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1、宁波市疾控中心 微生物检验所杨 元 斌May 6th, 2014霍乱弧菌的检测学习要点：霍乱弧菌概述与分类霍乱弧菌的标本采集霍乱弧菌的分离培养霍乱弧菌的鉴定霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。典型临床表现：剧烈的呕吐、腹泻（无痛性） 、米泔水样便、脱水，死亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。一、概述大便小便病原学病原学形态：霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染形态：霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色色阴性阴性菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.51.52.02.0m,m,宽宽0.3
2、0.30.40.4m m 。菌体尾端有单鞭毛，运动极为活泼，在暗视菌体尾端有单鞭毛，运动极为活泼，在暗视野显微镜下呈野显微镜下呈流星样运动流星样运动，培养温度以，培养温度以3737为最适宜为最适宜，在碱性（，在碱性（PH8.8PH8.89.09.0）肉汤（或肉汤（或蛋白胨）培养基上易于生长蛋白胨）培养基上易于生长（耐碱怕酸）（耐碱怕酸） 革兰染色鞭毛染色霍乱弧菌涂片、染色根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成200个血清群个血清群。根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集非非O1群霍乱弧菌：群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。分群与分型1、古典
3、生物型（前、古典生物型（前6次大流行）次大流行）2、E1 Tor 生物型（第生物型（第7次次 1961年来）。年来）。两个生物型具有相同的血清型。我国流行以El Tor霍乱弧菌为主。O1群霍乱弧菌的生物型古典生物型与El-Tor生物型区别特征古典生物型El-Tor 生物型羊红细胞溶血-D鸡红细胞凝集-+V-P试验-+多粘菌素B敏感试验+-IV组噬菌体裂解+-V组噬菌体裂解-+O1群霍乱弧菌的血清分型及抗原成份型别别名O抗原成份原型稻叶型（Inaba）A、C异型小川型（Ogawa）A、B（少量C）中间型彦岛型（Hikojima）A、B、CO139群霍乱弧菌1992年，在印度印度马德拉斯、泰米尔纳
4、德发生的霍乱疫情，分离到的菌株不与O1群霍乱血清凝集，但是引起O1群霍乱的典型症状。引起WHO重视，定为O139群霍乱弧菌，被认为下一次霍乱大流行主角。非O1群霍乱弧菌（O139霍乱）生化特征与生化特征与O1O1菌基本相同。菌基本相同。含有与含有与O O1 1群霍乱弧菌相同群霍乱弧菌相同毒力基因毒力基因除除O O抗原不同外抗原不同外，其它性状均与，其它性状均与EL-TorEL-Tor生物型相似。生物型相似。毒力蛋白及其调控因子与毒力蛋白及其调控因子与El-TorEl-Tor霍乱具有高度同源的霍乱具有高度同源的编码。编码。O139O139霍乱弧菌菌可以产生霍乱弧菌菌可以产生荚膜荚膜与与O1O1群
5、霍乱无交叉免疫力群霍乱无交叉免疫力环境适应能力强环境适应能力强耐药性强耐药性强O139群霍乱弧菌的生物学特征二、标本的采集与送检概述概述：标本采集：标本采集：标本采集：标本采集： 病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前未使用抗生素之前未使用抗生素之前未使用抗生素之前 “ “健康健康健康健康” ”人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境
6、类样品 监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等标本运送：标本运送：标本运送：标本运送：一般要求在一般要求在一般要求在一般要求在6 6小时内室温（小时内室温（小时内室温（小时内室温（20-25 20-25 ）条件下送达实验室检测，）条件下送达实验室检测，）条件下送达实验室检测，）条件下送达实验室检测， C-BC-B运输培养基（运输培养基（运输培养基（运输培养基（pH8.4pH8.4）; ; （或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液） 碱性蛋白胨水（碱性蛋白胨水（碱性蛋白胨水（碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2pH8.4
7、-9.2） ：培养基质量的保证：碱性胨水要培养基质量的保证：碱性胨水要澄清透明澄清透明（表明未长细菌）、（表明未长细菌）、 8-10ml 8-10ml量要足量要足。不符合规定，立即通知相关实验室或不符合规定，立即通知相关实验室或CDCCDC更换。更换。便量合适：不要太少，不能太多（改变培养基的便量合适：不要太少，不能太多（改变培养基的pHpH）。）。送检及时：送检及时：6h6h内送检。内送检。1、粪便标本 （1）采样 逢疑必采 应在发病早期，服用抗菌药物之前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm-5cm处采取，
8、水样便采取1ml-3ml，成型便采取指甲盖大小的粪便量。 病人的呕吐物，沾染粪便的衣服和用具，也可作为检材。注意！因腹泻病因复杂，霍乱轻型病例的症状与体征很不明显，不易与其他病因引起的腹泻相区别。因此，霍乱流行季节，逢泻必采是必须遵守的原则（2）送检 剧烈腹泻病人的水样便含有大量病菌，直接分离培养不难检出阳性。条件允许的医院，通知实验室人员直接水样便接种四号平板培养。缩短检测时间。不能立即检查的，要接种于培养基内，尽快送往检验室。送检标本可放入（PH8.6-9.0）碱性蛋白胨水（不是最佳不是最佳的，尤其的，尤其6 6小时内还不能进行培养时，尽量采用小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-BC-B
9、运输运输培养基。）培养基。），也可放入文腊二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基中。水体的采样一般要求用灭菌的500ml 水样瓶采集相对静止的表层水 （水面30cm 以内）450ml，加盖密封后快速送检。取水点的选择应结合流行病学调查等资料确定，同时，采样时应选择在水流平稳或静止处吸取。非疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时，此时水体未受人群活动等因素影响。2、水样标本水生动物的采样通常选取活的或新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采集合适的部位，如鳃部和/或肠内容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封，在常温下送检。有条件的采样点可将水生动物整体采
10、回实验室再进行相关处置。同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表、鳃及/或肛门，置碱性蛋白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。3、生物标本增菌：碱性蛋白胨水（pH 8.6）作为增菌液；分离：强选择性分离培养基（庆大霉素培养基或TCBS 培养基或4号培养基）分离；弱选择性培养基使用碱性琼脂或碱性胆盐琼脂。应注意不同厂商以及不同批号培养基的质量，每批培养基在使用前必须进行质量检测。三、霍乱弧菌的培养分离 挑取粪便，直接接种于挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。号平
11、板，第一板）。 第一管第一管碱性蛋白胨水在碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划增菌小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取0.10.10.2 0.2 mlml表层培养物表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 第二管第二管第二管第二管碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号平板，第三板）。平板，第三板）。分离培养要点（两管三板法）：分离培养要点（两管三板法）： 经典的鉴定步骤要求经典的鉴定步骤要求经典的鉴定
12、步骤要求经典的鉴定步骤要求每个平板应每个平板应每个平板应每个平板应挑取挑取挑取挑取5 5 5 5个以上个以上个以上个以上可疑菌落可疑菌落可疑菌落可疑菌落, , , ,转种于转种于转种于转种于克氏双糖斜面克氏双糖斜面克氏双糖斜面克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面或者普通琼脂斜面或者普通琼脂斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后待分纯培养后待分纯培养后待分纯培养后, , , ,再进行再进行再进行再进行O1O1O1O1、O139O139O139O139群血清玻片凝集试验，鉴群血清玻片凝集试验，鉴群血清玻片凝集试验，鉴群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑于对霍乱疫情应急处理的考虑于对霍乱疫情应急处理的
13、考虑于对霍乱疫情应急处理的考虑, , , ,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法试验前置的做法试验前置的做法试验前置的做法, , , ,作为快速筛查的手段作为快速筛查的手段作为快速筛查的手段作为快速筛查的手段, , , ,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行直接对平板上生长的单个可疑菌落进行直接对平板上生长的单个可疑菌落进行直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验玻片凝集试验玻片凝集试验玻片凝集试验, , , ,出现明显凝集时可做初步报告出现明显凝集时可
14、做初步报告出现明显凝集时可做初步报告出现明显凝集时可做初步报告, , , ,对平板上出现可疑凝集的菌株必对平板上出现可疑凝集的菌株必对平板上出现可疑凝集的菌株必对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于须马上转种于须马上转种于须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面, , , ,待纯培养物生长良好后再次进待纯培养物生长良好后再次进待纯培养物生长良好后再次进待纯培养物生长良好后再次进行行行行玻片凝集试验加以确证。玻片凝集试验加以确证。玻片凝集试验加以确证。玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和庆大霉素平板和庆大霉素
15、平板和庆大霉素平板和4 4 4 4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBSTCBSTCBSTCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）
16、：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。润湿、稍凸起、边缘整齐。润湿、稍凸起、边缘整齐。润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBSTCBS平板生长的菌落不能直挑取进行平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集玻片凝集玻片凝集玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验） 可疑菌落的挑取可疑菌落的挑取4号平板T
17、CBS 平板培养菌落形态（呈黄色）染色镜检染色镜检染色镜检染色镜检 革兰染色阴性的短杆菌革兰染色阴性的短杆菌革兰染色阴性的短杆菌革兰染色阴性的短杆菌血清凝集试验血清凝集试验血清凝集试验血清凝集试验： 分别使用分别使用分别使用分别使用O1O1O1O1群，群，群，群，O139O139O139O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。凝集，以排除与生理盐水发生凝集的
18、自凝菌。凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，O1O1O1O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝
19、集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上
20、才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少量的量的量的量的CCCC抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。清凝集有明显优势时应维持
21、小川型的判定。清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，生理盐水不凝集，O139O139O139O139群血清明显凝集的菌落，一般为群血清明显凝集的菌落，一般为群血清明显凝集的菌落，一般为群血清明显凝集的菌落，一般为O139O139O139O139群，但其与群，但其与群，但其与群，但其与O22O22O22O22群群群群及及及及O155O155O155O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。群甚至一些非霍乱弧菌会出现交
22、叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌株都进行凝集试验，以免遗漏。四、霍乱弧菌鉴定四、霍乱弧菌鉴定- -玻片凝集玻片凝集霍乱弧菌的血清学鉴定要点9cm平板，1划1，严禁1划2。纯培养做血清学鉴定。凝集，肉眼可见大颗粒。不要误判。血清学凝集同时做盐水凝集对照，自凝菌排除。血清学凝集覆盖O1与O139。霍乱弧菌鉴定，以血清学为主，血清学凝集阳性即可初步报告。区别于肠杆菌科细菌（生化报告）。进一步实验氧化酶试验氧化酶试验 1
23、1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验粘丝试验0.5去氧胆酸钠水溶液去氧胆酸钠水溶液 进一步实验生化鉴定生化鉴定生化鉴定生化鉴定 生化鉴定管：生化鉴定管：生化鉴定管：生化鉴定管： 发酵葡萄糖、甘露醇、发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+ +） 精氨酸双水解酶（精氨酸双水解酶（- -） 霍乱弧菌生化鉴定管（霍乱弧菌生化鉴定管（霍乱弧菌生化鉴定管（霍乱弧菌生化鉴定管（11111111种生化种生化种生化种生化, , , ,套装，环凯）；套装，环
24、凯）；套装，环凯）；套装，环凯）； 生化鉴定条：梅里埃生化鉴定条：梅里埃生化鉴定条：梅里埃生化鉴定条：梅里埃API 20EAPI 20EAPI 20EAPI 20E鉴定条等鉴定条等鉴定条等鉴定条等 全自动生化检测仪检测：梅里埃全自动生化检测仪检测：梅里埃全自动生化检测仪检测：梅里埃全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2 COMP VITEK2 COMP VITEK2 COMP VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等全自动生化鉴定卡等全自动生化鉴定卡等全自动生化鉴定卡等进一步分型鉴定进一步分型鉴定进一步分型鉴定进一步分型鉴定( ( ( (省省省省CDCCDCCDCCDC进行进行进行进行)
25、) ) ) 噬菌体分型噬菌体分型噬菌体分型噬菌体分型 PFGEPFGEPFGEPFGE脉冲场分型脉冲场分型脉冲场分型脉冲场分型快速检测试剂盒快速检测试剂盒1 1荧光荧光PCRPCR O1O1O1O1群、群、群、群、 O139O139O139O139群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒 霍乱霍乱霍乱霍乱CTXCTXCTXCTX毒力基因荧光检测试剂盒毒力基因荧光检测试剂盒毒力基因荧光检测试剂盒毒力基因荧光检测试剂盒 2 2 2 2胶体金技术胶体金技术胶体金技术胶体金技术 荧光荧光PCR检测霍乱弧菌检测霍乱弧菌-初筛初筛检验程序标本增菌培养碱性蛋白胨水分离培养（TCBS、碱性平板）生化鉴定分型血清学鉴定确诊报告初步报告快速诊断直接涂片动力、制动试验TEL 0574-87274563谢谢大家！
