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1、紫外紫外- -可见分光光度法在可见分光光度法在药品检验中的应用药品检验中的应用1234分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法在药检中应用在药检中应用content概述概述一一.概述：概述：l 分分光光光光度度法法是是通通过过测测定定物物质质在在某某些些特特定定波波长长处处或或一一定定范范围围内内的的吸吸光光度度或或发发光光强强度度，对对物物质质进进行行定定性性和和定定量量的的分分析析方方法法。紫紫外外- -可可见见分分光光光光度度法法具具有有操操作作简简便便快快速速、专专属属性性和和灵灵敏敏度度高高等等优优点点。因因此此在在药药
2、品品的的分分析析检检验验中中被被广广泛泛采采用用。在在各各国国药药典典中中药药品品的的理理化化常常数数、鉴鉴别别、检检查查和和含含量量测测定定等等各各个个项项目目中中都都能能见见到到紫紫外外- -可可见见分分光光光度法的应用实例。光度法的应用实例。一一.概述：概述：l吸吸收收光光谱谱：发发射射连连续续光光谱谱的的光光源源（如如氘氘灯灯和和钨钨丝丝灯灯）发发出出的的光光通通过过透透明明物物质质（固固体体、液液体体或或气气体体）后后，一一些些波波长长的的单单色色光光成成分分被被该该物物质质选选择择吸吸收收，在在原原来来的的连连续续光光谱谱上上出出现现若若干干条条暗暗线线或暗带，这种光谱叫做吸收光谱
3、。或暗带，这种光谱叫做吸收光谱。1234分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法在药检中应用在药检中应用content概述概述二二.分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理在在紫紫外外和和可可见见光光区区，灵灵敏敏度度和和精精密密度度较较高高，一一般般每每1 1mlml溶溶液液中中含含有有几几微微克克（ g g）的的物物质质即即可可测测定定，误误差差约约为为1-2%1-2%，在在此此区区域域内内，物物质质对对光光的的吸吸收收主主要要系系分分子子中中电电子子的的能能级级跃跃迁迁所所致致，同同时时伴伴有有分分子子的的振振动动和和转转动
4、动能能级级的的变变化化，电电子子吸吸收收光光谱谱一一般般比比较较平平缓缓，选选择择性性不不如如红红外外光光区区，故故紫紫外外- -可可见见光光区区主主要用于定量分析以及作为物理常数的测定。要用于定量分析以及作为物理常数的测定。红红外外光光区区的的灵灵敏敏度度和和精精密密度度较较低低，一一般般需需要要数数百百微微克克（ g g）的的供供试试品品进进行行测测定定，此此区区域域内内，物物质质对对光光的的吸吸收收系系由由分分子子中中振振动动和和转转动动能能级级的的跃跃迁迁引引起起，红红外外光光谱谱的的特特征征性性很很强强，特特别别是是在在7-157-15 m m（称称为为“指指纹纹区区”），吸吸收收峰
5、峰很很多多，而而且且尖尖锐锐。除除光光学学异异构构体体外外，不不会会遇遇到到两两种种不不同同的的化化学学物物质质完完全全相相同同的的红红外外吸吸收收光光谱谱，故故红红外外区区主主要要用用于于鉴鉴别别和和分分析析物物质的结构。质的结构。透透光光率率（T T）：单单色色光光通通过过一一物物质质的的溶溶液液时时，透透过过光光的的强强度度（I I）与与入入射射光光的的强强度度（I I0 0）之之比比。即：即：T=I/IT=I/I0 0。吸吸 光光 度度 （ A A） ： 透透 光光 率率 的的 负负 对对 数数 值值 . .即即: :A=log1/T= -logTA=log1/T= -logT比比耳耳
6、- -郎郎伯伯定定律律（Beer Beer -Lamberts -Lamberts LawLaw）：吸吸光光度度（A A）与与溶溶液液的的浓浓度度（C C）和和光光路路长长（L L）是成正比例的。即：）是成正比例的。即：A=ECLA=ECL比耳比耳- -郎伯定律适用范围：郎伯定律适用范围：l1.1.溶溶液液的的浓浓度度不不能能过过高高或或过过低低，使使测测定定结结果果的的相相对对误误差差最最小小的的最最佳佳透透射射率率为为T=37%T=37%左右。左右。l2.2.所所用用溶溶剂剂不不得得与与测测定定物物质质有有分分子子间间缔缔合合，生生成成复复合合物物、异异构构化化或或出出现现酸酸碱平衡碱平衡
7、。1234分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理紫外分光光度计的使用紫外分光光度计的使用紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法在药检中应用在药检中应用content概述概述三三.紫外紫外-可见分光光度计的使用可见分光光度计的使用l1.1.基本构造：基本构造：稳压电源光源波长选择装置样品池检测器记录装置2.2.仪器的校正和检定仪器的校正和检定l（1 1）波波长长的的校校正正：由由于于温温度度变变化化对对机机械械部部分分的的影影响响，仪仪器器的的波波长长经经常常会会略略有有变变动动，因因此此除除应应定定期期对对所所用用仪仪器器进进行行全全面面校校正正检检定定外外，还还应应于测定前校正测定波长。于测
8、定前校正测定波长。l钬玻璃在钬玻璃在279.4279.4nmnm、287.5nm287.5nm、333.7nm333.7nm、 360.9nm360.9nm、418.5nm418.5nm、460.0nm460.0nm、484.5nm484.5nm、536.2nm536.2nm与与637.5637.5nmnm的波长处有尖锐的吸收的波长处有尖锐的吸收峰，可作为波长校正用。峰，可作为波长校正用。 取在取在120120 C C干燥至恒重的基准重铬酸钾约干燥至恒重的基准重铬酸钾约6060mgmg，精密称定，用精密称定，用0.0050.005mol/Lmol/L硫酸溶液溶解硫酸溶液溶解并稀释至并稀释至10
9、001000mlml，在规定的波长处测定吸光度在规定的波长处测定吸光度并计算其吸收系数。并计算其吸收系数。（2 2）吸光度的准确度：）吸光度的准确度：波长波长（nmnm）235235（最小）（最小）257257（最大）（最大）313313（最小）（最小）350350（最大）（最大）吸收系数吸收系数（E E1%1%1cm1cm）124.5124.5144144.0.048.648.6106.6106.6许可范围许可范围123.0-126.0123.0-126.0142.8-146.2142.8-146.247.0-50.347.0-50.3105.5-108.5105.5-108.5 （3 3）
10、杂散光的检查：）杂散光的检查： 按下表的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。试剂试剂浓度浓度%（g/ml）波长波长（nmnm）透光率透光率（%）碘化钠碘化钠1.00 1.00 220220 0.8亚硝酸钠亚硝酸钠5.00 5.00 340340 0.83.3.紫外分光光度法对溶剂的要求紫外分光光度法对溶剂的要求 用用1 1cmcm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白，测石英吸收池盛溶剂，以空气为空白，测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应满足以下定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应满足以下要求：要求：波长波长 吸光度要求吸光度要求220220nm-
11、240nmnm-240nm不得超过不得超过0.400.40241241nm-250nmnm-250nm不得超过不得超过0.200.20251251nm-300nmnm-300nm不得超过不得超过0.100.10300300nmnm以上以上 不得超过不得超过0.050.054.4.紫外分光光度法测定法紫外分光光度法测定法测测定定时时，除除另另有有规规定定外外，应应以以配配制制供供试试品品溶溶液液的的同同批批溶溶剂剂为为空空白白对对照照，采采用用1 1cmcm的的石石英英吸吸收收池池，在在规规定定的的吸吸收收峰峰波波长长 2 2nmnm以以内内测测试试几几个个点点的的吸吸光光度度，以以核核对对供供
12、试试品品的的吸吸收收峰波长是否准确。峰波长是否准确。应以吸光度最大的波长作为测定波长。应以吸光度最大的波长作为测定波长。仪仪器器的的狭狭缝缝波波带带宽宽度度应应小小于于供供试试品品吸吸收收带带的的半半宽宽度度，否否则则测测得得的的吸吸光光度度会会偏偏低低。狭狭缝缝宽宽度度的的选选择择，应应以以减减小小狭狭缝缝宽宽度时供试品的吸光度不再增加为准。度时供试品的吸光度不再增加为准。由由于于吸吸收收池池和和溶溶剂剂本本身身可可能能有有空空白白吸吸收收，因因此此测测定定供供试试品品的吸光度后应减去空白读数，再计算含量。的吸光度后应减去空白读数，再计算含量。1234分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理
13、紫外分光光度计的使用紫外分光光度计的使用紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法在药检中应用在药检中应用content概述概述四四.紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法在药品检验中的应用在药品检验中的应用l药典和药品标准中应用紫外药典和药品标准中应用紫外- -可见分光光可见分光光度法的项目有度法的项目有吸收系数、鉴别、颜色检查、吸收系数、鉴别、颜色检查、纯度检查、溶出度、含量均匀度检查和含纯度检查、溶出度、含量均匀度检查和含量测定量测定等等。等等。1.吸收系数：吸收系数：l 药药品品的的吸吸收收系系数数是是药药品品的的理理化化特特性性常常数数，可可作作为为药药品品生生产产过过程程中中精精制制
14、纯纯化化的的一一种种指指标标。对对紫紫外外区区一一定定波波长长的的光光有有特特征征吸吸收收的的药药物物进进行行精精制制时时，应应进进行行到到产产品品在在其其特特定定波波长长测测定定吸吸收收系系数数达达到到一一个个稳稳定定的的最最大大值值时时为为止止，因因此此吸吸收收系系数数同同其其它它物物理理常常数数一一样样，也也可可作作为为判断药品纯度的依据。判断药品纯度的依据。2.鉴别：鉴别：l药药物物对对光光辐辐射射的的吸吸收收特特点点（即即其其吸吸收收光光谱谱）可可与与其其它它化化学学的的或或物物理理的的方方法法配配合合作作为为鉴鉴别别的的一一种种手手段段，即即绘绘制制出出药药物物的的吸吸收收光光谱谱
15、曲曲线线与标准品的吸收光谱互相核对。与标准品的吸收光谱互相核对。l对对于于具具有有两两个个以以上上最最大大吸吸收收的的药药物物可可以以进进一一步步简简化化操操作作，无无需需费费时时作作吸吸收收光光谱谱曲曲线线，只只要要测测出出各各最最大大吸吸收收波波长长处处的的吸吸收收度度，求求出出这这些些吸吸收收度度的的比比值值，测测出出它它们们相相对对位位置置的的比比值值即可即可。维维生生素素B12B12的的鉴鉴别别规规定定每每1 1mlml中中含含维维生生素素B B12122525 g g的的水水溶溶液液，照照分分光光光光度度法法测测定定，在在278278、361361与与550550nmnm的波长处有
16、最大吸收。的波长处有最大吸收。 A361nmA361nm/ /A278nmA278nm应为应为1.70-1.881.70-1.88。 A361nmA361nm/ /A A550550nmnm应为应为3.15-3.453.15-3.45。3.纯度检查：纯度检查：l若若一一种种化化合合物物对对紫紫外外光光和和可可见见光光区区的的某某一一波波段段呈呈光光学学透透明明（即即不不吸吸收收或或几几乎乎不不吸吸收收），而而不不纯纯杂杂质质有有吸吸收收时时，则则该该物物质质的的生生产产精精制制应应当当进进行行到到规规定定波波长长处处的的吸吸收收系系数数降降到到最最低低时时为为止止。有有些些药药物物就就以以此此
17、作作为为杂杂质质限限度度检检查查的的依依据据。此此外外，有有些些药药物物的的杂杂质质是是通通过过比比色色法法与与杂杂质质对对照照品品比比较较进进行行控控制制的。的。检检查查肾肾上上腺腺素素中中的的酮酮体体：取取肾肾上上腺腺素素，加加0.10.1mol/Lmol/L盐盐酸酸溶溶液液，制制成成每每1 1mlml中中含含2 2mgmg的的溶溶液液，照照分分光光光光度度法法，在在310310nmnm的的波波长长处处测测定定，吸吸光光度度不得过不得过0.050.05。4.含量测定：含量测定：l药典中含量测定方法可分为：药典中含量测定方法可分为：l（1）对照品比较法）对照品比较法l（2）吸收系数法）吸收系
18、数法l（3）比色法）比色法（1）对照品比较法：）对照品比较法：l应用范围：应用范围： 单一成分药剂的测定。单一成分药剂的测定。 混混合合物物或或复复方方制制剂剂，但但其其它它成成分分在在被被测测组组分分的测定波长没有或几乎没有吸收的测定波长没有或几乎没有吸收 测定要求测定要求分别配制供试品溶液和对照品溶液分别配制供试品溶液和对照品溶液对对照照品品溶溶液液所所含含对对照照品品的的量量应应为为供供试试品品溶溶液液中中被被测组分标示量的测组分标示量的 10%以内。以内。所所用用溶溶剂剂、其其它它试试剂剂、操操作作方方法法和和条条件件都都应应保保持持一致。一致。计算公式：计算公式： Cs=Cr*As/
19、Ar Cs：供试品溶液的浓度供试品溶液的浓度 As：供试品溶液的吸光度供试品溶液的吸光度 Cr：对照品溶液的浓度对照品溶液的浓度 Ar：对照品溶液的吸光度对照品溶液的吸光度（2）吸收系数法：）吸收系数法：l应用范围：应用范围：单一成分药剂的测定。单一成分药剂的测定。混混合合物物或或复复方方制制剂剂，但但其其它它成成分分在在被被测测组组分分的测定波长没有或几乎没有吸收的测定波长没有或几乎没有吸收测定要求：测定要求：通常为测定最大吸收峰波长处的吸光度通常为测定最大吸收峰波长处的吸光度供供试试品品溶溶液液在在测测定定波波长长处处浓浓度度与与吸吸光光度度严严格格遵遵循循比耳比耳-郎伯定律，具有良好的线
20、性关系。郎伯定律，具有良好的线性关系。测定条件和操作应与测定吸收系数时完全一致。测定条件和操作应与测定吸收系数时完全一致。吸吸收收系系数数是是用用标标准准物物质质分分别别在在经经过过校校正正的的不不同同型型号分光光度计上进行多次测定求得的平均值。号分光光度计上进行多次测定求得的平均值。特别注意仪器的校正和检定特别注意仪器的校正和检定计算公式：计算公式： A=ECL以中国药典以中国药典2000年版氯霉素含量测定为例年版氯霉素含量测定为例: 精密称取氯霉素精密称取氯霉素0.1009g，置置100ml量瓶中，量瓶中，加乙醇加乙醇10ml振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀
21、，精密量取精密量取2ml，置置100ml量瓶中，加水稀释至刻量瓶中，加水稀释至刻度，在度，在278nm波长处测定吸光度为波长处测定吸光度为0.596，按氯，按氯霉素霉素(C11H12Cl2N2O5)吸收系数吸收系数(E1%1cm)为为298计计算氯霉素含量。算氯霉素含量。已知已知：A=0.596 E=298 L=1则则： C=A/(E*L)=0.596/(298*1)%=0.002%氯霉素含量氯霉素含量=0.002%*100*100/(0.1009*2)=99.1%（3）比色法）比色法供供试试品品本本身身在在紫紫外外可可见见光光区区没没有有强强吸吸收收，或或在在紫紫外外区区虽虽有有吸吸收收，但
22、但为为了了避避免免干干扰扰或或提提高高灵灵敏敏度度，可可加加入入适适当当的的显显色色剂剂显显色色后后测定测定盐盐酸酸可可乐乐定定片片及及注注射射液液：在在适适宜宜的的pH值值条条件件下下，溴溴酚酚蓝蓝溶溶液液与与盐盐酸酸可可乐乐定定定定量量结结合合成成有有色色络络合合物物，用用氯氯仿仿提提取取后后，直直接接比比色色测测定定，对对照照品品同同法法操操作作，并计算含量。并计算含量。小结：小结：l 紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法具具有有灵灵敏敏度度和和精精密密度度高高，操操作作简简便便、快快捷捷等等优优点点。已已成成为为药药品品检检验验的的一一种种不不可可替替代代手手段段。目目前前各各国国药药典典及及药药物物标标准准中中含含量量测测定定采采用用的的方方法法以以分分光光光光度度法法最最多多。在在医医院院制制剂剂的的质质量量控控制制中中紫紫外外-可可见见分分光光光光度度法法也也得得到到普普遍遍的的应应用。用。
