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1、E玫瑰花环形成实验Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望 u 掌握掌握E花环形成的原理u 熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E 花环的形态u 熟悉磁珠分离的原理 实验目的T T细胞的表面分子细胞的表面分子是是T T细胞与其细胞与其它细胞和分子间相互识别及作它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础。它们在用的物质基础。它们在T T细胞活细胞活化、增殖和分化等过程中起重化、增殖和分化等过程中起重要作用。要作用。 TCR-CD3 TCR-CD3复合物参与复合物参与T T细胞的细胞的抗
2、原识别和信号转导；抗原识别和信号转导； CD2 CD2、CD28CD28、CTLA-4CTLA-4、CD45CD45、CD40L CD40L 等膜蛋白参与等膜蛋白参与T T细胞活化细胞活化及及T T细胞与其它细胞间相互作用。细胞与其它细胞间相互作用。 CD4/CD8 CD4/CD8分子辅助分子辅助TCRTCR识别结识别结合抗原，参与信号转导；根据合抗原，参与信号转导；根据CD4CD4和和CD8CD8分子的表达将其分为分子的表达将其分为CD4CD4+ +T T和和CD8CD8+ +T T细胞。细胞。T细胞细胞CD2CD3TCRCD8密度梯度离心法密度梯度离心法CD4T T细胞表面分子细胞表面分子
3、依靠表面标记的分离方法 流式细胞术分离法流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来。 * * 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠磁珠(microbead)标记细胞上的磁珠在扫标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到描电镜下也几乎看不到磁珠分离策略：磁珠分离策略：一一. . 阳性分选阳性分选磁珠标记目的细胞磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出未标记细胞
4、先行流出移出磁场后收移出磁场后收集目的细胞集目的细胞CD4+T细胞细胞分离柱分离柱CD4-T细胞细胞磁珠标记非目的细胞磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出目的细胞先行流出二二. . 阴性分选阴性分选成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例。E花环分离法原理* TTBSRBCCD2实验材料1.肝素抗凝血2.Hanks液3.淋巴细胞分离液4.绵羊红细胞悬液5.灭活小牛血清6.水平离心机、37温箱、显微镜等实验方案取外周血取外周血绵羊红细胞绵羊红细胞淋巴细胞淋巴细胞
5、分离显微镜下观察显微镜下观察+实验步骤淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离用用Hanks液配成液配成10106 6细胞细胞/0.1/0.1mlml加等量灭活小牛血清加等量灭活小牛血清(0.1ml)取取0.1ml加入加入0.50.5绵羊红细胞绵羊红细胞0.2ml混匀，混匀，3737温箱放置温箱放置5 5分钟分钟1000rpm离心离心5min加加1 1小滴小滴1 1美蓝，用毛细吸管轻轻混匀美蓝，用毛细吸管轻轻混匀取取1 1滴于玻片上，加上盖玻片滴于玻片上，加上盖玻片高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞置置44冰箱冰箱5min30-45min结果判断结果判断u凡能结合三个以上绵羊红细胞者
6、为玫瑰花形成阳性细胞。正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。左左:（甲紫染色，（甲紫染色，800）：可见）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；淋巴细胞；右右:（吖啶橙染色）：图中可见（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。 T淋巴细胞玫瑰花环T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500测定外周血中的T细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等。临床应用注意事项注意事项1. 实验血液新鲜分离:是为了保证淋巴细胞 的活性,不影响E玫瑰花环形成率。2. 绵羊红细胞要新鲜,采用无菌脱纤维羊血。Thanks!
