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1、小鼠骨髓细胞微核试验受试物: 环磷酰胺受试动物: 小鼠实验目的实验目的 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验的原理和方法 细胞分裂分为四个期细胞分裂分为四个期：1、G1期（DNA合成前期）：细胞生长，为DNA复制做 准备。2、S期（DNA合成期）：体细胞的DNA含量由2C增加到4C3、G2期(DNA合成后期)：该期主要为M期作准备，包括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化,有关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后期（微核形成期），末期图图13-1 13-1 细胞周期可划分为四个阶段细胞周期可划分为四个阶段 微核微核（micronucleus） 是染色体或
2、染色单体的无着丝点片断或纺锤体受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在细胞质中，末期后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫微核。 原理：原理：1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中 结论结论： 微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为在此阶段，主核排出，易于观察微核，这些细胞保持其嗜碱
3、性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中操作步骤：操作步骤：一染毒：染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次，0、24小时各染毒一次，6h后取样染毒剂量：50mg/kg二处死：颈椎脱臼法处死小鼠三：骨髓液的制备和涂片1 处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片 2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇固定15分钟，取出晾干 3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储备液一份加的磷酸盐缓冲液9份）染色1015分钟，细流
4、水冲掉玻片染色液，晾干 四观察和计数： 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形，边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以出现一个或多个微核。 计数：1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中PCE/NCE的比值结果与分析： 1 结果：试验只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每组的雌雄动物分开计数微核PCE均值。2 分析：正常的PCE/NCE比值为1（），如果，则表示PCE形成受到严重抑制；如果，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。 图图 1 1 ：正常嗜多染红细胞：正常嗜多染红细胞
5、 PCE PCE （ 400 400 ） 图图 2 2 带微核嗜多染红细胞带微核嗜多染红细胞 MNPCE MNPCE （ 400 400）微核微核嗜多染嗜多染细胞胞 注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色流程图 处死小鼠，取胸骨处死小鼠，取胸骨 推片推片 固定（甲醇固定固定（甲醇固定15分钟）分钟） 染色（吉姆萨染色染色（吉姆萨染色15分分钟）钟） 观察并记数观察并记数
