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1、第十二章第十二章DNA、RNA和蛋白质和蛋白质DNA的基本操作：的基本操作：DNA（线状双链（线状双链DNA）、）、ocDNA（开（开环双链环双链DNA）、）、cccDNA（闭环双链（闭环双链DNA）。）。DNA是相当稳定的，但是使用时也不能太随意，DNA的污染来源主要是其他DNA分子。 DNA保存：保存： DNA在中性PH，低温，暗处，合适的盐浓度和无物理剪切的条件下较稳定，适宜保存。用于存放DNA的缓冲液有三种,TE，0.1TE(适宜酶促反应)，T50E（适宜溶解PH不稳定的DNA）。 DNA检测：检测： 1.紫外吸收2.溴化乙锭（EBa） DNA浓缩：浓缩： 1.DNA不溶于乙醇，所以一
2、般用乙醇沉淀DNA来达到纯化的目的;2.异丙醇沉淀；3.有机溶剂浓缩DNA，如正丁醇。 DNA纯化纯化： 1.酚抽提（适宜样品DNA中混有蛋白质污染）；2.苯酚/氯仿/异戊醇抽提;3.DEAE/纤维素交换树脂(其他杂质);4.凝胶过滤(适宜除去样品中含有盐、缓冲液组分、小分子杂质等)。DNA篇篇1. DNA的分离：的分离：质粒DNA的提取基本步骤：1）质粒载体的选择；2）培养细菌使质粒扩增；3）收集和裂解细胞。溶菌酶破坏细菌细胞壁，再同SDS和tritonX-100可使细胞膜裂解，用强热或酸、碱处理后中和、复性就可以提取到质粒DNA。有煮沸裂解法、碱裂解法等。噬菌体DNA的提取基本步骤：1）感
3、染力的测定，一般用噬菌体裂解物感染大肠杆菌来计算感染力；2）从噬菌斑中回收噬菌体；3）增殖噬菌体；4）平板裂解液法；5）提取噬菌体DNA。真核生物基因组DNA的提取基本步骤：1）破碎细胞；2）取出蛋白质、多糖、脂类等生物分子；3）取出盐类、有机溶剂等杂质；4）浓缩和溶解DNA。2. DNA的转化的转化制备感受态细胞：有CaCl2法和电转化法。转化主要步骤：化冻、质粒与感受态细胞接触、热激，骤冷和目的基因的表达。3.DNA的扩增：主要是的扩增：主要是PCR技术技术4.DNA的重组：指将目的基因从这一载体插入到的重组：指将目的基因从这一载体插入到另一载体的过程。另一载体的过程。目的DNA的准备。载
4、体准备对目的DNA片段和载体磷酸化处理。酶切完毕的DNA和载体连接。连接DNA转入合适宿主菌，获取重组体。筛选，检测重组体。DNA重组过程中的重组过程中的注意点注意点：对于仅用限制酶处理的载体，与目的DNA连接的同时也能进行自我连接，因此有必要将载体DNA末端进行脱磷酸化处理，以防止载体自连。如果载体和目的DNA不存在合适切点，这时候就需要对目的DNA或者载体进行修饰与改造。RNA篇RNA是单链分子，由A、U、C、G四个碱基串联在核糖-磷酸骨架上。由于核糖2是-OH，遇水易发生变构，其结构不稳定。这种不稳定的变构反应在碱性条件下被加快。因此，RNA的长期保存是件令人头痛的工作。 细胞内外存在大
5、量的RNase，对RNase产生降解反应，且该酶极稳定，因此试验中如何避免RNase污染时意见非常重要的工作。 RNA在合适的条件下易出现分子内局部配对，这种配对导致RNA分子形状发生改变，因此在普通电泳中不能正确显示其大小，所以应用变性胶电泳，利用变性剂破坏其内部配对，使RNA表现为完整的单链状态。在PH6.0的微酸性环境下RNA相对稳定，碱性环境下易分解。RNase无处不在无处不在。细胞内存在大量的细胞内存在大量的RNase，裂解细胞时应特别注意。，裂解细胞时应特别注意。人的体液中含有大量的人的体液中含有大量的RNase，应尽量避免样品和样品管与体液的，应尽量避免样品和样品管与体液的接触，
6、养成戴手套和口罩的习惯，勤更换。接触，养成戴手套和口罩的习惯，勤更换。空气中的灰尘和细菌中含有大量的空气中的灰尘和细菌中含有大量的RNase，应建立干净的操作环境，应建立干净的操作环境。RNase的稳定性极高，即用蛋白质变性剂的稳定性极高，即用蛋白质变性剂SDS或苯酚不能使之完或苯酚不能使之完全失活；其活性不依赖于金属离子，因此全失活；其活性不依赖于金属离子，因此EDTA等螯合剂不能使之等螯合剂不能使之失活；热稳定，仅用煮沸方式也不能使之失活。失活；热稳定，仅用煮沸方式也不能使之失活。防止RNA酶污染一、防止RNA酶污染 的措施 1.1.所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于
7、180180的高温下干烤的高温下干烤6h6h或更长时间。或更长时间。2.2.塑料器皿可用塑料器皿可用0.1% DEPC0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在再浸泡在3% H2O2 3% H2O2 室温室温10min10min，然后用，然后用0.1% DEPC0.1% DEPC水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。4.4.配制的溶液应尽可能的用配制的溶液应尽
8、可能的用0.1% DEPC0.1% DEPC，在，在3737处理处理12h12h以上。然后用高以上。然后用高压灭菌除去残留的压灭菌除去残留的DEPCDEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPCDEPC处理过的无处理过的无菌双蒸水配制，然后经菌双蒸水配制，然后经0.22m0.22m滤膜过滤除菌。滤膜过滤除菌。5.5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.6.设置设置RNARNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的二、常用的RNA酶抑制剂酶抑制剂1
9、.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，他通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2.异硫氰酸胍 ：它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合 形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin ）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。RNA的分离 前面步骤所提取的是总前面步骤所提取的是总RNARNA，其中，其中
10、80%85%80%85%是核糖体是核糖体RNARNA（ rRNA rRNA ），），10%20%10%20%是转移是转移RNARNA（ tRNA tRNA ），只有），只有2%5%2%5%是基因克隆中非常重要的信是基因克隆中非常重要的信使使RNARNA（mRNAmRNA）。若想构建出高质量的）。若想构建出高质量的cDNAcDNA文库或者进行文库或者进行NorthernNorthern杂交、杂交、RT-PCRRT-PCR等实验也需要纯化的等实验也需要纯化的mRNAmRNA。与。与rRNA rRNA 和和tRNAtRNA不同的是，绝大部分不同的是，绝大部分mRNAmRNA的的33端均有一个端均有一
11、个poly(A)poly(A)尾，称为尾，称为polyRNApolyRNA，可根据该结构进行分，可根据该结构进行分离。离。 mRNAmRNA的分离方法较多，其中的分离方法较多，其中以寡聚（以寡聚（dTdT）- -纤维素柱层析法纤维素柱层析法最为有最为有效，已成为常规方法。此法利用效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3mRNA 3末端含有末端含有PolyPoly（A+A+）的特点，）的特点，在在RNARNA流经寡聚（流经寡聚（dTdT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNAmRNA被特被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情异地结
12、合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，况下，mRNAmRNA被洗脱，经过两次寡聚（被洗脱，经过两次寡聚（dTdT）纤维柱后，即可得到较高纯）纤维柱后，即可得到较高纯度的度的mRNAmRNA。 测定与的值，根据二者的比值来估计制备样品的纯度，纯净的DNA比值为1.8，纯净的RNA比值为2.0，比值过大过过小则说明样品中含有蛋白质杂质，需去除。紫外分光光度计首先，必须了解待纯化样品中目的蛋白及主要杂质的性质，尽可能多的收集有关蛋白质来源、性质和稳定性等信息，有助于设计蛋白质纯化方案。其次，纯化开始前必须了解最终产品的用途，要综合考虑纯化产品的质量、数量和经济性等三方面的要求。
13、最后，充分了解各分离纯化技术操作单元的大量信息也很重要。蛋白质操作的原则蛋白质操作的原则蛋白质蛋白质主要操作过程主要操作过程细胞破碎和碎片分离浓缩进一步纯化常用指标分析细胞的破碎细胞的破碎物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。 常用的方法有： 1. 反复冻溶法：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。 2. 超声波处理： 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，特点：操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。
14、3.高速珠磨法。 4.高压匀浆法。化学及生物化学法： 1.酶溶法：利用各种水解酶，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。特点： a) 此法适用多种微生物； b) 具有作用条件温和； c) 内含物成分不易受到破坏； d) 细胞壁损坏的程度可以控制。 2.化学渗透法：某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。特点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。 存在的问题：时间长，效率低；化学试剂毒性较强；通用性差。蛋白质样品的分离蛋白质样品的分离聚沉： 聚沉剂主要是无机盐类（如氯化锌、氯化铝
15、、硫酸盐等）和聚合无机盐（聚合铝、聚合铁等）。为促进聚沉的产生，可以降温至20以下进行；调整pH至36；提高离子浓度；增加颗粒数量；增加多价金属离子等方法。离心： 对于低粘度介质中的细菌，20003000g、1015min；对于高粘度的溶液，则需更高的速度和更长的时间，如细胞碎片，12000g、3045min；对于蛋白质沉淀，5000g、30min或15000g、10min过滤： 孔径一般为0.2um或0.45um，常压或减压过滤。蛋白质浓缩法蛋白质浓缩法吸附法原理：将干的惰性多孔基质聚合物，如葡聚糖凝胶，加入到蛋白质溶液中吸收水和其他小分子，当凝胶完全膨胀后，没用过滤或离心方法去除凝胶，分离
16、出蛋白质。优缺点：简单快速，仪器简单，适应于稳定性较差的蛋白质。但选择性比较差，不能连续操作，浓缩倍数较低，蛋白质回收率低，仅有80%90%。超滤法原理：在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。优缺点：1、超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质，如药物、酶、果汁等的分离、分级、浓缩与富集。2、超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，
17、是一种节能环保的分离技术。3、超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。4、超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。5、超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050%的浓度。透析：是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程。任何天然的(如腹膜)或人造的半透膜，只要该膜含有使一定大小的溶质通过的孔径，那么这些溶质就可以通过弥散和对流从膜的一侧移动到膜的另一侧。双水相分离法原理：利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化蛋白质，同
18、时起到浓缩蛋白质的作用。该法较温和，一般不会使蛋白质变性失活，可在室温下进行，双水相中聚合物还可提高蛋白质的稳定性。最常用的多聚物是聚二乙醇和葡聚糖。影响因素：聚合物分子量及浓度、溶液pH、离子强度、盐类型及浓度等的影响。接下来一般采用Bradford方法测定蛋白质，以免PEG的影响冷冻干燥法原理：这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白
19、质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。对于滤膜不能截留的低分子量多肽浓缩好。适应于热不稳定蛋白质和多肽的浓缩，但设备要求较高。盐析法原理：加入中性盐蛋白质溶液中，蛋白质的溶解度开始增大（盐溶），但随着继续加盐，蛋白质的溶解度却逐步减小，并形成沉淀，即成为盐析。影响因素：1蛋白质浓度高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。2离子强度和类型一般说来，高价阴离子沉淀效果好，单价阳离子中，铵离子效果好
20、于钾、钠离子。常用硫酸铵，因其价格便宜，溶解度高，对温度敏感性低。3PH值与蛋白质等电点有关，但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。4温度在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4进行。有机溶剂沉淀法原理：有机溶剂破坏了蛋白质分子之间的某些键该法，是蛋白质分子的空间结构发生了变化，一些原先存在于蛋白质分子内部的疏水集团被暴露于表面，并与有机溶剂的疏水集团结合，形成疏水层，使得蛋白质沉淀。有机溶剂的选择：有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙
21、醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。优缺点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。影响因素：1）温度低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH；3）金属离子一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能形成复合物，溶解度下降。4）离子强度盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宜。等电点沉淀法原理：两性电解质分
22、子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。此法常与盐析法或有机溶剂法配合使用很多蛋白质的等电点在偏酸性范围之内，调节pH所用的有机酸价格低，操作也比较方便。但是，对pH敏感的蛋白质应避免使用此法。聚乙二醇沉淀法原理：PEG分子在溶液中形成了网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，是蛋白质分子聚集、沉淀。影响条件：蛋白质的分子量、浓度、溶液的pH、温度及PEG的平均分子量等因素的影响。蛋白质浓度常小于10mmol/L。选择性沉淀法原理：不同蛋白质在不同的条件下有不同的稳定性，改变温、pH或加入有机溶剂，许多杂蛋白发生变性沉淀，而目的蛋白不形成沉
23、淀，就可以分离出比较纯的目的蛋白。此方法可分为：1）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂（丙酮或乙醇等）引起变性；2）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。蛋白质的进一步纯化蛋白质的进一步纯化色谱法色谱法色谱色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。色谱分离技术色谱分离技术-色谱种类色谱种类色谱有多种，按固定相类型和分离原理可分为吸附色谱吸附色谱、分配色谱分
24、配色谱、离子交换色谱离子交换色谱、亲和色谱亲和色谱、大孔吸附树脂大孔吸附树脂、凝胶色谱凝胶色谱、聚焦色谱聚焦色谱等。最常用的是吸附色谱分离技术。吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂（固定相）时，由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物中各组分分离的方法。此法特别适用于脂溶性成分脂溶性成分的分离。被分离的物质与吸附剂吸附剂、洗洗脱剂脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。凝胶过滤的原理：以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。
25、通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。离子交换层析：离子交换是利用蛋白质表面的电荷与层析剂上的离子基团的静电作用。亲和色谱：在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞
26、表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。作用：具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：分级分离各种抗原与抗体；去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；分析血清中的免疫复合物；分子量的测定。优缺点：1.凝胶层析操作简便，所需设备简单。2.分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100。3.分离条件缓和。4.应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩
27、以及分析测定等。5.分辨率不高，分离操作较慢。常用指标分析一、紫外分光光度法蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。另外，不少杂质在280nm波长下也有定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。本法操作简便迅速，且不消耗样
28、品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。蛋白质含量的分析蛋白质含量的分析样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+3H2SO4=2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH
29、=2H2O+Na2SO4+2NH3(3)为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。二、微量凯氏（二、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法三三、双缩脲法（、双缩脲法（BiuretBiuret法）法） 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有
30、两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。FolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法） 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从
31、而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐在Cu+催化被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，可检测的最低蛋白质量达5mg，通常测定范围是20250mg。缺点是费时间较长，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。进行测定时，当Folin一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于
32、酪氨酸和色氨酸的定量测定。 四、考马斯亮兰法（四、考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法） 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为青蓝色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（01000ug/ml），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。优点：蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在2-5min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，可测微克级蛋白质含量，所以是一种较好的蛋白质定量测定方法。缺点： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。几几种种方方法法的的综综合合比比较较
