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1、第第2节蛋白质的提取和分离节蛋白质的提取和分离学习导航学习导航1.尝试蛋白质的提取和分离。尝试蛋白质的提取和分离。2解释蛋白质提取和分离的基本原理。解释蛋白质提取和分离的基本原理。新知初探新知初探思维启动思维启动一、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离一、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离1实验原理实验原理(1)特特点点：可可以以与与特特定定的的底底物物进进行行反反应应，形形成成特特殊的蓝紫色产物。殊的蓝紫色产物。(2)提提 取取 时时 的的 要要 求求 ： 必必 须须 提提 供供 必必 要要 的的_和和_环境以保持其生物活性。环境以保持其生物活性。(3)分离方法：分离方法：_。缓冲系统缓冲系统低温低温琼脂
2、糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2实验步骤实验步骤(1)提取过程提取过程制备匀浆：取制备匀浆：取5 g_的动物心脏，漂洗的动物心脏，漂洗干净后、剪碎到预冷的玻璃匀浆器中，加入干净后、剪碎到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL_、_研磨成研磨成匀浆匀浆获取酶：将匀浆收集到冰浴的离心管中，在获取酶：将匀浆收集到冰浴的离心管中，在4 条件下条件下12000 rpm离心离心10 min。吸取。吸取_在在4 条件下保存备用条件下保存备用新鲜新鲜磷酸提取缓冲液磷酸提取缓冲液冰浴冰浴上清液上清液(2)分离过程分离过程制琼脂糖凝胶电泳板：用制琼脂糖凝胶电泳板：用_配制质量分数为配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，加热溶解后
3、的琼脂糖凝胶，加热溶解后混匀，缓缓倒入胶床中，插入适当的梳子，室混匀，缓缓倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入_中，向电泳槽中加入适量的中，向电泳槽中加入适量的TBE电泳缓冲液电泳缓冲液TBE电泳缓冲液电泳缓冲液电泳槽电泳槽加样、电泳：取适量同工酶提取液与加样、电泳：取适量同工酶提取液与_的的_混匀，取混匀，取20L加入加入_内，内，100 V条件下进行电泳条件下进行电泳30 min。染色、观察：当溴酚蓝指示剂电泳到染色、观察：当溴酚蓝指示剂电泳到_时切断电源，取出凝胶板浸时切断电源，取出凝胶板浸入染色液中，入染色液中，37
4、 染色染色1530 min后，取后，取出出_，观察电泳结果，观察电泳结果等量等量载样缓冲液载样缓冲液样品孔样品孔凝胶底部凝胶底部水洗水洗为什么提取乳酸脱氢酶同工酶时选择的材料要为什么提取乳酸脱氢酶同工酶时选择的材料要用新鲜的？用新鲜的？【提示提示】新鲜的材料细胞中酶的活性高。新鲜的材料细胞中酶的活性高。想一想想一想二、相关基础知识二、相关基础知识1同工酶同工酶指催化相同的化学反应，而酶蛋白的指催化相同的化学反应，而酶蛋白的_、_乃乃至至免免疫疫学学性性质不同的一组酶。质不同的一组酶。2乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(1)种类：一般含有种类：一般含有5种同工酶。种同工酶。(2)特点：相对分子质量相同，但所
5、带电荷不特点：相对分子质量相同，但所带电荷不同，电泳的结果应该形成同，电泳的结果应该形成_个条带。个条带。分子结构分子结构理化性质理化性质5(1)同工酶之间的空间结构一定不同同工酶之间的空间结构一定不同()(2)乳酸脱氢酶的催化底物是乳酸乳酸脱氢酶的催化底物是乳酸()(3)乳酸脱氢酶同工酶具有不同净电荷、相乳酸脱氢酶同工酶具有不同净电荷、相同的分子大小和形状同的分子大小和形状()判一判判一判要点突破要点突破讲练互动讲练互动要点一要点一电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶电泳法分离乳酸脱氢酶同工酶1概念概念指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2原理原理不同蛋白质的带
6、电性质、电量、形状和大小不不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力方向、大小、阻力同，在电场中受到的作用力方向、大小、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。运动速度不同。3常用方法常用方法(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速度因荷，所以，各种分子在电场中的迁移速度因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。不同而不同，从而得以分离。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳右图
7、表示对某蛋白质溶液进行琼脂糖凝胶右图表示对某蛋白质溶液进行琼脂糖凝胶电泳的结果电泳的结果(相似于纸层析法分离色素相似于纸层析法分离色素)，下列，下列相关叙述不正确的是相关叙述不正确的是()例例例例1 1A蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子电场中带电的蛋白质分子(或多肽或多肽)会向着与其会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动B蛋白质在琼脂糖凝胶中的迁移速度完全取蛋白质在琼脂糖凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少决于其所带净电荷多少C蛋白质在琼脂糖凝胶中的迁移速度主要取蛋白质在琼脂糖凝胶中的迁移速度主要取决于相对
8、分子质量的大小、形状、所带净电荷决于相对分子质量的大小、形状、所带净电荷D电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种【解析解析】蛋白质的氨基与羧基可发生解离，蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。蛋白使其带正电或负电，在电场中发生迁移。蛋白质在凝胶中迁移速率主要取决于其所带净电荷质在凝胶中迁移速率主要取决于其所带净电荷的多少和性质、分子的大小和性状。的多少和性质、分子的大小和性状。【答案答案】B(1)如果蛋白质指的乳酸脱氢酶同工酶，如果蛋白质指的乳酸脱氢酶同工酶，B选项选项说法正确吗？说法正确吗？(2)如果是乳酸脱氢酶同工酶，电泳结果会出几
9、如果是乳酸脱氢酶同工酶，电泳结果会出几条色带？条色带？【提示提示】(1)正确，因为乳酸脱氢酶同工酶相正确，因为乳酸脱氢酶同工酶相对分子质量相同，所带净电荷不同。对分子质量相同，所带净电荷不同。(2)5条。条。互动探究互动探究1凝胶材料凝胶材料所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。小球体内部有许多贯穿的通葡聚糖或琼脂糖。小球体内部有许多贯穿的通道。道。要点二要点二凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质2原理原理凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对凝胶色谱法
10、也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。分分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。胶颗粒内部，路程长，流动慢。用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质()A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快例例例例2 2【
11、答案答案】DSDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法中中加加入入SDS的的作用是作用是()A增大蛋白质的相对分子质量增大蛋白质的相对分子质量B改变蛋白质分子的形状改变蛋白质分子的形状C掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别D减少蛋白质分子的相对分子质量减少蛋白质分子的相对分子质量变式训练变式训练解析：选解析：选C。在样品和凝胶中加入。在样品和凝胶中加入SDS后，分后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白质结合成蛋白质SDS复合物，所带的负电复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这样就消荷大大超过了
12、蛋白质原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电除了不同分子间的电1荷差异和结构差异，从荷差异和结构差异，从而达到仅根据蛋白质相对分子质量的不同而分而达到仅根据蛋白质相对分子质量的不同而分离蛋白质的目的。离蛋白质的目的。对凝胶色谱法和电泳法分离蛋白质混淆不清对凝胶色谱法和电泳法分离蛋白质混淆不清有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是是()A它们都是分离蛋白质的重要方法它们都是分离蛋白质的重要方法B它们的原理相同它们的原理相同C使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要不需要D以上说法都正确以上说法都正确易错警示易错警示易错警示易
13、错警示例例例例【解析解析】凝胶色谱法是根据相对分子质量凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离或鉴定。所以分子的分离或鉴定。所以A正确，正确，B错；这错；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以碱度，所以C错误。综上所述，答案选错误。综上所述，答案选
14、A。【答案答案】A【纠错总结纠错总结】(1)分离不同蛋白质的基本原理分离不同蛋白质的基本原理根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质。如分子根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质。如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等。吸附性质和对其他分子的亲和力等等。(2)缓冲溶液缓冲溶液无论是凝胶色谱法还是电泳法均使用缓冲溶液，无论是凝胶色谱法还是电泳法均使用缓冲溶液，其目的是维持蛋白质的活性，或维持蛋白质所带其目的是维持蛋白质的活性，或维持蛋白质所带电荷。电荷。(3)应用应用琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。易洗脱，便于定量测定。测定蛋白质的相对测定蛋白质的相对分子质量常用分子质量常用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质。而非所带电荷的性质。
