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1、分子生物学 PCR技术的原理、操作及应用技术的原理、操作及应用 西南大学西南大学 生命科学学院生命科学学院 范范 迪迪 2013.04.11 什么是什么是PCR ?PCR: Polymerase Chain Reaction ，即聚合酶链式反应 ?是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的发展历史技术的发展历史 1985 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 Science 杂志上发表 1989 Science 杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。12月Sci
2、ence 杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR 的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR技术的原理技术的原理 1 遗传物质： 细胞核? 染色体? DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。 DNA双螺旋结构和遗传密码子的发现，开创了分子生物学的时代。 PCR技术的原理技术的原理 2 基本原理 ? DNA的半保留复制原则 ? 碱基互补配对原则 TA TA GC
3、CG AT A-T A-T AT CG GC G-C T A -T GC CG AT A-T A-T AT CG GC GC T A A A=T，G=C PCR 的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 AT GC CG AT A-T A-T AT CG GC GC PCR技术的原理技术的原理 3 ?PCR 反应的体系 ? 包括7种基本成分： 模板 （Template DNA ） 引物 （Primer） Taq DNA聚合酶 dNTP Taq聚合酶缓冲液 （Taq
4、Buffer ） PCR技术的原理技术的原理 4 ?基本反应步骤 ： 变性(denaturation) -高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing) -引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension) -Taq酶作用下，不断向引物3端添加dNTP，DNA链不断延伸 PCR技术的原理技术的原理 5 以温度变化来控制反应阶段以温度变化来控制反应阶段 1 2 3 94 温度 高温变性 低温退火 适温延伸 形成重复13步 2535轮 72 55 （） DNA2 条 变单 性链子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 22
5、DNA双螺旋 1 2 3 时间（min） 4 5 PCR技术的优点技术的优点 优点: ?特异 灵敏度高 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU ?简便、快速、自动化 1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 ?对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR技术的局限性技术的局限性 ?为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 ?聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。
6、?PCR 技术扩增产物的长度有限。 标准的标准的PCR反应体系反应体系 10扩增缓冲液 5 ul 模板DNA 0.12 ug 引物 各10100 pmol 4种dNTP混合物 各200 umol/L Taq DNA聚合酶 2.5 U Mg2+ 1.5 mmol/L 加双蒸水至 50 ul ?可以按照比例放大或者缩小体系，不同的可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化反应需要优化 ?按照实验方案进行即可按照实验方案进行即可 PCR循环参数循环参数 （热力学参数）（热力学参数） 94 ，3min； 94 ，45s ； 58 ，1min； 72 ，1min；循环30次 72 ，10mi
7、n； 16 保温 94 预变性，3min 使DNA双链完全打开 变性： 94 变性，45s 使双链DNA解链为单链 94 ，3min； 94 ，45s ； 退火： 58，1min 58 ，1min； 循环30次 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特72 ，1min； 异性结合，降低温度可增加反应的72 ，10min； 灵敏性。 16 保温 延伸：72 ，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 时间由扩增片段的长度决定 1min 扩增1KB PCR扩增产物检测扩增产物检测 1 ? 凝胶电泳缓冲液配方 ?10TBE缓冲液(每升) ：Tris107.8g Boric Ac
8、id55.0g EDTA(Na2)8.2g 10TAE缓冲液(每升) ：Tris48.4g 冰乙酸 11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml ? 用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ul PCR 产物上样至胶中。 ? 100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。 PCR扩增产物检测扩增产物检测 2 ?PCR 扩增产物检测及结果判定 PCR技术的注意事项技术的注意事项 ?防止污染，建立良好的质量控制，避免污染。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100 对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 设置对照： PCR反应针对
9、模板有阳性/阴性对照 阳性：验证PCR反应体系和条件的正确性 阴性：验证PCR反应有无污染 PCR技术的应用技术的应用 ?基因克隆、测序和表达等 ?法医学个体识别和亲子鉴定 ?遗传性疾病检测、肿瘤诊断、病原体检测等 基因克隆和表达基因克隆和表达 DNA指纹技术指纹技术 1 ? 1984 年英国的遗传学家Alec Jeffreys 在进行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上重复着一种小片段DNA，这一含15个左右碱基的DNA片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同，Jeffreys 首先在自己的DNA上进行研究，验证了这一技术，如果我们有血缘关系，这些不
10、同会大大缩小。 Jeffreys 命名这一技术为DNA指纹技术（DNA finger print）。 DNA指纹技术指纹技术 2 ?采集血样（毛发、精液、口腔粘膜细胞），分离DNA，用PCR 将选定的DNA片段放大，并进行对比，统计分析，便可得出是否为作案凶手或是否有血缘关系。 分子诊断学分子诊断学 ?分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据 。 分子诊断学的发展阶段分子诊断学的发展阶段 分子诊断学大致经历了3个阶段： ? （1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； ? （2）以PCR 技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR 和实时PCR 的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量 ? （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等 。
