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1、EBEB病毒永生化细胞模型在病毒永生化细胞模型在人类疾病基因研究中的应用人类疾病基因研究中的应用 朱朱 振振 宇宇 教授教授 中山大学中山大学 EB病毒相关人淋巴母细胞系的蛋白质表达谱研究 国家自然基金30672358 （负责人） 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 发现 EB病毒是1964年Epstein与Barr在非洲儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种疱疹病毒。 1966年Old等采用免疫扩散法发现鼻咽癌病人的血清能与非洲儿童淋巴细胞的抽提液起反应。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据（1）： 1969年de-the从鼻咽癌活检培养的类淋巴细胞中分离出EB病毒。 国内也已经从鼻咽癌组
2、织培养所建立的类淋巴母细胞株中证明带有EB病毒壳抗原（VCA）和早期抗原（EA），并在电镜下找到了典型的疱疹病毒颗粒，其形态与EB病毒相同。 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据（2）： Kottaridis SD等（1996年）认为鼻咽癌患者血清中抗EBNA的水平反映肿瘤的大小 。Anticancer Res,1996,16(2):785-789 Vera-Sempere FJ等（1996年）采用巢式PCR和免疫组化分析说明了不论组织学类型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。 Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168 2、几乎100%鼻咽非角化性
3、癌均有EBV感染。 在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。特别在珠江三角洲及香港地区，是世界上NPC的高发区。 根据中山市的肿瘤统计资料（流行病学 ），NPC的年龄和性别的校正发病率为18.12/10万 (男：25.60 /10万；女：11.05/10万)。97%的NPC为非角化性癌。经EBER1原位杂交（所谓“金标准” ）证实癌细胞中有EBV感染。一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 小小结结：流行病学、血清学和分子生物学的资料证实, EBV感染与NPC有密切关系。 鼻咽癌患者癌细胞中证实有EB病毒的DNA，经原位杂交，多数癌细胞呈EBERs阳性、核抗
4、原（EBNA-1）阳性。 鼻咽癌患者肿瘤细胞中有EB病毒，血清有一套抗EB病毒的抗体，血清中的EBV抗体水平普遍升高。 1997年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上把EBV归类为第一类致癌物（特别是鼻咽癌） 。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同 EBV血清学诊断利用NPC的一个特征，即患者多种EBV抗体的水平较非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。 EBV血清学诊断已用于NPC高危人群的筛查和对NPC可疑病例的诊断。根据从70年代后期以来的研究结果，VCA-IgA检测通常被用于筛查以排除NPC的诊断 ；EA-IgA检测目前被用于NPC的确定性检测。 二
5、、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同检测哪种抗体？检测抗体哪种类型？l 因为鼻咽癌（NPC）是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。 所以我们可以先了解EB病毒在上皮细胞中的潜伏感染以及两种形式的EB病毒感染所表达的各种抗原。l 各种抗原相应产生不同的特异性抗体中哪种有代表性？1、 EB病毒的潜伏感染 上皮细胞中病毒复制循环中的B淋巴细胞池 长期潜伏感染 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 EB病毒感染口咽上皮细胞 如果感染了复制缺陷突变的病毒 待上皮细胞增生后个别细胞死亡EB病毒引自: J Immmunol. 2005; 17498:4972-82、两种形式的、两种形式的EB病
6、毒感染病毒感染潜伏性感染潜伏性感染(latent infection)I型潜伏性感染: 表达EBNA1，病征为 Burkitt 淋巴瘤II型潜伏性感染:表达EBNA1和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征为Hodgkin 淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤III型潜伏性感染:表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、 EBNA6，病征为传染性单核细胞增多症、移植后淋巴 组织增生性疾病溶解性感染溶解性感染(lytic infection) 在EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小部分（约15%20%）出现溶解性感染，溶解性感染出现三个时相（phase）。
7、 立即早期: 表达Zta(ZEBRA)、EBNA1等 早期: 表达EA(D)、EA (R) 、 EBNA1等 晚期: 表达VCA、EBNA1等EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。EBNA 1 IgA 的抗体水平在NPC患者中高于正常的EBV携带者Cutoff OD?小结NPC主要表现是EBV潜伏感染伴少量溶解性感染。 EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞，检测上皮细胞的分泌型IgA抗体水平对NPC较有诊断意义。 NPC的显著特征是病人血清中的EBV抗体（尤其是IgA亚型）水平普遍升高，这种变化在NPC发病前期将先于症
8、状出现，借此可区分NPC与其它EB病毒感染相关疾病或健康携带者。我们认为EBNA1/IgA抗体水平的检测对NPC高危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段之一。EB病毒在人类普遍易感病毒在人类普遍易感,多种疾病相关，多种疾病相关，如传染性单核细胞增多症、如传染性单核细胞增多症、Birkitt，s淋巴淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤等瘤、非何杰金淋巴瘤等体外只能感染人体外只能感染人B B淋巴细胞淋巴细胞 其致病机制仍不清楚，原因可能与其致病机制仍不清楚，原因可能与病毒在体外对大多数细胞都不易感病毒在体外对大多数细胞都不易感染有关染有关上皮细胞内可以表现为裂解感染，上皮细胞内可以表现为裂解感染，在淋巴细胞
9、内主要表现为潜伏感染在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染EB病毒是病毒是DNA病毒，其基因组是线性病毒，其基因组是线性双链双链DNA，长，长172Kb，由末端直接重复，由末端直接重复序列（序列（terminal direct repeats TR）、）、内部直接重复序列内部直接重复序列(internal direct repeats IR)、DL、DR和重复序列之间和重复序列之间的单一序列构成的单一序列构成研究现状研究现状目前对病毒的致病机制的了解均来源目前对病毒的致病机制的了解均来源于于EB病毒病毒在体外感染在体外感染B B淋巴细胞而建淋巴细胞而建立的立的淋巴母细胞系淋巴母细胞系其致病基因主要有细
10、胞源性基因和病其致病基因主要有细胞源性基因和病毒的潜伏感染基因毒的潜伏感染基因EB病毒在病毒在B细胞内以潜伏感染方式存在，细胞内以潜伏感染方式存在，此时，病毒基因组中只有约此时，病毒基因组中只有约9种基因表达，种基因表达，编码病毒核抗原（编码病毒核抗原（6种）以及潜伏膜蛋白种）以及潜伏膜蛋白（3种）和一些非信使种）和一些非信使RNA 9种病毒蛋白对于病毒转化细胞种病毒蛋白对于病毒转化细胞起到必需或重要作用起到必需或重要作用 不同病理组织来源的不同病理组织来源的EB病毒阳性病毒阳性细胞中病毒的基因表达谱有差别（三细胞中病毒的基因表达谱有差别（三种假说解释）种假说解释）1、“hit-and-run
11、”：癌变早期有较多基：癌变早期有较多基因表达，在最终的肿瘤组织中某些基因因表达，在最终的肿瘤组织中某些基因的表达被下调或消失的表达被下调或消失2、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因的表达，如在的表达，如在Burkitts淋巴瘤中染色体移淋巴瘤中染色体移位使得位使得c-myc的表达下调的表达下调3、除、除B细胞以外其他类型的细胞转化或细胞以外其他类型的细胞转化或许需要不同的病毒基因表达谱许需要不同的病毒基因表达谱 对人类基因或基因组的研究是阐明疾病病因、发病机理，建立新型诊断方法，并找寻有效的个体化治疗途径的重要环节 发现鉴定某些疾病相关基因的经典路线是：提取细胞
12、/组织的DNA或RNA ，PCR/RT-PCR后电泳，对特异性条带测序。对于某些家族多发性疾病而言这条路线的工作量之大是不言而喻的，因此标本的预处理和保存就是一个不可回避的重要课题 超低温冰箱和液氮都不能很好的长期保存标本 细胞永生化是一种使细胞获得无限传代能力的技术 通过对细胞的适当处理使其在保留原来细胞某些特性的前提下无限增殖。由于可以用于长期稳定的保存疾病相关信息，便于多年后开展回顾性对比研究，从而更有利于对疾病的病因、发病机制的阐明，目前该技术已广泛应用于诸如白血病、鼻咽癌、肉瘤以及登革热等多种临床疾病的研究 本实验室长期从事EB病毒致B淋巴细胞永生化的研究，已经成功建立了病毒相关人外
13、周血淋巴细胞永生化细胞模型并开展了相关研究。 本项目旨在通过建立稳定的携带疾病相关信息的永生化细胞系而使珍贵标本得以长期保存，从而为疾病相关基因的发现和鉴定提供得力保障细胞永生化技术路线：培养B95.8B95.8细胞收集EBEB病毒分离外周血淋巴细胞病毒液和淋巴细胞共培养2 2小时离心收集细胞RPMI1640RPMI1640培养约2 2月LCL1-5 LCL2-5 LCL3-5 LCL4-30LCL5-30LCL5-30空白对照空白对照100bp200bp300bp400bp500bp600bp2000bpmarker2000LCLsLCLs的的LMP1LMP1基因基因mRNAmRNA水平的检
14、测水平的检测, ,扩增片断长度为扩增片断长度为424424bp. LCL1-5bp. LCL1-5、LCL2-5 LCL2-5 、LCL3-LCL3-5 5、LCL4-30LCL4-30、LCL5-30LCL5-30都有都有 LMP1LMP1基因基因mRNAmRNA水水平的表达平的表达 LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达正常外周血淋巴细胞正常外周血淋巴细胞 CD19CD19阳性率为阳性率为9.6%9.6%LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达LCL1-5LCL1-5 CD19CD19阳性率为阳性率为97.1%97.1%LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达正常外周血
15、淋巴细胞正常外周血淋巴细胞CD20CD20阳性率为阳性率为12.2%12.2%LCLsCD19，CD20抗体的表达抗体的表达LCL1-5LCL1-5 CD20CD20阳性率为阳性率为85.3%85.3%空白对照空白对照结论：结论：LCLsLCLs细胞来源于细胞来源于B B细胞细胞 在转化实验的初期，细胞培养瓶中在转化实验的初期，细胞培养瓶中出现梭形的贴壁生长的细胞，胞体透亮，出现梭形的贴壁生长的细胞，胞体透亮，散在分布。实验中观察发现，这种贴壁散在分布。实验中观察发现，这种贴壁细胞是细胞是LCLsLCLs生长的种子，但不是每个贴生长的种子，但不是每个贴壁细胞都能长出细胞克隆，其中部分细壁细胞都
16、能长出细胞克隆，其中部分细胞渐渐死亡。大部分文献都将这种贴壁胞渐渐死亡。大部分文献都将这种贴壁细胞描述为感染了细胞描述为感染了EBVEBV的淋巴母细胞，的淋巴母细胞，但尚未提出有力证据但尚未提出有力证据梭形的贴壁生长的细胞梭形的贴壁生长的细胞, ,胞体透亮胞体透亮, ,散在分布散在分布, ,是是LCLsLCLs生长的种子生长的种子LCL1-5LCL1-5、LCL2-5LCL2-5、LCL3-5LCL3-5、LCL4-30LCL4-30、LCL5-30LCL5-30均能在软琼脂上生长形成集落均能在软琼脂上生长形成集落100100倍倍 5 5株株LCLsLCLs接种在接种在2222只（不包括治疗组
17、）只（不包括治疗组）NOD-SCIDNOD-SCID小鼠的腹腔和右侧大腿皮下。小鼠的腹腔和右侧大腿皮下。有有2121只小鼠在腹腔形成了肿瘤，腹腔肿只小鼠在腹腔形成了肿瘤，腹腔肿瘤发生率达瘤发生率达95%95%；有；有9 9只小鼠在大腿皮下只小鼠在大腿皮下形成了肿瘤，皮下的肿瘤发生率为形成了肿瘤，皮下的肿瘤发生率为41%41%。所有的实验小鼠的存活天数都在所有的实验小鼠的存活天数都在2828d d以上以上LCLsLCLs在在NO-SCIDNO-SCID小鼠腹小鼠腹 腔腔 内内 成成 瘤瘤 肿瘤发生数（肿瘤发生数（p0.05p0.05）细胞株胞株NO-SCIDNO-SCID小鼠（只）小鼠（只）腹腹
18、 腔腔 内内 成成 瘤瘤肿瘤瘤发生的生的鼠数（只）鼠数（只）实验2020天天时小鼠腹腔触小鼠腹腔触诊实验3030天天时小鼠小鼠腹腔触腹腔触诊LCL1-5LCL1-54 44 4腹腔柔腹腔柔软可触及腹腔包可触及腹腔包块LCL2-5LCL2-54 44 4腹腔柔腹腔柔软可触及腹腔包可触及腹腔包块LCL3-5LCL3-54 43 3腹腔柔腹腔柔软可触及腹腔包可触及腹腔包块LCL4-30LCL4-305 55 5可触及腹腔包可触及腹腔包块腹壁明腹壁明显隆起隆起LCL5-30LCL5-305 55 5可触及腹腔包可触及腹腔包块腹壁明腹壁明显隆起隆起3030d d时处死小鼠，解剖观察瘤体。时处死小鼠，解剖
19、观察瘤体。LCLsLCLs在在NOD-SCIDNOD-SCID小鼠腹小鼠腹腔内形成的肿瘤和周围组织粘连，累及肠系膜等。瘤体腔内形成的肿瘤和周围组织粘连，累及肠系膜等。瘤体积虽大，但仅见少量腹水，未见有肝脏、肺的转移积虽大，但仅见少量腹水，未见有肝脏、肺的转移( (图图a)a)。发生在小鼠大腿皮下的肿瘤同样与附近的皮下组织和横发生在小鼠大腿皮下的肿瘤同样与附近的皮下组织和横纹肌粘连纹肌粘连( (图图b)b)。离体的瘤组织呈结节状，界限清楚，无离体的瘤组织呈结节状，界限清楚，无包膜包膜abca b 瘤组织的瘤组织的HEHE染色切片染色切片( (a50 b400)a50 b400)肿瘤细胞弥漫排列，
20、间质纤维稀少。瘤细胞较肿瘤细胞弥漫排列，间质纤维稀少。瘤细胞较大，形态多样，呈现大裂大，形态多样，呈现大裂- -无裂混合细胞，浆样淋无裂混合细胞，浆样淋巴细胞和免疫母细胞样形态，核分裂常见，可见巴细胞和免疫母细胞样形态，核分裂常见，可见瘤巨细胞。胞浆丰富淡红染，核膜清楚，核染色瘤巨细胞。胞浆丰富淡红染，核膜清楚，核染色质呈粗颗粒状，可见质呈粗颗粒状，可见1-31-3个大小不等的核仁个大小不等的核仁肿瘤组织病理学肿瘤组织病理学a 部分瘤细胞部分瘤细胞Lmp1Lmp1阳性，定位于胞膜阳性，定位于胞膜( (a50 b400)a50 b400)b Lmp1的免疫组织化学染色a b 瘤组织瘤组织B B淋
21、巴细胞标记淋巴细胞标记( (L26)L26)阳性阳性, , 定位于定位于胞膜。因此，肿瘤的免疫病理类型是人源胞膜。因此，肿瘤的免疫病理类型是人源B B细胞性淋巴瘤细胞性淋巴瘤 ( (a50 b400)a50 b400)B淋巴细胞标记(L26)免疫组织化学染色 五个五个LCLsLCLs细胞株中细胞株中LCL1-5LCL1-5、LCL2-5LCL2-5、LCL3-5LCL3-5检测不到端粒酶的活性，检测不到端粒酶的活性，LCL4-LCL4-3030和和LCL5-30LCL5-30则有较强的端粒酶活性则有较强的端粒酶活性端粒端粒酶酶活性活性细胞株胞株腹腹 腔腔 内内 成成 瘤瘤皮皮 下下 成成 瘤瘤
22、成瘤率成瘤率（p0.05p0.05）实验2020天天时小鼠腹腔触小鼠腹腔触诊成瘤率成瘤率( (f=16.3 f=16.3 v=1 v=1 p0.05)p0.05)平均瘤体大平均瘤体大小（小（cmcm3 3）- -LCL1-5LCL1-592%92% 可触及腹腔可触及腹腔包包块 0 0LCL2-5LCL2-5LCL3-5LCL3-5+ + LCL4-30LCL4-30100%100%腹腔柔腹腔柔软90%90%1.51.5x1.2x0.5x1.2x0.5LCL5-30LCL5-30LCLsLCLs端粒酶活性和端粒酶活性和NOD-SCIDNOD-SCID小鼠体内成瘤的关系小鼠体内成瘤的关系课题组成员课题组成员徐曼博士后张彦博士生熊建军博士生何霞 硕士生杨黎硕士生王嘉励硕士生谢谢谢谢
