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1、基因工程实验基因工程实验 主讲人：秦新民实验一实验一 基因工程实验常用溶液基因工程实验常用溶液的配制与仪器使用的配制与仪器使用 【目的要求目的要求】1掌握基因工程实验常用试剂溶液的配制；2了解基因工程实验常用仪器的使用方法。 【注意事项注意事项】1称量要精确，特别是在配制标准溶液、缓冲液时，更加应该注意严格称量；2一般溶液都应用蒸馏水或去离子水配制，有特殊要求的除外；3配制溶液时应根据实验要求选择不同规格（化学纯、分析纯等）的试剂；4试剂应根据需要量配制，一般不宜过多，以免积压浪费或过期失效；5试剂（特别是液体）一经取出，不得再放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而污染整瓶试剂。取固体试剂时，必须
2、使用洁净干燥的药勺；【仪器材料与药品仪器材料与药品】一、仪器材料仪器材料高压灭菌锅、电子天平、电子称、磁力搅拌器、普通冰箱、pH计、Milii-Q纯水器、超净工作台、容量瓶、三角瓶、pH试纸、称量纸、小药勺、烧杯、各种规格的试剂瓶（白色、棕色）、培养皿（9cm）、玻璃棒。二、药品药品 胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl 、NaOH、琼脂粉、琼脂糖、盐酸、冰乙酸、葡萄糖、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、酚、氯仿、异戊醇、乙酸钾、SDS（十二烷基硫酸钠）、NaAc。 【实验操作实验操作】一、试剂的配制试剂的配制（一）（一） 细菌培养基细菌培养基（* LB培养基）： 10
3、g/L 细菌培养用胰蛋白胨；5g/L 细菌培养用酵母提取物10g/L NaCl 用NaOH调pH 7.0 （固体培养基加1.5%琼脂粉） （二）（二） 常用溶液：常用溶液：1*、1mol/L Tris-Cl 缓冲液（pH 8.0）：取12.1g Tris溶于约80ml水中，搅拌，加入盐酸调pH值至所需值，再加入重蒸水至总体积100ml。2*、0.5mol/L EDTA 溶液 （pH 8.0）：取14.61g EDTA 加入80ml水，磁力搅拌器搅拌，加入NaOH调pH值至所需，重蒸水定容至100ml体积。3*、TE 溶液（10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8.0）1m
4、l pH 8.0的 1mol/L Tris-Cl 缓冲液与0.2ml pH 8.0的0.5mol/L EDTA 溶液混合后用重蒸水或纯水定容至100mL。4*、50TAE 缓冲液（电泳时使用1TAE即可）：取24.2g Tris 溶于适量蒸馏水中，加入5.71 ml 冰乙酸、10ml pH8.0的0.5mol/L EDTA溶液，蒸馏水定容至100ml。5*、大肠杆菌质粒提取液（碱裂解法）溶液I： 50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-Cl （pH8.0）10mmol/L EDTA (pH8.0)溶液II: 0.2mol/L NaOH 1%SDS （注：分别配制2浓度的溶液，用前等
5、体积混合）溶液III：取29.4 g 乙酸钾溶于60ml 重蒸水中，溶解后再加入11.5 ml 冰乙酸以及重蒸水（约28 ml）定容至100ml。（此溶液称为5mol/L 乙酸钾，含3mol/L的钾及5mol/L的乙酸根）。6*、植物DNA提取缓冲液（CTAB法）2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）100 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）20 mmol/L EDTA（pH8.0）1.4mol/L NaCl 7*、3mol/L NaAc （pH 5.2）取取24.6g 24.6g NaAcNaAc溶于溶于80ml80ml水中，用乙酸调水中，用乙酸调pHpH值至值至5.25.2，定容，
6、定容至至100ml100ml体积。体积。8*8*、0.1mol/L CaCl20.1mol/L CaCl2每每100ml100ml溶液含溶液含CaCl2CaCl2（无水、分析纯）（无水、分析纯）1.10g1.10g，用无菌双，用无菌双蒸水配制，灭菌处理。蒸水配制，灭菌处理。9*9*、动物、动物DNADNA提取液：提取液：0.4 mol/L 0.4 mol/L NaClNaCl10 10 mmolmmol/L /L Tris-ClTris-Cl (pH8.0) (pH8.0) 2 2 mmolmmol/L EDTA (pH8.0)/L EDTA (pH8.0)1% SDS1% SDS10*10*
7、、6 mol/L 6 mol/L NaClNaCl1111、氯仿、氯仿/ /异戊醇（异戊醇（V/VV/V） 24241 11212、10 mol/L 10 mol/L NaOHNaOH 二、灭菌工作二、灭菌工作（一）标有“*”的试剂均要进行高压灭菌；（二）1.5 ml 离心管、1 ml 移液吸头、0.2 ml移液吸头、0.01ml移液吸头、锥形瓶、0.2 ml PCR管、培养皿（9cm）、1.8ml 螺旋口离心管三、微量移液器的正确使用三、微量移液器的正确使用1选择所需量程范围的微量移液器；2弄清所选移液器的结构、各旋钮或按钮的功能(Fig. A)；3调节好所需吸取液体体积的刻度（包括小数位，
8、一般为红色数字，如Fig. B所示）；4吸取液体（以日本进口微量移液器为例）：1）选择相应的吸头/枪头；2）拇指按住Push button使之从位置a降到位置b，注意不能下按到c位置，如Fig. C；3）拇指仍然按住Push button在位置b处，将吸头/枪头插入液体下约3mm（Fig. D-）；4）缓慢松开拇指（注意吸头/枪头仍然浸在液体下面）使液体被吸入到吸头里面（如Fig. D-所示）；5）提起微量移液器，将吸头靠住另一离心管（如Fig. D-所示）管壁，拇指往下按住Push button使之从位置a降到位置b，5秒后再往下按到c位置，使吸头内液体完全流出来（如Fig. D-、所示）；
9、6往下按Ejector button以将吸头从移液器上弹下来（如Fig. D-所示）。实验二实验二植物植物DNA的提取的提取基本原理基本原理DNA提取提取DNA纯化纯化操作步骤操作步骤注意事项注意事项核酸的分类及存在脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) 与蛋白质结合在一起以与蛋白质结合在一起以 核蛋白（核蛋白（DNPDNP）的形式存在。）的形式存在。在制备核酸时通常在制备核酸时通常 破坏细胞壁及细胞膜来使破坏细胞壁及细胞膜来使 核蛋白释放出来。核蛋白释放出来。核酸的理化性质核酸的理化性质uDNADNA为白色类似石棉样的为白色类似石棉样的纤维状物，
10、纤维状物，RNARNA的纯的纯品呈品呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸。核酸和核苷酸大都呈酸味。味。uDNADNA、RNARNA和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一，一 般都般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶 剂，剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水它们的钠盐比游离酸易溶于水。u在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。溶液中较稳定。 由于生物材料的差异，不可能有一种普遍适用的提纯生物体DNA的方法，植物材料有坚固的细胞壁，核酸含量较少，含有较多的多糖物质和色素、核酸酶活性高等这些因素给植
11、物DNA的分离纯化带来了困难。 DNA提取SDSSDS法法 SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸裂解核酸-蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与与DNA的结合，使的结合，使DNA释放出来。释放出来。SDS是有效的阴是有效的阴离子去垢剂，细胞中离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合力或配位键结合,SDS能够破
12、坏这种价键。能够破坏这种价键。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠CTAB法：CTAB：十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜可溶解细胞膜与脂膜，与脂膜，使细胞中的使细胞中的DNA-蛋白质复合物释蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。它能与它能与核酸形成复合物核酸形成复合物。 在高盐溶液中在高盐溶液中(0.7molL NaCl)是可溶的，当降低溶是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度液盐浓度到一定程度(0.3molL NaCl)时，从溶液中沉淀时，从溶液中沉淀，通过离心就可将通过离心就可
13、将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之能溶解于乙醇随之被除去。被除去。与SDS法相比CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA，如果后继实验对二者都需要，则可分别进行纯化，如只需要DNA则可用RNase水解掉RNA。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。Tris-HCl (pH8.0)
14、提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中。EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+ 或Mn2+ ，抑制DNase活性。- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：提取缓冲液中各试剂的作用：注意 - 巯基乙醇有很高的毒性，吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。 中毒表现有呕吐、震颤、头痛、昏迷，甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。DNA纯化（去杂质）u蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿
15、：异戊醇（2525：2424：1 1）或氯仿：异戊醇（）或氯仿：异戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。uRNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 u酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇。提取液中加少量巯基乙醇。u多糖多糖 提取液中加提取液中加PVPPVP。聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮,是一种非离子型高分子化合物是一种非离子型高分子化合物操作步骤1.称取 200-300mg 叶片装入 1.5ml 离心管，置于液氮中，用研磨棒研磨至粉碎，然后向离心管中加入 1000l 经过 65预热、含有 2%PVP 的 CTAB提取液和10l-疏基乙醇，混匀；在 65下水浴 40min-1
16、h 其间要经常颠倒混匀。2. 加入 200l 醋酸钾，混匀，冰浴 15min。10000rpm 离心 10min，取上清约900l。3 3、加入等体积的加入等体积的 Tris Tris 饱和酚饱和酚- -氯仿氯仿- -异戊醇（异戊醇（2525：2424：1 1），在摇床上充分摇动），在摇床上充分摇动15min15min；10000rpm 10000rpm 离离心心10min10min，取上清取上清 700l 700l。4 4、加入加入 1/10 1/10 上清液体积的上清液体积的 Rnase Rnase，混匀；，混匀；3737水水浴浴 40min-1h 40min-1h。5 5、加入等体积的的
17、氯仿加入等体积的的氯仿- -异戊醇（异戊醇（2424：1 1），摇床上），摇床上摇动摇动 15min 15min；10000rpm 10000rpm 离心离心10min10min，取上清约，取上清约 500l500l。6. 加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙醇，充分混匀，4冰箱中静置20min。7. 10000rpm 离心 10min，弃上清。8. 分别用 75%酒精和无水乙醇漂洗沉淀 2 次，倒掉酒精，将离心管管口朝下，自然晾干。9. 加入 100l 1TE 溶液溶解 DNA，也可以 50助溶，保存在 4备用。注意事项 1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB
18、 抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。实验三 动物组织中总DNA的提取Total DNA extraction from eukaryotic tissue实验目的了解真核生物基因组DNA提取的一般原理通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 提取的方法和步骤动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机
19、械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出。DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染实验原理细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法（表面活性剂，能溶解细胞膜表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游得以游离出来）
20、。离出来）。 SDSSDS（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。淀下来。EDTA EDTA 抑制抑制DNADNA酶的活性。酶的活性。再加入氯仿等再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸核酸(DNA(DNA、RNA)RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇使乙醇使DNADNA沉淀，沉淀沉淀
21、，沉淀DNADNA溶于双蒸水或溶于双蒸水或TETE溶液中，溶液中，即即DNADNA溶液。溶液。SDS法提取动物组织DNA试剂提取缓冲液：提取缓冲液：200 mmol/L TrisCl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 0.5% SDS24：1的氯仿：异戊醇的氯仿：异戊醇预冷无水乙醇预冷无水乙醇操作步骤1.肝脏肝脏1g左右左右, (剪碎剪碎) 置研钵中，加入置研钵中，加入2-3mL提取提取缓冲液，缓冲液， 研磨成浆；吸入研磨成浆；吸入10mL EP管中，摇动混管中，摇动混匀；匀；2.60水浴保温水浴保温20min，不时不时颠倒混匀；颠倒混匀； 3.
22、室温下室温下3000rpm离心离心10min；4.小心吸上清于小心吸上清于另一只另一只离心管中，加入等体积离心管中，加入等体积的的24:1的的氯仿氯仿：异戊醇：异戊醇，上下颠倒混匀上下颠倒混匀；5.室温下室温下3000rpm离心离心10min； 6.小心小心将上层水相将上层水相吸入吸入另一只另一只离心管中；离心管中；7.重复重复4-5步步2-3次次; (此步不做）此步不做）8.加入加入等等体积体积预冷无水乙醇预冷无水乙醇，室温下放置片刻即出现，室温下放置片刻即出现絮状絮状DNA沉淀。沉淀。 结果分析与讨论实验四 PCR扩增目的基因【PCR 原理原理】聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymer
23、ase Chain Reaction, (Polymerase Chain Reaction, PCR)PCR)是一种是一种选择性体外扩增选择性体外扩增DNADNA的方法的方法，其基本，其基本原理类似于原理类似于DNADNA的天然复制过程。的天然复制过程。 反应包括反应包括: : 变性变性(Denature) (Denature) 、 退火退火(Anneal)(Anneal)和和延伸延伸(Extension)(Extension)三个基本步骤。三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的环将使目的DNADNA扩增一倍，这些经合成产
24、生的扩增一倍，这些经合成产生的DNADNA又可作为下一轮循环的模板，所以经又可作为下一轮循环的模板，所以经25253535轮循环就可使轮循环就可使DNADNA扩增达扩增达10106 6 倍。倍。加热加热加热加热变变 性性复复性性复复温温DNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用可以使可以使可以使可以使 DNADNADNADNA双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断裂裂裂裂, , , ,双链解离双链解离双链解离双链解离, , , ,形成单链形成单链形成单链形成单链DNA,DNA,DNA,DNA,这称为这称为这
25、称为这称为 DNADNADNADNA的变性的变性的变性的变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后解除变性的条件后, , , , 变变变变性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来, , , ,形成双链形成双链形成双链形成双链, , , ,其原有的特性和其原有的特性和其原有的特性和其原有的特性和活性可以恢复活性可以恢复活性可以恢复活性可以恢复, , , ,这称这称这称这称DNADNADNADNA复性复性复性复性, , , , 也叫退火也叫退火也叫退火也叫退火。 PCRPCR扩增原理扩增原理延伸延伸延伸延伸变性、退火变性、退火变
26、性、退火变性、退火5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 变性变性变性变性退火退火退火退火3 3 5 5 延伸延伸延伸延伸变性变性：加热，使模板：加热，使模板DNADNA在高温下（在高温下（9494）变性，）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。退火退火：溶液温度降至：溶液温度降至45456565，模板，模板DNADNA与引物与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。延伸延伸：溶液反应温度升至：溶液反应温度升至7272，耐热，耐热DNADNA聚合酶聚合酶以单链为模板，利用引物的以单链为模板，利用
27、引物的3 3 -OH-OH，以反应混合物，以反应混合物中的中的4 4种脱氧核苷三磷酸（种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）为底物，按）为底物，按5 5 3 3 方向复制出互补方向复制出互补DNADNA，即引物的延伸阶段。，即引物的延伸阶段。 PCR的的三个热反应过程三个热反应过程温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环
28、周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、变性、变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。为止。为止。
29、为止。 PCR的产量的产量u 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。u DNA产量以指数上升，产量以指数上升，n个循环后，达到个循环后，达到2n拷贝。拷贝。【仪器耗材与试剂仪器耗材与试剂】（一）仪器与耗材（一）仪器与耗材1. PCR1. PCR热循环仪热循环仪2. 202. 20LL、 200L 200L 吸头，吸头，200200LL、500L 500L EPEP管，管，1010LL、 50L50L、200L200L移液器移液器移液器移液器3. PCR 3. PCR 电泳仪和电泳槽电泳仪和电泳槽（二）试剂（二）试剂1.10PCR Buffer10PCR B
30、uffer；2.MgClMgCl2, 2, 25 25 mmolmmol/L/L； 3.dNTPdNTP（ 其中包括其中包括其中包括其中包括dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP与与与与dTTPdTTP；每种；每种；每种；每种浓度均为浓度均为浓度均为浓度均为10 10 mmolmmol/L /L ）；）；）；）；4.正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（正向引物与反向引物（10 10 MM/L/L）；）；）；）；5.TaqTaq DNA DNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（1U/L1U/L）；）；）；）； 6.DNADNA模板模板模板模板 （小鼠基因组（小
31、鼠基因组（小鼠基因组（小鼠基因组DNADNA，100ng/L 100ng/L ， 反转录反转录反转录反转录cDNAcDNA）；）；）；）； 7.ddHddH2 2O O 【实验步骤实验步骤】1. 1. 在在在在0.2 0.2 mLmL EppendorffEppendorff 管内配置管内配置管内配置管内配置20 20 LL反应反应反应反应体系体系体系体系：反应物反应物反应物反应物体积（体积（体积（体积（LL）dddd H H2 2O O 1212PCRPCR缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 （1010）2 2MgClMgCl2 2 （25 25 mmolmmol/L/L）2 2dNTPdNTP （1
32、0 10 mmolmmol/L /L ）1.01.0正向引物正向引物正向引物正向引物 （ 10 10 MM/L /L ）0.50.5反向引物反向引物反向引物反向引物 （ 10 10 MM/L /L ）0.50.5TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 1 1模板模板模板模板DNA DNA 1 12. 按下述程序进行按下述程序进行PCR扩增扩增: 1） 94 预变性 3 min； 2） 94 变性 1 min； 3） 55 退火 30 sec； 4） 72 延伸 30 sec； 5） 重复步骤24, 34次； 6） 72 延伸 5 min； 7） 4 , 3min.3. 琼脂糖凝胶
33、电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果结果 配制2琼脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。 4. PCR的反应体系中各组分作用的反应体系中各组分作用DNA 模板模板 (template)引物引物 (primer)4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 （dNTP）DNA聚合酶聚合酶 （Taq）反应缓冲液反应缓冲液Mg2+及某些使酶稳定的辅剂及某些使酶稳定的辅剂质量：要求有较高纯度的质量：要求有较高纯度的DNA样品样品避免反复冻融，防止降解避免反复冻融，防止降解数量数量: 25-100ng/20l 1）DNA 模板模板2）引物）引物 与模板与模板DNA的某个局域具
34、有互补碱基特异性的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链的短的单链DNA片段。片段。3）dNTP 4种种 dNTP 用量应均衡，否则会减少用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合酶合成的忠实性，增加错配率。成的忠实性，增加错配率。l最初的聚合酶最初的聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶 klenow 片段片段, 不耐热，每次加热变性后需重新补加。不耐热，每次加热变性后需重新补加。 聚合温度偏低（聚合温度偏低（37 ），产生非特异性扩增），产生非特异性扩增lTaq DNA 聚合酶聚合酶 从水生栖热菌中分离，可在从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。生长。 Taq 酶扩增效率酶扩增效率: 60
35、0bp/min 错配率错配率: 1bp/4000bp (无无3-5外切酶活性外切酶活性) 4）DNA聚合酶聚合酶作用作用: 增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。 增加增加 dsDNA 的的 Tm 值，提高融合温度。值，提高融合温度。 与游离与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入。渗入。浓度浓度: 1.5-2.0 mmol/l5）缓冲液中的）缓冲液中的Mg2+6）循环次数循环次数 循环次数是循环次数是2535次。次。 循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。加。5. PCR
36、反应常见问题1. 1. 没有任何产物：没有任何产物：没有任何产物：没有任何产物：模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂） 酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加酶失活或者忘记添加 引物设计，浓度引物设计，浓度引物设计，浓度引物设计，浓度 MgMg2+2+浓度太低浓度太低浓度太低浓度太低变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等变性时间太短，退火温度过高，延伸时间
37、太短等2. 2. 产生多个条带：产生多个条带：产生多个条带：产生多个条带：引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高Mg2+Mg2+浓度太高浓度太高浓度太高浓度太高酶用量太多酶用量太多酶用量太多酶用量太多退火温度过低等退火温度过低等退火温度过低等退火温度过低等3. 3.产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段产生与目的片段长度相似的非目的片段: : 模板或者试剂不纯，有其他基因组污染模板或者试剂不纯，有其他基因组污染模板或者
38、试剂不纯，有其他基因组污染模板或者试剂不纯，有其他基因组污染4. 4. 出现片状拖带：出现片状拖带：出现片状拖带：出现片状拖带： 模板，酶，模板，酶，模板，酶，模板，酶，dNTPdNTP用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多用量太大，循环次数过多实验五实验五 大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA的提取及检测的提取及检测实验目的实验目的 掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNADNA的原理和方法。的原理和方法。的原理和方法。的原理和方法。了解不同构型的质粒了解不同构型的质粒了解不同构型的质粒了解不
39、同构型的质粒DNADNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的在琼脂糖凝胶中泳动速率的在琼脂糖凝胶中泳动速率的在琼脂糖凝胶中泳动速率的差异。差异。差异。差异。实验原理实验原理 质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状DNA分子。大小在分子。大小在1200kb之间，质粒之间，质粒DNA通常通常以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由于质粒于质
40、粒DNA自身具有复制原点、可携带外源基因、自身具有复制原点、可携带外源基因、转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使得质粒成为基因工程中最常用的得质粒成为基因工程中最常用的DNA载体。载体。实验原理实验原理 l质粒质粒DNA分子具有分子具有3种不同的构型：种不同的构型：SC构型构型：共价闭合环形：共价闭合环形DNA（cccDNA），质粒的），质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构；两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构；OC构型构型：开环：开环DNA（ocDNA），质粒的两条多核苷），质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在
41、一酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一处至多处断裂；处至多处断裂；L构型构型：线性：线性DNA（linear DNA），质粒），质粒DNA发生双发生双链断裂而形成线性分子。链断裂而形成线性分子。实验原理实验原理 l同一质粒同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同，的不同构型尽管相对分子质量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒（SC）、线性质粒（）、线性质粒（L）、开环质粒（）、开环质粒（OC）。）。l质粒质粒DNA的提取方法较多，要
42、根据宿主菌和质粒的的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法有：有：碱裂解法碱裂解法、煮沸法煮沸法。l几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒收集菌体裂解细胞收集菌体裂解细胞分离和纯化质粒分离和纯化质粒DNA。 碱裂解法实验原理碱裂解法实验原理 利用共价闭合环状质粒利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体与线状的染色体DNA片段在拓扑学上片段在拓扑学上的差异进行分离。的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形成
43、蛋白质成蛋白质-SDS复合物。同时，在复合物。同时，在pH12.012.5的碱性条件下，线的碱性条件下，线状的染色体状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两虽然氢键断裂，但两条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高的醋酸钾高盐缓冲液使盐缓冲液使pH降低后，质粒降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅的两条互补链由于彼此靠近而迅速准确地复性，而线状的染色体速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互由于核苷酸链较长且两条互补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网
44、状结构，补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染色体并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染色体DNA网状聚合物便与蛋白质网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一起沉复合物及不稳定的大分子一起沉淀下来，而留在上清液中的质粒淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步抽提可用苯酚、氯仿进一步抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。实验原理实验原理 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。
45、的电极移动的现象称为电泳。在在pH8.0的电泳缓冲液体系中，的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电分子带负电荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反比（仅适于线性分子）。比（仅适于线性分子）。通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电
46、泳检测实验材料、主要仪器及试剂实验材料、主要仪器及试剂 实验材料实验材料实验材料实验材料 prok2prok2系列质粒系列质粒系列质粒系列质粒主要仪器和用具主要仪器和用具主要仪器和用具主要仪器和用具 超净工作台、振荡培养箱超净工作台、振荡培养箱超净工作台、振荡培养箱超净工作台、振荡培养箱 、微量移液器、微量移液器、微量移液器、微量移液器、 离心机、涡旋离心机、涡旋离心机、涡旋离心机、涡旋振荡器、制冰机、振荡器、制冰机、振荡器、制冰机、振荡器、制冰机、 离心管架、离心管架、离心管架、离心管架、1.5m1.5mL L离心管、吸头、离心管、吸头、离心管、吸头、离心管、吸头、PEPE手手手手套、储冰盒
47、、套、储冰盒、套、储冰盒、套、储冰盒、电泳槽、电源、电泳槽、电源、电泳槽、电源、电泳槽、电源、微波炉、凝胶成像系统。微波炉、凝胶成像系统。微波炉、凝胶成像系统。微波炉、凝胶成像系统。 试剂试剂试剂试剂（1 1）溶液溶液溶液溶液 ：50 50 mmolmmol/L /L 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 25 25 mmolmmol/L /L TrisHClTrisHCl（pH8.0pH8.0） 10 10 mmolmmol/L EDTA/L EDTA（pH8.0pH8.0） 灭菌后灭菌后灭菌后灭菌后44保存保存保存保存（2 2）溶液溶液溶液溶液：0.2mol/L 0.2mol/L NaOHNaOH 1
48、% SDS 1% SDS（pHpH值值值值12.612.6）（3 3）溶液溶液溶液溶液：5mol/L 5mol/L KAcKAc 60ml 60ml 冰乙酸冰乙酸冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5ml 水水水水28.5ml28.5ml（pH4.8pH4.8）（4 4）LBLB培养基培养基培养基培养基（5 5）琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖（7 7）11TAETAE电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液（pH 8.0pH 8.0）：）：）：）：10 mmol/LTrisCl10 mmol/LTrisCl 1 1 mmolmmol/L EDTA/L EDTA （8 8）上样缓冲液（溴酚蓝上样缓冲液（溴
49、酚蓝上样缓冲液（溴酚蓝上样缓冲液（溴酚蓝（9 9） 溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（1mg/ml1mg/ml）实验步骤实验步骤1. 菌体的培养与收集菌体的培养与收集（1 1）从）从LBLB平板上挑细菌单菌落，接种于平板上挑细菌单菌落，接种于5ml5ml附加相应抗生附加相应抗生素的素的LBLB液体培养基中，液体培养基中，37250r/min37250r/min，过夜培养，过夜培养（用对（用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的ODOD620620=0.2=0.20.60.6时为对数期的菌液。也可取时为对数期的菌液。也可取1/1001/100的过
50、夜菌液，继的过夜菌液，继续摇瓶培养续摇瓶培养2.5h2.5h，此时菌液达对数期）。，此时菌液达对数期）。（2 2）取）取1.2ml1.2ml菌液放在菌液放在1.5ml1.5ml的离心管中，的离心管中，5000r/min 45000r/min 4离心离心10min10min，弃上清，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用干净，最好用STESTE或生理盐水再悬浮漂洗
51、菌体或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集菌）。收集菌体后选择以下方法提取质粒。体后选择以下方法提取质粒。实验步骤实验步骤2.质粒质粒DNA的提取（碱裂解法）的提取（碱裂解法）将收集的细菌沉淀悬浮于将收集的细菌沉淀悬浮于100l100l冰预冷的冰预冷的溶液溶液中，强中，强烈振荡混匀；烈振荡混匀；加入加入200ul200ul新配的新配的溶液溶液于细菌悬液中，迅速颠倒离心管于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5 5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min5min或冰上或冰上放置放置3min.3min.加入加入150l150l预冷的预冷的溶液溶液，盖紧管口，颠倒离心管，
52、盖紧管口，颠倒离心管5 51010次，使溶液次，使溶液在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上管置于冰上5 510min10min。 实验步骤实验步骤 12 000 rpm12 000 rpm离心离心10 min10 min，将上清液转移至另一新离心管，将上清液转移至另一新离心管中。中。 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min10 min。 12 000 rpm12 000 rpm离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。 加入加入500 500 ll 70 70乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心
53、管乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管以洗涤沉淀。以洗涤沉淀。 12 000 rpm12 000 rpm离心离心2 min2 min，用移液器吸走上清，打开管盖，用移液器吸走上清，打开管盖于室温下放置于室温下放置10-15 min10-15 min，使酒精挥发干净。，使酒精挥发干净。 待沉淀干燥后，加入待沉淀干燥后，加入50 50 ll TE TE缓冲液溶解质粒缓冲液溶解质粒DNADNA。3.琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳合并下次一起电泳） （1）凝胶制备凝胶制备 取琼脂糖取琼脂糖0.8g0.8g，加入，加入100ml100ml的的1 1TAETAE电泳缓冲液，配成浓电泳
54、缓冲液，配成浓度为度为0.8%0.8%的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶解（注意不要溅出）。解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至待凝胶溶液冷却至 6060左右时，加左右时，加入溴化乙锭至终浓度为入溴化乙锭至终浓度为0.5g0.5gmlml，倒进制胶模具中。，倒进制胶模具中。 室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶的模具的模具放置于电泳槽中。放置于电泳槽中。实验步骤实验步骤 （2 2）上样上样上样上样 在在在在DNADNADNADNA样品中加入样品中加入样品中加入样品中加入1 1
55、1 16 6 6 6体积的上样缓冲液，充分混匀。用移体积的上样缓冲液，充分混匀。用移体积的上样缓冲液，充分混匀。用移体积的上样缓冲液，充分混匀。用移液器将液器将液器将液器将DNADNADNADNA样品加入样品孔中。样品加入样品孔中。样品加入样品孔中。样品加入样品孔中。 （3 3）电泳电泳电泳电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑色，色，色，色，DNADNADNADNA样品由负极往正极泳动。电压降选择为样品由负极往正极泳动。电压降
56、选择为样品由负极往正极泳动。电压降选择为样品由负极往正极泳动。电压降选择为l l l l5V5V5V5Vcmcmcmcm（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据不同的胶浓度与胶长度而异。不同的胶浓度与胶长度而异。不同的胶浓度与胶长度而异。不同的胶浓度与胶长度而异。 （4 4）观察结果观察结果观察结果观察结果 电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照电泳结束后取出胶膜
57、，使用凝胶成像系统拍照, , , ,观察。对比观察。对比观察。对比观察。对比标准标准标准标准DNADNADNADNA条带和未知条带和未知条带和未知条带和未知DNADNADNADNA条带，观察其带型和迁移距离，即条带，观察其带型和迁移距离，即条带，观察其带型和迁移距离，即条带，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。称琼脂糖称琼脂糖加加TAE加热溶解加热溶解加加EB灌胶灌胶凝固凝固放入电泳槽放入电泳槽加溴酚蓝加溴酚蓝点样点样电泳电
58、泳观察拍照观察拍照质粒质粒DNA 电泳检测过程示意图电泳检测过程示意图质粒质粒DNA注意事项注意事项溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，致癌物质，是一种强诱变剂，致癌物质，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带手套。手套。电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，DNA从阴极向阳极泳动。从阴极向阳极泳动。思考题思考题（1 1）质粒）质粒DNADNA有哪几种构型？其电泳时的泳有哪几种构型？其电泳时的泳动速率如何？动速率如何？（2 2）碱裂解法提取质粒）碱裂解法提取质粒DNADNA的原理是什么？的原理是什么？实验六实验六大肠杆菌
59、感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组重组DNA的转化的转化、克隆筛选、克隆筛选1. 实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术术。了解细胞转化的概念及其在分子了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。生物学研究中的意义。2. 相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受受体体细细胞胞经经过过一一些些特特殊殊方方法法（如如：CaCl，RuCl等等化化学学试试剂剂
60、法法）的的处处理理后后，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生变变化化，成成为为能能容容许许多多有有外外源源DNA的的 载载 体体 分分 子子 通通 过过 的的 感感 受受 态态 细细 胞胞(competent cell) 。 转化（转化（transformation）：是是将将异异源源DNA分分子子引引入入一一细细胞胞株株系系，使使受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的一一种种手手段段，是是基基因因工工程程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性遗传
61、信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。甲基化酶的突变株。转化的方法：转化的方法：1.化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处制备的感受态细胞，通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体D
62、NA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，基平板上，会出现成千上万的细菌菌落
63、，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。克隆含有插入片段。重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、进行酶切分析、插入失活、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备
64、质粒常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶进行酶切分析，对于带有切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以基因的载体还可以结合结合 -互补现象来筛选。互补现象来筛选。 -互补现象：互补现象：因为许多载体都带有一个因为许多载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序基因的调控序列和头列和头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码 - -互补互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 - -半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补（苷酶实现基因内互补（ -互补互补）。）。当这种载当这种载体转入可编码体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的宿主细
65、胞中时，在异丙基宿主细胞中时，在异丙基- - -D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的诱导下，的诱导下，宿主可同时合成这两种宿主可同时合成这两种肽段，肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为以称这种现象为 - -互补现象。互补现象。由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ Z) )能够作用能够作用于生色底物于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利而产生蓝色的
66、菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNADNA片段时，会造成片段时，会造成LacLacZ Z( ( ) )基因的失活，破基因的失活，破坏坏 -互补作用，互补作用，就不能产生具有活性的酶。就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。组质粒的菌落为蓝色。重组重组DNADNA转化细菌过转化细菌过程示意图程示意图3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无无菌菌超超净净台台，电电热热恒恒温温水水浴浴，分分光
67、光光光度度计计，离离心心机机，移液器，微型离心管等；移液器，微型离心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5质质粒粒：pBluscript KS+DNA 片片段段的的质质粒粒以以及及 pBluscript KS 空质粒；空质粒；LBLB培培养养基基；含含抗抗菌菌素素的的LBLB平平板板培培养养基基（氨氨苄苄青青霉霉素素，浓浓度度50-10050-100g gmLmL，X-gal X-gal 20-4820-48g/ml, g/ml, IPTG IPTG 100 100 g/mlg/ml。一一般般将将抗抗生生素素、X-galX-gal和和IPTGIPTG配配制制成成100010
68、00 储储备备液液，用用时时按按培培养养基基的的量量再再加加入入）；预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （1）从从新新活活化化的的E.coli DH5菌菌平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，接接种种于于35ml LB液液体体培培养养中中，37振振荡荡培培养养12h左左右右，直直至至对对数数生生长长期期。将将该该菌菌悬悬液液以以1:1001:50转转接接于于100ml LB液液体体培培养养基基中中，37振振荡荡扩扩大大培培养养，当当培培养养液液开开始始 出出 现
69、现 混混 浊浊 后后 ， 每每 隔隔 20 30min测测 一一 次次OD600nm，至，至OD600nm0.5时停止培养；时停止培养；（2）每每组组取取培培养养液液3个个2ml转转入入2ml离离心心管管中中，在在冰冰上上冷冷却却20-30min，于于4，4000rmin离离心心10min（从从这这一一步步开开始始，所所有有操操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）倒倒净净上上清清培培养养液液，用用1ml冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液轻轻轻轻悬悬浮浮细细胞胞，冰冰浴浴；（4）04，4000rmin离心离心10min；（5）弃弃去去上上清清液液
70、，加加入入500l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞。04，4000rmin离心离心10min；（6）弃弃去去上上清清液液，加加入入100l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，冰冰上上放放置置片片刻刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可直直接接用用于于转转化化实实验验，也也可可加加入入占占总总体体积积15左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，混混匀匀后后分分装装于于1.5ml离离心心管管中中，置置于于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可
71、保存半年至一年。2）细胞细胞转化转化 (1) 分别取分别取3个个100l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作操作)，第一组，加入，第一组，加入10 l重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10l)+ 100l感受态细胞感受态细胞，此管此管为转化实验组。第二组，插入为转化实验组。第二组，插入DNA片段对片段对照组，即酶切后照组，即酶切后DNA片段片段25ng+100l感受感受态细胞悬液；第三组，质粒态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，对照组，即即1ng 未未酶切酶切pBluescript 质粒质粒DNA十十10
72、0l感受态细胞悬液感受态细胞悬液。 (2) 将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，冰冰上上放放置置20-30min，于于42水水浴浴中中保保温温12min，然然后后迅速冰上冷却迅速冰上冷却2min(3) 立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.4ml LB液液体体培培养养基基（不不需需在在冰冰上上操操作作），使使总总体体积积到到0.5ml，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，摇摇匀匀后后于于37振振荡荡培培养养约约45-60min ，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常常生生长长状状态态，并并使使转转化化体体表表达达抗抗生生素素基基因产物因产物(Ampr)。3) 平板培养（有时
73、需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取各样品培养液取各样品培养液0.1ml，分别接种于分别接种于含抗菌素含抗菌素LB平板培养基上，涂匀平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫后稍微凉一下再用，不要过烫）。）。(2) 菌液完全被培养基吸收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，倒置培养皿，于于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝
74、色和白色菌落。此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌个转化菌落。在实际工作中，每微克有落。在实际工作中，每微克有105以上的转化以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。菌落足以满足一般的克隆实验。4) 检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示培养皿内菌落生长状况应如表所示: 组组组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明结果
75、说明结果说明 转化实验组转化实验组转化实验组转化实验组 白色白色白色白色菌落和少量菌落和少量菌落和少量菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入细细细细胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定插入插入插入插入DNADNA片片片片段对照组段对照组段对照组段对照组无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板
76、有少量模板有少量模板DANDAN存在存在存在存在 质粒对照组质粒对照组质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的效率效率效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析转转化化体体总总数数菌菌落落数数（转转化化反反应应原原液液总总体体积积/ /涂涂板菌液体积）板菌液体积）插入频率蓝色菌落数插入频率蓝色菌落数/ /白色菌落数白色菌落数转转化化频频率率转转化化体体总总数数/ /加加入入质质粒粒DNADNA的的量量（计计算算出每微克的转化菌落数）出每微克的转化菌落数）实
77、验七实验七琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测质粒DNA或PCR产物。二、原理 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度
78、、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括影响泳动率的因素包括样品的物理性状样品的物理性状、支持物介质支持物介质、电场强度电场强度和和缓缓冲液离子强度冲液离子强度 DNADNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶和和聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，
79、凝胶琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 DNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应 在碱性缓冲液中在碱性缓冲液中DNADNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNADNA几乎具几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，在
80、一定的电场强度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNADNA分子本身的大小和构型分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNADNA，也可以分离，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子分子 可以分离长度为可以分离长度为100bp100bp至近至近60kb60kb的的DNADNA分子，常采用分子，常采用TAETAE、TBETBE和和TPETPE三种缓冲体系三种缓冲体系琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参分离范围
81、参数数 凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp） 0.5 100030000 0.7 80012000 1.0 50010000 1.2 4007000 1.5 2003000 2.0 502000 质粒质粒DNADNA分子有三种构型，即分子有三种构型，即CCCDNACCCDNA、OCDNAOCDNA和和LDNALDNA，这三种构型的质粒，这三种构型的质粒DNADNA分分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，三条带，CCCDNACCCDNA泳动最快泳动最快，其次是，其次是LDNALDNA，最慢的是最慢的是OCDNAOCDNA EBEB：即溴化乙锭，
82、它能够插入即溴化乙锭，它能够插入DNADNA分子中的碱分子中的碱基对之间而与基对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子分子的插入，的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈条带呈现出现出红色荧光，易于检测。可以检测红色荧光，易于检测。可以检测10ng 10ng 的的DNADNA 注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定要注意安是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套全，必须戴塑料或乳胶手套CCCDNALDNAOCDNA电泳方向聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联聚丙烯酰胺凝
83、胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMEDTEMED的作用下聚合而的作用下聚合而成成 可以分离小片段（可以分离小片段（5 5500bp500bp）DNADNA分子分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用： 蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定 核酸的分析核酸的分析 核酸序列测定核酸序列测定三、仪器、材料与试剂 微波炉微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统凝胶成像系统 质粒质粒DNADNA DNA markerDNA marke
84、r 50TBE50TBE 66凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 琼脂糖琼脂糖 1 1溴化乙锭溶液溴化乙锭溶液溶解琼脂糖分离质粒DNA片段检测质粒DNA片段电泳样品DNA相对分子质量标准物电泳缓冲液沉淀DNA并起指示作用电泳支持介质嵌入DNA中，在紫外灯下显色四、实验步骤将将1g 1g 琼脂糖加入琼脂糖加入100ml 1TBE100ml 1TBE电泳缓冲液中，摇匀。在微电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到6060，加入，加入5l5l的的1 1 EBEB，并摇匀），则为，并摇匀），则为1 1琼脂糖凝胶液琼脂糖凝胶液用胶带将制胶板两端封好，用胶带将
85、制胶板两端封好，插入适当梳子插入适当梳子，将溶解的琼脂，将溶解的琼脂糖（约糖（约5050）倒入倒入，室温冷却凝固，室温冷却凝固充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TBE1TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm0.5cm，小心垂直向上，小心垂直向上拔出梳子拔出梳子用移液器吸取质粒样品用移液器吸取质粒样品5ul5ul于塑料板上，再加入于塑料板上，再加入3l 3l 的的66加加样缓冲液，混匀后，样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔小心加入点样孔 打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至3 35V/cm5V/c
86、m（本实验用电压（本实验用电压110V110V），可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，当溴酚蓝条），可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿带移动到距凝胶前沿1 12cm2cm处，停止电泳处，停止电泳将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，DNADNA存在处显存在处显出桔红色荧光条带。出桔红色荧光条带。五、思考题EBEB的中文名称是什么？使用的中文名称是什么？使用EBEB时应注意些什么？时应注意些什么？什么是什么是Loading BufferLoading Buffer？Loading BufferLoading Buffer中含有哪些成分？中含有哪些成分？各组分的作用是什么？各组分的作用是什么？
