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1、生物：基因工程基本操作程生物：基因工程基本操作程序使用序使用Sma平末端平末端平末端平末端 可把黏性末端之间的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶或连接酶或连接酶或连接酶或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把平末端之间的缝隙还可把平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4
2、 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取 v基因表达载体的构建基因表达载体的构建 v将目的基因导入受将目的基因导入受 体细胞体细胞v目的基因的检测目的基因的检测 与鉴定与鉴定 目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因目的基因的获取目的基因的获取供体生物细胞供体生物细胞供体生物细胞供体生物细胞取出取出取出取出DNADNADNADNA用限制酶剪用限制酶剪用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分去多余部分去多余部分目的基因目的基因目的基因目的基因从自然界中
3、已有的物种中分离出来；人工合成从自然界中已有的物种中分离出来；人工合成目前被广泛提取使目前被广泛提取使用的目的基因有：苏用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因（抗病（抗病毒、抗细菌毒、抗细菌) )、人胰岛人胰岛素基因等。素基因等。获得目的基因的方法获得目的基因的方法 1 1）从基因文库中获取目的基因）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？2 2）2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3）人工合成）人工合成 种类：种类：基因
4、组文库：基因组文库：基因组文库：基因组文库：cDNAcDNAcDNAcDNA文库：文库：文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的全部全部全部全部基因基因基因基因含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的部分部分部分部分基因基因基因基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物根据基因的有关信息：如基因的转录产物根据基因的有关信息：如基因的转录产物根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNAmRNA1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _
5、 _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA分子分子分子分子一个切口一个切口一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因获得
6、目的基因获得目的基因DNA DNA DNA DNA 连接酶连接酶连接酶连接酶重组重组重组重组DNADNADNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种同一种同一种 限制酶限制酶限制酶限制酶 目的基因与运载体的结合过程，目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。实际上是不同来源的基因重组的过程。 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。过程和不懈的努力，才获得成功。过程和不懈的努力，才获得成功。
7、过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子( ( ( (
8、抗抗抗抗虫基因首端虫基因首端虫基因首端虫基因首端) ) ) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子( ( ( (抗虫基因末端抗虫基因末端抗虫基因末端抗虫基因末端) ) ) )，导入，导入，导入，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，
9、结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资资 料料:基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：a a、目的基因、目的基因、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子、启动子、启动子c c、终止子、终止子、终止子、终止子d d、标记基因等、标记基因等、标记基因等、标记基因等位于基因首端，位于基因首端，位于基因首端，位于基因首端，RNARNARNARNA聚合酶识别和结聚合酶识别和结聚合酶识别和结聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出合部位，驱动基因转录出合部位，驱动基因转录出合部位，驱动基因转录出mRNAmRNAmRNAmRNA
10、位于基因尾端，使转录在需要的地位于基因尾端，使转录在需要的地位于基因尾端，使转录在需要的地位于基因尾端，使转录在需要的地方停止方停止方停止方停止鉴别筛选受体细胞是否含目的基因鉴别筛选受体细胞是否含目的基因鉴别筛选受体细胞是否含目的基因鉴别筛选受体细胞是否含目的基因( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：
11、借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。目的目的目的基因只有进入目的基因只有进入_内，并且内，并且在受体细胞内维持在受体细胞内维持_和和_的过程，的过程，才能实现一种生物在另一种生物中的转才能实现一种生物在另一种生物中的转化化受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收 DNADNA分子分子( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目
12、的基因导入受体细胞最多采用最多采用经济有效经济有效单子叶常用单子叶常用成本高成本高简便经济简便经济受精卵受精卵大肠杆菌应用最广泛大肠杆菌应用最广泛 用用CaCa2+2+处理处理( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检查是否成功检查是否成功分子分子检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法
13、DNADNA分子杂交分子杂交DNA分子杂交分子杂交抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交还可以进行个体水平的鉴定还可以进行个体水平的鉴定PCR技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应原理：原理：前提：前提：条件：条件：PCRPCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪DNADNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物一对引物一对引物热稳定热稳定热稳定热稳定DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(Ta
14、q(Taq(Taq(Taq酶）酶）酶）酶）DNADNADNADNA的两条链为模板的两条链为模板的两条链为模板的两条链为模板温度控制温度控制温度控制温度控制5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性适温适温延伸延伸1.1.目的基因目的基因目的基因目的基因DNADNA受热变性，解链；受热变性，解链；受热变性，解链；受热变性，解链；2.2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.3.合成链在合成链在合成链在合成链在TaqTaq酶
15、作用下进行延伸。酶作用下进行延伸。酶作用下进行延伸。酶作用下进行延伸。5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互
16、补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使使使RNARNARNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的
17、，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链DNADNADNADNA，从而，从而，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：2.2.2.2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导
18、入微生物细胞3.3.3.3.转化方法：转化方法：转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞处理细胞处理细胞处理细胞细胞细胞细胞细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 _细细细细胞吸收胞吸收胞吸收胞吸收DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+感受态感受态感受态感受态感受态感受态感受态感受态1.1.1.1.常用菌：常用菌：常用菌：常用菌： 目的基
19、因插入目的基因插入目的基因插入目的基因插入TiTiTiTi质粒的质粒的质粒的质粒的T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA上上上上 农杆菌农杆菌农杆菌农杆菌 植物细胞植物细胞植物细胞植物细胞 插入到植物细胞的染色体插入到植物细胞的染色体插入到植物细胞的染色体插入到植物细胞的染色体DNADNADNADNA上上上上 目目目目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达的基因的遗传特性得以维持稳定和表达的基因的遗传特性得以维持稳定和表达的基因的遗传特性得以维持稳定和表达农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。转转化
20、化n n如果显示出杂交带，就表明待测样品含有如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录或翻译。目的基因或目的基因已经转录或翻译。 用口径为用口径为1m的的DNA注射器，将大量的目的基注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。育为转基因动物。什么叫显微注射技术？什么叫显微注射技术？返回返回1.1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关
21、基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是2 2 2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )( )( )利用利用利用利用mRNAmRNAmRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术 利用利用利用利
22、用DNADNADNADNA转录转录转录转录 人工合成人工合成人工合成人工合成A. B. C. D.A. B. C. D.A. B. C. D.A. B. C. D.3.3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A A提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B B有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行
23、检测C C增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D D便于与外源基因连接便于与外源基因连接4.4.4.4. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A A限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用B B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C C质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5. 5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( )
24、( ) A. A.启动子启动子 B.B.终止密码终止密码 C.C.标记基因标记基因 D.D.目的基因目的基因6. 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )( ) A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C.C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法归纳归纳: : 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.1.1.获取目的基因获取目的基因uu从基因文库从基因文库从基因文库从基因文库uu利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR技术
25、技术技术技术uu人工合成人工合成人工合成人工合成2.2.2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体uu目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞uu农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法4.4.4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定uu检测：是否插入、转录、翻译。个体水平的鉴检测：是否插入、转录、翻译。个体水平的鉴检测：是否插入、转录、翻
26、译。个体水平的鉴检测：是否插入、转录、翻译。个体水平的鉴定定定定2 2 2 2、非编码区、非编码区、非编码区、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列( ( ( (启动子、启动子、启动子、启动子、 终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。1 1 1 1、编码区：能转录相应的信使、编码区：能转录相应的信使、编码区：能转录相应的信使、编码区：能转录相应的信使RNARNARNARNA，能编码蛋白质的序列。，能编码蛋白质的序列。，能编码蛋白质的序列。，能编码
27、蛋白质的序列。基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区编码区与与与与RNARNARNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子RNARNARNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。合。合。合。转录开始后，转录开始后，转录开始后，转录开始后，RNARN
28、ARNARNA聚合酶沿聚合酶沿聚合酶沿聚合酶沿DNADNADNADNA分子移动，并以分子移动，并以分子移动，并以分子移动，并以DNADNADNADNA分子分子分子分子的一条链为模板合成的一条链为模板合成的一条链为模板合成的一条链为模板合成RNARNARNARNA。转录完毕后，转录完毕后，转录完毕后，转录完毕后，RNARNARNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNARNARNA聚合酶也从聚合酶也从聚合酶也从聚合酶也从DNADNADNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。一、原核细胞的基因结构一、原核细
29、胞的基因结构一、原核细胞的基因结构一、原核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构二、真核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 内含子内含子内含子内含子 外显子外显子外显子外显子 启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构（补充知识）与与与与RNARNARNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结合位点聚合酶结合位点1 1 1 1、编码区、编码区、编码区、编码区2 2 2 2、非编码区、非编码区、非编码区
30、、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列：调控遗传信息表达的核苷酸序列( ( ( (启动子、启动子、启动子、启动子、 终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列原原核核细细胞胞真真核核细细胞胞不不同同点点相相同同点点原原 核核细细胞胞真真核核细细胞胞不不同同点点 编码
31、编码区是区是连续连续的的编码编码区是区是间间隔的、隔的、不不连续连续的的相相同同点点都由能都由能够编码够编码蛋白蛋白质质的的编码编码区和具有区和具有调调控作用的非控作用的非编码编码区区组组成的成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较：原核细胞与真核细胞的基因结构比较：答案和答案和提示提示n n1. 1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达
32、并发答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1 1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身生物之间进行基因交流，只有使用受体生物
33、自身生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；基因的启动子才能比较有利于基因的表达；基因的启动子才能比较有利于基因的表达；基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2） 通过通过通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只文库获得的目的基因没有启动子，只文库获得的目的基因没有启动子，只文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；将编码序列导入受体生物中无法转录；将编码序列导入受体生物中无法转录；将编码序列导入受体生物中无法转录；（3 3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记
34、；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；些其他调控元件，如增强子等；些其他调控元件，如增强子等；些其他调控元件，如增强子等；（5 5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的
35、什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因）如绿色荧光蛋白基因等。目的基因与标识基因的融合基因）如绿色荧光蛋白基因等。目的基因与标识基因的融合基因）如绿色荧光蛋白基因等。目的基因与标识基因的融合基因）如绿色荧光蛋白基因等。2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你
36、能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？理论上说，你应该如何做？理论上说，你应该如何做？理论上说，你应该如何做？农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根
37、农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的TiTi质粒介导的遗传转化最多。质粒介导的遗传转化最多。质粒介导的遗传转化最多。质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有约有约有约有9393属属属属643643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子种双子叶植物对
38、根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力能力能力能力 。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有
39、趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。 研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，丁香酮，这些物质主要在双子叶植物
40、细胞壁中合成，丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如如如如L-L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和木糖等也有诱导作用。酚类
41、物质和木糖等也有诱导作用。酚类物质和木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中为农杆菌中为农杆菌中为农杆菌中TiTi质粒上质粒上质粒上质粒上VirVir区（毒性区）基因的诱导物，区（毒性区）基因的诱导物，区（毒性区）基因的诱导物，区（毒性区）基因的诱导物，使使使使VirVir区基因活化，导致区基因活化，导致区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNAT-DNA的加工和转移，从而侵的加工和转移，从而侵的加工和转移，从而
42、侵的加工和转移，从而侵染植物细胞染植物细胞染植物细胞染植物细胞 。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同叶植物
43、进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异果也有很大差异果也有很大差异果也有很大差异 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：但要注意两点：但要注意两点：但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是要选择合适的农杆菌菌株，因为
44、不是要选择合适的农杆菌菌株，因为不是要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化要加趋化要加趋化要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的向植物组织的
45、受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的VirVir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNADNA上。上。上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本关细胞器功能的知识，结合基因工
46、程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？杆菌吗？杆菌吗？杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复质网和高尔基复合体上加工完成的，
47、内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某
48、种疾病，如镰刀形细胞贫血异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的鼠的鼠的鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编
49、码序列珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA）。）。）。）。（2 2）将）将）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动前接上在大肠杆菌中可以适用的启动前接上在大肠杆菌中可以适用的启动前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，）将表达载体导入无四环素抗
50、性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白
51、基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取体，破碎后从中提取体，破碎后从中提取体，破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。你能推测出由你能推测出由你能推测出由你能推测出由mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成cDNAcDNA的过程大的过程大的过程大的过程大致分为哪些步骤吗？致分为哪些步骤吗？致分为哪些步骤吗？致分为哪些步骤吗？提示：提示：提示：
52、提示：19701970年，特明（年，特明（年，特明（年，特明（H.M. TeminH.M. Temin）和巴尔的摩）和巴尔的摩）和巴尔的摩）和巴尔的摩（D. BaltimoreD. Baltimore）证实了）证实了）证实了）证实了RNARNA病毒中含有一种能将病毒中含有一种能将病毒中含有一种能将病毒中含有一种能将RNARNA转录成转录成转录成转录成DNADNA的酶，这种酶被称为依赖的酶，这种酶被称为依赖的酶，这种酶被称为依赖的酶，这种酶被称为依赖RNARNA的的的的DNADNA聚合酶，由于与中心法则中的从聚合酶，由于与中心法则中的从聚合酶，由于与中心法则中的从聚合酶，由于与中心法则中的从DN
53、ADNA到到到到RNARNA的转录是的转录是的转录是的转录是反向的，所以称为反转录酶（反向的，所以称为反转录酶（反向的，所以称为反转录酶（反向的，所以称为反转录酶（reverse reverse transcriptasetranscriptase）。）。）。）。反转录酶既可以利用反转录酶既可以利用反转录酶既可以利用反转录酶既可以利用DNADNA又可以利用又可以利用又可以利用又可以利用RNARNA作为模板作为模板作为模板作为模板合成与之互补的合成与之互补的合成与之互补的合成与之互补的DNADNA链。像其他链。像其他链。像其他链。像其他DNADNA聚合酶一样，反聚合酶一样，反聚合酶一样，反聚合酶
54、一样，反转录酶也以转录酶也以转录酶也以转录酶也以5353方向合成方向合成方向合成方向合成DNADNA（图（图（图（图1-31-3）。）。）。）。图图图图1-3 1-3 由由由由mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成cDNAcDNA的过程的过程的过程的过程cDNAcDNA合成过程是：合成过程是：合成过程是：合成过程是：第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补互补互补互补的的的的DNADNA单链，形成单链，形成单链，形成单链，形成RNA-DNARNA-DNA
55、杂交分子。杂交分子。杂交分子。杂交分子。第二步，核酸酶第二步，核酸酶第二步，核酸酶第二步，核酸酶H H使使使使RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链降链降链降链降解，使之变成单链的解，使之变成单链的解，使之变成单链的解，使之变成单链的DNADNA。第三步，以单链第三步，以单链第三步，以单链第三步，以单链DNADNA为模板，在为模板，在为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下聚合酶的作用下聚合酶的作用下合成另一条互补的合成另一条互补的合成另一条互补的合成另一条互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链链，形成双链链，形成双链
56、DNADNA分子。分子。分子。分子。1.1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？体内提取不行吗？体内提取不行吗？体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCRPCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNADNA中，直接获得，也中，直接获得，也中，直接获得，也中，直接获得，也可以通过反转录，用可以通过反转录，用可以通过反转录，用可以通过反转录，用PCRPCR方式从方式从方式从方式从mRNAmRNA中获得，不一定中获得，不一定中获得，不一定中获得，不一定要构建基因文库。要构建基因文库。要构建基因文库。要构建基因文库。
