蛋白质 星星活性星星活性在在极极端端非非规规范范条条件件下下，限限制制酶酶能能切切割割与与识识别别序序列列类类似的序列，这个改动的特殊性称星星活性。似的序列，这个改动的特殊性称星星活性。引起星星活性的缘由引起星星活性的缘由甘油浓度高甘油浓度高5%5%酶过量酶过量100 U
16、/l 100 U/l 离子强度低离子强度低25 mM25 mMpHpH值过高值过高8.0 8.0 加了有机溶剂，如乙醇等加了有机溶剂，如乙醇等降低星星活性的措施降低星星活性的措施减减少少甘甘油油浓浓度度；减减少少酶酶用用量量；中中性性pHpH；提提高高盐盐浓浓度度；反反响响体体系系中中无无有有机机溶溶剂剂；保保证证运运用用Mg2+Mg2+作作为为2 2价价阳阳离子离子六、酶切位点的引入将将产产生生的的55突突出出末末端端补补平平后后，再再衔衔接接可可产产生生新新的的酶酶切切位点位点同尾末端的衔接同尾末端的衔接平末端衔接平末端衔接 第二节第二节 甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶 (methyla
17、se) (methylase) 的概念的概念甲甲基基化化酶酶是是作作为为限限制制与与修修饰饰系系统统中中的的一一员员，用用于于维维护宿主护宿主DNADNA不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。甲甲基基化化酶酶与与对对应应的的限限制制酶酶识识别别一一样样的的序序列列，在在两两条条链上对某个碱基进展甲基化。链上对某个碱基进展甲基化。甲基化酶的种类甲基化酶的种类 在在E.coliE.coli中中，大大多多数数都都有有3 3个个位位点点特特异异性性的的DNADNA甲甲基基化酶化酶DamDam甲基化酶甲基化酶可在可在GATCGATC序列中腺嘌呤序列中腺嘌呤N6N6位置上引入甲基位置上引入甲基当
18、当需需求求在在敏敏感感位位点点上上完完全全切切割割DNADNA时时，可可利利用用dam- dam- E.coliE.coli扩增并提取扩增并提取DNADNADcmDcm甲基化酶甲基化酶识识别别CCAGGCCAGG或或CCTGGCCTGG序序列列，在在第第二二个个胞胞嘧嘧啶啶C C 的的C5C5位位置上引入甲基置上引入甲基EcoKEcoK甲基化酶甲基化酶 识识别别AAC(N)6GTGC AAC(N)6GTGC 和和 GCAC(N)6GTT GCAC(N)6GTT 序序列列中中A A的的N6N6位位置置 甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响修饰酶切位点修饰酶切位点HincHinc可可识识别
19、别序序列列GTCGACGTCGAC，甲甲基基化化酶酶 M.TaqM.Taq可可甲甲基基化化 TCGATCGA中中的的A A ，M.TaqM.Taq处处置置DNADNA后后，GTCGAC GTCGAC 将将不受不受 Hinc Hinc切割切割产生新的酶切位点产生新的酶切位点DpnDpn是是依依赖赖甲甲基基化化的的限限制制酶酶，TCGATCGA TCGATCGA 受受 M.TaqM.Taq处处置置后后构构成成甲甲基基化化(A)(A)产产物物 TCG*ATCG*A TCG*ATCG*A ，其中其中 G*ATC G*ATC 即为即为 Dpn Dpn位点。位点。对基因组作图的影响对基因组作图的影响第三节
20、第三节 DNA DNA聚合酶聚合酶一、大一、大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶酶二、二、Klenow DNA聚合聚合酶酶三、三、T4噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶酶四、四、T7噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶酶五、耐五、耐热DNA聚合聚合酶酶六、反六、反转录酶酶七、末端七、末端转移移酶酶DNA聚合酶聚合酶 (DNA polymerase) 的概念的概念催催化化DNA的的合合成成在在具具备备模模板板、引引物物、dNTP等等的的情况下情况下)及其相辅的活性。及其相辅的活性。原核细胞有原核细胞有3种种DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶：催化单链或双链：催化单链或双链DNA的延伸的延伸DNA聚合酶聚合酶：与低分
21、子：与低分子DNA链的延伸有关链的延伸有关DNA聚合酶聚合酶：促进：促进DNA链延伸的主要酶链延伸的主要酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性53外切核酸酶活性外切核酸酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性用途用途在没有在没有dNTP的情况下，外切活性占主导位置；的情况下，外切活性占主导位置；当当存存在在足足够够的的dNTP时时，外外切切活活性性和和合合成成活活性性处处在在动态平衡中，结果使得双链动态平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。成为平末端。利利用用53外外切切核核酸酸酶酶活活性性,可可用用切切口口平平移移法法标标志志DNA。切切口口平平移移法法标标
22、志志DNA，制制备备分分子子杂杂交交探探针针KlenowDNA聚合酶聚合酶由由E.coli DNA聚聚合合酶酶经经蛋蛋白白酶酶裂裂解解后后，除除去去53外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。 功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性用途用途 补平补平DNA的的3凹端凹端 抹平抹平DNA的的3凸端凸端 经过置换反响对经过置换反响对DNA进展末端标志进展末端标志 随机引物标志随机引物标志T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶从从T4噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌培培育育物物中中纯纯化化出出来来的的一一种特殊的种特殊的DNA聚合酶。聚
23、合酶。功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性200倍倍用途用途35外外切切核核酸酸酶酶活活性性强强，且且不不从从单单链链DNA模模板板上上交换引物。在诱变反响中可提高诱变率近一倍。交换引物。在诱变反响中可提高诱变率近一倍。T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶来来源源于于T7噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌，是是由由两两种种严严密密结结合的蛋白质构成的复合体。合的蛋白质构成的复合体。功能功能53DNA聚合酶活性聚合酶活性35外切核酸酶活性外切核酸酶活性1000倍倍运用运用DNA聚聚合合才才干干强强，可可用用于于长长模模板板的的引引物物延延伸伸，在在DNA测序
24、中有优势。测序中有优势。耐热耐热DNA聚合酶聚合酶指指在在高高温温下下具具有有活活性性的的DNA聚聚合合酶酶，来来自自嗜嗜高高温温的的细菌，主要用于细菌，主要用于PCR反响。反响。Taq DNA聚合酶聚合酶Vent DNA聚合酶聚合酶PfuDNA聚合酶聚合酶PwoDNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶(reverse transcriptase)(reverse transcriptase)即即依依赖赖于于RNARNA的的DNADNA聚聚合合酶酶，有有5353合合成成DNADNA活活性性，但是无但是无 35 35外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。 禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒AMVAMV包包含含
25、两两条条多多肽肽链链，具具 53DNA53DNA聚聚合合酶酶活活性性和和很很强强的的RNaseHRNaseH活性，在活性，在4242能有效发扬作用。能有效发扬作用。MoloneyMoloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒M-MuLVM-MuLV单单链链多多肽肽，其其RNaseHRNaseH活活性性弱弱，有有利利于于合合成成较较长长的的cDNAcDNA用用途途：以以mRNAmRNA为为模模板板合合成成cDNA cDNA ；55突突出出DNADNA的的补补平和标志；平和标志；DNADNA测序等。测序等。末端转移酶末端转移酶(terminal transferase)(terminal transfer
26、ase)来来源源于于小小牛牛胸胸腺腺，是是一一种种不不依依赖赖于于模模板板的的DNADNA聚聚合合酶。酶。在在Co2+/Mg2+Co2+/Mg2+存存在在下下，末末端端转转移移酶酶催催化化dNTPdNTP加加于于DNADNA分子的分子的3-OH3-OH端。端。作用作用标志标志DNADNA的的33末端末端在在cDNAcDNA或载体或载体33末端加同聚尾，便于克隆。末端加同聚尾，便于克隆。第四节第四节 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶 一、依一、依赖于于DNA的的RNA聚合聚合酶酶二、二、衔接接酶酶三、三、T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶四、碱性磷酸四、碱性磷酸酶酶五、核酸五、核酸酶酶一、依赖于一
27、、依赖于DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶活性活性即即转转录录中中的的RNARNA合合成成酶酶，识识别别DNADNA中中各各自自特特异异的的启启动动子序列，并沿此子序列，并沿此DNADNA模板起始模板起始RNARNA的合成。的合成。 聚合反响时，无需引物，但需识别特异性位点。聚合反响时，无需引物，但需识别特异性位点。类型类型SP6SP6噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶 ( (来源于感染鼠伤寒沙门氏菌来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2LT2菌株菌株) )T4T4噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶 ( (来源于噬菌体感染的大肠杆菌来源于噬菌体感染
28、的大肠杆菌) )运用：体外合成运用：体外合成RNARNA分子、表达外源基因。分子、表达外源基因。二、衔接酶二、衔接酶(ligase)(ligase)衔衔接接酶酶就就是是将将两两段段核核酸酸衔衔接接起起来来的的酶酶，相相当当于于基基因因工程中的工程中的“糨糊。糨糊。衔接酶的种类衔接酶的种类T4 DNAT4 DNA衔接酶衔接酶 (16 (16反响反响) )活性：催化活性：催化DNA 5-PDNA 5-P与与3-OH3-OH之间构成磷酸二酯键。之间构成磷酸二酯键。反反响响底底物物：黏黏端端、切切口口、平平末末端端的的RNA(RNA(效效率率低低) )或或DNADNA衔接衔接大肠杆菌大肠杆菌DNADN
29、A衔接酶：平末端衔接效率低。衔接酶：平末端衔接效率低。Taq DNATaq DNA衔接酶衔接酶 (4565 (4565反响反响) )衔接双链衔接双链DNADNA中的缺口，不能替代中的缺口，不能替代T4 DNAT4 DNA衔接酶。衔接酶。 T4 RNAT4 RNA衔接酶衔接酶黏黏性性末末端端DNA片片段段的的衔衔接接三、三、T4 T4 多核苷酸激酶多核苷酸激酶T4多多核核苷苷酸酸激激酶酶是是一一种种磷磷酸酸化化酶酶，可可将将ATP的的-磷磷酸基团转移到酸基团转移到DNA或或RNA的的5末端。末端。 分子克隆中呈现分子克隆中呈现2种反响种反响将将ATP的的-磷酸基团转移到无磷酸的磷酸基团转移到无磷
30、酸的DNA5末端末端在在过过量量ATP存存在在的的情情况况下下，可可将将DNA的的5-P转转移移给给ADP，然后，然后DNA从从ATP中获得中获得-磷酸而重新磷酸化。磷酸而重新磷酸化。运用运用对缺乏对缺乏5-P的的DNA进展磷酸化进展磷酸化对对DNA末端进展放射性标志末端进展放射性标志-32P-ATP。四、碱性磷酸酶四、碱性磷酸酶碱碱性性磷磷酸酸酶酶是是一一类类能能催催化化除除去去DNA或或RNA分分子子的的5 磷酸，使末端转换成磷酸，使末端转换成5 -OH的酶。的酶。类型类型牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶CIAP细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶 (BAP)虾碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶 (SAP)用
31、途用途去除去除5-P，防止，防止DNA片段本身衔接片段本身衔接标志标志(5端端)前去除前去除DNA或或RNA的的5-P如何处如何处理质粒理质粒本身衔本身衔接？接？五、核酸酶五、核酸酶 BAL31核酸酶核酸酶具具有有3外外切切核核酸酸酶酶活活性性，可可从从线线性性DNA两两条条链链的的3端端迅速去除单核苷酸。迅速去除单核苷酸。用途用途从从两两头头缩缩短短DNA，用用于于构构建建嵌嵌套套缺缺失失体体；制制造造DNA限制酶切图。限制酶切图。 S1核酸酶核酸酶一种单链核酸酶，降解单链一种单链核酸酶，降解单链DNA或或RNA，产生带，产生带 5-P的单核苷酸或寡核苷酸双链。的单核苷酸或寡核苷酸双链。用途
32、用途DNA黏黏性性末末端端变变为为平平末末端端，翻翻开开双双链链cDNA合合成成中中产产生的发夹环。生的发夹环。核糖核酸酶核糖核酸酶A (RNase A)内切核酸酶，特异攻击内切核酸酶，特异攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端。端。 用途用途去除去除DNA样品中的样品中的RNA 核糖核酸酶核糖核酸酶H (RNaseH)内内切切核核酸酸酶酶，特特异异性性水水解解与与DNA杂杂交交的的RNA上上的的磷磷酸酸二二酯酯键键，产产生生带带有有3-OH和和5-P末末端端的的产产物物，不降解单链核酸、不降解单链核酸、dsDNA或或dsRNA.用途用途在在cDNA克隆合成第二链之前去除克隆合成第二链之前去除
33、RNA脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(DNase)来来源源于于牛牛胰胰，为为内内切切核核酸酸酶酶，可可优优先先从从嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸的位置水解双链或单链的位置水解双链或单链DNA.用途用途去除去除RNA样品中的样品中的DNA切口平移标志时在切口平移标志时在dsDNA上产生随机切口上产生随机切口外切核酸酶外切核酸酶 (exonuclease)催催化化从从dsDNA 3-OH端端逐逐一一去去除除单单核核苷苷酸酸的的反反响响。底物为线状底物为线状dsDNA和带切口或缺口的环状和带切口或缺口的环状DNA.用途用途制备部分截短的制备部分截短的DNA，用作探针，用作探针制备单向缺失的制备单向缺失的DNA等
34、。等。 本本章章涉涉及及基基因因工工程程操操作作中中大大多多数数工工具具酶酶的的特特性性及及其其用用途途，知知识识点点多多，内内容容分分散散，涉涉及及面面广广，需需求求花花多多点点时时间间复复习习才才干干掌掌握！握！本章复习要点1 1、限限制制性性内内切切酶酶：分分类类、命命名名原原那那么么、识识别别序序列列、黏黏性性末末端端、平平末末端端、同同裂裂酶酶、同同尾尾酶酶、稀稀切酶、酶切反响条件、星星活性等切酶、酶切反响条件、星星活性等2 2、DNADNA聚聚合合酶酶：各各种种酶酶的的活活性性特特点点、切切口口平平移移法法标志标志DNADNA的原理、各种酶的用途等的原理、各种酶的用途等3 3、RNARNA聚合酶的活性与用途聚合酶的活性与用途4 4、衔接酶的类型与用途、衔接酶的类型与用途5 5、T4T4多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途多核苷酸激酶与碱性磷酸酶区别与用途6 6、几种核酸酶特点及用途、几种核酸酶特点及用途
