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1、免免疫疫组组化化Immunohistochemistry1 学习本章节的总体要求学习本章节的总体要求 *1. *1. 熟悉免疫组织化学技术特点熟悉免疫组织化学技术特点及其原理及其原理 *2.*2.掌握免疫组织化学染色的操作流掌握免疫组织化学染色的操作流 程程 *3.*3.熟熟悉悉免免疫疫化化学学反反应应相相关关术术语语及及其其所所用用免免疫疫试试剂的来源和质量控制剂的来源和质量控制 4.4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.5.了解单克隆抗体制备原理和步骤了解单克隆抗体制备原理和步骤 2概概论论一、什么是免疫组织化学一、什么是免疫组织化学免免疫疫组组织织化化
2、学学是是应应用用免免疫疫学学和和组组织织化化学学原原理理，对对细细胞胞组组织织标标本本中中的的某某些些多多肽肽、蛋蛋白白质质等等大大分分子子物物质质进进行行定定性、定位、定量研究性、定位、定量研究的的一门科学。一门科学。3这项技术本质上是一种这项技术本质上是一种染色及原染色及原位示踪技术位示踪技术，它是在它是在酶组织化学酶组织化学基础基础上发展起来的，始于上发展起来的，始于2020世纪中期世纪中期。二、发展历史二、发展历史4免疫荧光标记抗体技术免疫荧光标记抗体技术-Coons1940年年免疫酶标抗体技术免疫酶标抗体技术-Abakane1963不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术不标记酶抗体（酶抗酶
3、复合物）技术-Sternberger1970胶体金免疫标记技术和亲和标记技术胶体金免疫标记技术和亲和标记技术-Hsu19855免免疫疫试试剂剂，自自1975年年Kohler和和Milstein发发明明了了单单克克隆隆抗抗体体制制备备的的杂杂交交瘤瘤技技术术后后，已已从从采采用用多多克克隆隆抗抗体体转转入入了了广广泛泛应应用用单单克克隆隆抗抗体体时时代代。目目前前商商品品供供应应的的特特异异性性第第一一抗抗体体和和交交联联第第二二抗抗体体，绝绝大大多多数数都为都为单克隆抗体单克隆抗体。61.特异性强特异性强专一专一2.敏感性高敏感性高检测阈值达检测阈值达ng或或pg水平水平3.定位准确定位准确既
4、可定性、定位，又可定既可定性、定位，又可定量量4.三位一体三位一体形态、功能和代谢三结合形态、功能和代谢三结合缺点：缺点：干扰多，易出现干扰多，易出现假阳性假阳性 三、技术特点（优点）三、技术特点（优点）7（一）（一）组织处理与切片选择组织处理与切片选择（二）免疫染色的前处理（二）免疫染色的前处理试剂准备（示踪，放大，标记）试剂准备（示踪，放大，标记）消化消化阻断阻断*（三）免疫组化染色（三）免疫组化染色原理、优缺点、流程原理、优缺点、流程（四）免疫染色的后处理（四）免疫染色的后处理增强、衬染、封固增强、衬染、封固四、四、免疫组织化学染色操作步骤免疫组织化学染色操作步骤8* *（五）结果判断与
5、对照设置（五）结果判断与对照设置方法众多方法众多 敏感不同敏感不同 程序雷同程序雷同 按需选用按需选用关键步骤：关键步骤：特异抗体特异抗体-桥联抗体桥联抗体-标记抗体标记抗体种系必需匹配种系必需匹配（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）9第一节第一节 抗原和抗体抗原和抗体10一、一、抗原抗原：凡凡能能刺刺激激机机体体产产生生特特异异性性免免疫疫应应答答（免免疫疫原原性性），并并能能与与相相应应免免疫疫应应答答物物（抗抗体体或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞）在在体体内内、外外发发生生特特异性结合（异性结合（反应原性反应原性）的物质。）的物质。抗原的免疫原性抗原的免疫
6、原性取决于抗原的取决于抗原的异物性异物性；大分子大分子；表面积表面积；专一决定簇专一决定簇等等。11免疫原性反应原性完全抗原complete antigen有有半抗原hepten无有半抗原载体蛋白半抗原载体蛋白全抗原全抗原载体蛋白：载体蛋白：BSA、多聚赖氨酸多聚赖氨酸、牛甲状腺球蛋白等；牛甲状腺球蛋白等；（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）交联要求：交联要求：不改变半抗原的分子构型；不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目至少高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）个以上）交联剂交联剂12n抗原决
7、定簇(表位)：抗原分子中决n定抗原特异性的活性化学基团，其性n质、数量、空间构型决定抗原的特异性。n-免疫组化的精确性、特异性 13交叉反应：抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。-多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位-不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应-免疫组化的假阳性14二、抗体二、抗体nB细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。n-可与相应抗原特异性结合n-亦可作为抗原，激发免疫应答15抗体的分子结构1.抗体分子在立体构型上都是Ig，但Ig不都是抗体。2.各类Ig
8、的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的重链(heavychain,H链),及二条相同的轻链(lightchain,L链),每条重链(H链)和轻链(L链)分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。16 3 .两条重链间，两条轻链间及重链两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借和轻链间，分别借二硫键二硫键连接。此为免疫连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体单体,呈呈“Y”字构型字构型。174.重链上结合有不同量的糖重链上结合有不同量的糖,故故Ig属糖蛋属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即类，即链，链，
9、链，链，链，链，链和链和链，链，由它们组成由它们组成的的Ig分别称为分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和和IgD。18 5.轻链也可根据其化学结构和抗原轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为性的差异分为和和二型。一个二型。一个Ig分子分子的二条轻链型别相同，绝无可能的二条轻链型别相同，绝无可能型和型和型共同存在于同一个型共同存在于同一个Ig分子中。分子中。196.Ig单体的氨基酸序列可分为单体的氨基酸序列可分为恒定区恒定区（constantregion,C区区)和和可变区可变区（variableregion,V区）。区）。-可变区可变区位于位于Ig多肽链的多肽链的N端，占轻链的约端，占轻
10、链的约1/2及及重链的约重链的约1/4（Ig结合抗原的所在部位结合抗原的所在部位）-恒定区恒定区位于位于Ig多肽链的多肽链的C端，占轻链的余下的端，占轻链的余下的1/2及重链的及重链的3/4（补体结合域，补体结合域，Fc受体结合位点，受体结合位点，Ig抗原决定簇等所在部位抗原决定簇等所在部位）207.Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异。的水解片断可因选用的水解酶不同而异。采用采用木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(papain)水解水解Ig时：时：-2个相同的个相同的Fab(fragmentantigenbinding)段，即抗原结合片断段，即抗原结合片断-1个个Fc（fragmentcrystalli
11、able)段，即可结段，即可结晶片断，拥有晶片断，拥有Ig抗原决定簇。抗原决定簇。21 采用胃蛋白酶（采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点），其酶切位点在在Ig重链间二硫键近羧基端重链间二硫键近羧基端- 一个具双价抗体活性的一个具双价抗体活性的F(ab)2片断片断-一个不具任何免疫活性的一个不具任何免疫活性的Fc片断。片断。228.8.抗体的蛋白类型主要为抗体的蛋白类型主要为IgGIgG和和IgMIgM。-IgM-IgM见于初次免疫和免疫早期，滞留时间见于初次免疫和免疫早期，滞留时间较短。较短。-IgG-IgG一一般般见见于于加加强强免免疫疫和和免免疫疫晚晚期期，滞滞留留时间较长，是免疫球
12、蛋白的主要类型。时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。23三、抗体的制备三、抗体的制备依制备途径，目前人工制备的特异性依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类：抗体有三类：-多克隆抗体（多克隆抗体（PcAb）-单克隆抗体（单克隆抗体（McAb）-基因工程抗体基因工程抗体24（一）（一） 抗原提取与纯化的一般原则抗原提取与纯化的一般原则1.1.建立检测方法建立检测方法（定性、定量、活性）（定性、定量、活性）2.2.选选择择抗抗原原含含量量高高、易易获获得得、价价廉廉、可可大大量量收收集集的的样样品品为为原料原料-人人AFPAFP(+)AFPAFP(+)肝癌病人腹水；肝癌病人腹水；4 46 6月胎儿
13、血清月胎儿血清-鼠鼠AFPAFP孕孕1818天大鼠羊水天大鼠羊水-波形蛋白（波形蛋白（vimentinvimentin）猪、牛眼晶状体猪、牛眼晶状体-角蛋白（角蛋白（keratinkeratin）角化上皮角化上皮-肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobinmyoglobin）骨骼肌骨骼肌-胶原（胶原（collagencollagen）皮肤、肌腱等皮肤、肌腱等253.保持抗原分子的稳定性保持抗原分子的稳定性-低低温温、适适度度pH与与离离子子强强度度、抑抑制制酶酶解解、保保护护巯基巯基4.操作步骤简易、有效操作步骤简易、有效。-提取提取-分离纯化分离纯化-浓缩浓缩-贮存贮存26（二）多克隆抗体（抗血
14、清）（二）多克隆抗体（抗血清）PcAbPcAb的的 制备程序制备程序多多克克隆隆抗抗体体-指指由由不不同同克克隆隆B细细胞胞产产生生的的抗抗体混合物体混合物。-每种抗原有多个表位每种抗原有多个表位-用用其其免免疫疫动动物物会会产产生生针针对对各各表表位位的的不不同同抗抗体体（多克隆抗体）（多克隆抗体）-血清中的抗体皆是多克隆的血清中的抗体皆是多克隆的优点：优点：制备简便、价格低廉、抗体效价高制备简便、价格低廉、抗体效价高缺点：缺点：特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定27（二）多克隆抗体（抗血清）（二）多克隆抗体（抗血清）PcAbPcAb的的 制备程序制
15、备程序n1抗原纯化抗原纯化免疫原免疫原n2免疫动物免疫动物免疫对象免疫对象n3收集抗血清收集抗血清粗、混合品粗、混合品n4提取提取IgGPcAb，纯品，纯品n5质量鉴定质量鉴定效价、特异性、蛋白量效价、特异性、蛋白量n6保存与使用保存与使用免疫试剂免疫试剂n纯纯度度（杂杂纯纯）：抗抗血血清清r球球蛋蛋白白IgG特特异异性性IgGIgG片段（片段（Fab或或F(ab)2）n抗体抗体IgG28（三）单克隆抗体的制备及其应用（三）单克隆抗体的制备及其应用 单克隆抗体是指由单个克隆的单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞杂交瘤细胞产生针产生针对对一种抗原决定簇一种抗原决定簇的特异性抗体的特异性抗体。它是
16、采用。它是采用B淋巴细淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。 优点：纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定缺点：制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低291.利用杂交瘤技术制备利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理的基本原理-淋淋巴巴细细胞胞产产生生抗抗体体的的克克隆隆选选择择学学说说，即即一一个个B细胞克隆只产生一种抗体；细胞克隆只产生一种抗体；-细细胞胞融融合合技技术术产产生生的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞可可以以保保持持双方亲代细胞的特性；双方亲代细胞的特性；-利利用用代代谢谢缺缺陷陷补补救救机机理理筛筛选选出出杂杂交交瘤瘤细细胞胞，并并进进行行克克隆
17、隆化化，然然后后大大量量培培养养增增殖殖，制制备备所所需需的的McAb。302.McAb的制备流程的制备流程亲亲 本本 细细 胞胞 准准 备备 细细 胞胞 杂杂 交交 融融 合合（PEG）HAT选选择择性性培培养养杂杂交交瘤瘤细细胞胞克克隆隆性性培培养养与与建建株株（有有效效稀稀释释法法）大大量量制备单克隆抗体制备单克隆抗体质量鉴定与分装冻存质量鉴定与分装冻存（扩大培养或接种动物）（扩大培养或接种动物）（杂交瘤细胞冻存与复苏）（杂交瘤细胞冻存与复苏）31抗原免疫抗原免疫免疫脾细胞免疫脾细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞(BALB/C小鼠小鼠)（经（经8-AG或或6-TG诱导）诱导）(亲本细胞亲本细胞)混合、融合（混合、融合（PEG）选择性培养（选择性培养（HAT）筛选和克隆化筛选和克隆化冻存冻存阳性细胞建株（稳定分泌阳性细胞建株（稳定分泌McAb）（杂交瘤细胞）（杂交瘤细胞）复苏复苏McAb大量制备（上清或腹水大量制备（上清或腹水-鼠）鼠）稳定性检查稳定性检查纯化、鉴定（特异性、活性、含量）纯化、鉴定（特异性、活性、含量）2.McAb的制备流程32四、抗体的标记四、抗体的标记-荧光素荧光素-酶酶-胶体金、胶体铁胶体金、胶体铁33个人观点供参考，欢迎讨论
