灌注层析灌注层析王佳慧王佳慧 生物化工生物化工2014.12.092014.12.09灌注层析——高等生物分离技术 一、概念二、灌注层析的提出三、灌注层析的原理四、层析介质的种类五、介质的制备及性能表征六、灌注层析的应用七、灌注层析的问题2灌注层析——高等生物分离技术 一、概念一、概念灌注层析 ( Perfusive chromatography ) 通称流通色谱 ( Flowthrough chromatography )，是指利用含有对流孔的介质为固定相的液相色谱法，其分离模式包括各种吸附色谱，如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱和反相色谱等3灌注层析——高等生物分离技术 二、灌注层析的提出二、灌注层析的提出 传统的吸附色谱介质的孔径较小，介质的孔径越小，比表面积越大，分子尺寸与介质孔径相适应的目标溶质的吸附容量越高 但是，由于介质孔径较小，流体阻力大，在通常的色谱操作压力下，流体不能对流进入固相介质的孔内所以，固相介质内部的传质仅靠溶质的内扩散来完成4灌注层析——高等生物分离技术 液相中溶质的扩散系数很小，尤其是生物大分子，在固相中的阻滞扩散系数更小，固相传质速率很低。
因此，传统吸附色谱的柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量也随流速增大而迅速降低 为获得较大的色谱分辨率和动态容量，传统色谱只能在适当低的流速下操作即使是使用粒径数微米的高效液相色谱，分析柱的流速不超过500cm/h，大规模制备分离受操作压力的限制，流速更低5灌注层析——高等生物分离技术 Ø流通色谱，它含有穿透孔和扩散孔两种孔道，穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质的大比表面积和溶质的吸附容量Ø最大的特点是分离速度快，一般可在数分钟内完成，而利用 HPLC 则需要数十分钟到一个小时，流通色谱法利用流动相和溶质的对流作用，降低了溶质在介质内滞留的限制，明显缩短了蛋白质的分离时间6灌注层析——高等生物分离技术 三、灌注层析的原理三、灌注层析的原理折合板高h是间接评价分离介质性能的参数之一，它受多种因素的影响，通常可表示为；担体即一种多孔性化学惰性固体7灌注层析——高等生物分离技术 8灌注层析——高等生物分离技术 • 9灌注层析——高等生物分离技术 四、层析介质的种类四、层析介质的种类ØPOROS介质（美国Perspective Biosystem 公司开发、取名）•粒径规格为10 μm（H型）和20 μm（M型）两种；•随着连接的官能团不同，又分为反相（R型）、强阴离子交换（Q型）和强阳离子交换（S型）等多种模式的介质类型。
Ø整体柱10灌注层析——高等生物分离技术 1、、POROS介质（双分散孔色谱介质）介质（双分散孔色谱介质）•穿 透 孔 :孔 径 大 （ 600-800nm），对流流过•扩 散 孔 ： 孔 径 小 （ 50-150nm）而短（孔深不超过1um），扩散时间短•分离速度极快，几分钟内完成11灌注层析——高等生物分离技术 2、整体柱（聚合物单块）、整体柱（聚合物单块）Ø用色谱柱为模具，在柱内原位合成的多孔型聚合物单块连续床，经过适当的功能基化可用于色谱分离Ø与传统的固体粒子填充床相比，整体柱具有如下优点：1.其在柱内原位合成制备，避免了颗粒制备和色谱柱的填充等复杂过程；2.整体柱介质在柱内为多孔型连续相，孔径在亚微米级至微米级之间，在中低压力下，液体可高速透过连续床的孔隙，两相间发生对流传质故可基本消除颗粒内传质阻力，相间传质速度快，柱效高；3.整体柱介质为连续相，内部孔隙率大，大大提高了色谱柱的有效利用空间（即色谱柱的吸附容量），有利于提高色谱分离能力12灌注层析——高等生物分离技术 五、介质的制备五、介质的制备ØPOROS流通色谱介质的制备：先由苯乙烯（ST）和二乙烯基苯（DVB）通过悬浮聚合、乳液聚合合成微球，然后将其进一步聚集形成聚集体，最后经过聚集体的再聚集合成所需粒径的分离介质。
Ø由于介质的骨架结构为疏水性很强的苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，对蛋白质等生物物质的非特异性吸附极强13灌注层析——高等生物分离技术 14灌注层析——高等生物分离技术 图 2 双乳介质的合成工艺流程图15灌注层析——高等生物分离技术 从上图可以看出，制得的双孔介质的平均粒径是 42.8 µm，体积平均粒径为45.0 µm，主要分布在 30～60 µm 之间图 3 BiPB（双孔介质）的粒径分布图两种介质的性能表征16灌注层析——高等生物分离技术 从上图可以看出，MiPB的平均粒径为42.3 µm，体积平均粒径为44.9 µm，与BiPB的平均粒径与体积平均粒径都很相近，说明其粒度分布状态类似图 4 MiPB(常规微孔球) 的粒径分布图17灌注层析——高等生物分离技术 图 5 :双孔介质的扫描电镜图（ a:1800× b:10000×）从图可以看出在低倍的SEM图上小球的表面呈海绵状，与Perspective Biosystem 公司POROS介质外形相近，说明超孔致孔剂在上面留下的超孔，在高倍的SEM上可以看到超孔与微孔交错存在的现象利用 SEM （扫描电镜）观察双孔介质的微观结构，并拍摄照片，结果如图18灌注层析——高等生物分离技术 利用 SEM 观察微孔球可以得到如图 图 6 微孔介质的扫描电镜图(a: 2,500×; b: 10,000×)从上图可以看出微孔球上的微孔的数量很多，从而增加了微孔球的比表面积。
19灌注层析——高等生物分离技术 对双孔介质与微孔介质利用汞压计进行测定，得到如图7 所示的孔径分布图图 7 两种介质的孔径分布图20灌注层析——高等生物分离技术 图 8 两类介质的孔体积分布图21灌注层析——高等生物分离技术 从图7和8可以看出双孔介质的孔径公布主要是两个范围，一个是 20～100 nm，另一个是 300～4000 nm，而微孔介质的孔径范围是 20～100nm说明了甘油溶液微滴在介质聚合过程中起到了形成超孔的作用22灌注层析——高等生物分离技术 微孔介质含有大量的孔道，所以能够得到大的吸附容量；而双孔介质中即含有超孔，又含有微孔，所以也具有相对大的吸附容量图 9 两类介质的对 BSA 的静态吸附图23灌注层析——高等生物分离技术 图 10 流速对背压的影响注：背压即后端的压力通常是指运动流体在密闭容器中沿其路径流动时，由于受到障碍物或急转弯道的阻碍而被施加的与运动方向相反的压力24灌注层析——高等生物分离技术 从图10可以看出，微孔介质填充柱的背压随流速增加很快，而且不符合线性关系，说明其粒子内部传质靠扩散作用，传质阻力大双孔介质的填充柱背压比较低，这是由于色谱介质中含有流动相可以对流流过的孔径为1 µm 的超孔，从而提高了流动相在色谱介质内部的传质速率。
同时可以发现，在 0～3600 cm/h 的流速范围内，呈线性关系，证明在设定的操作范围内，色谱介质没有发生压缩形变这也表明双孔介质具有较好的机械强度，为在高流速下快速分离蛋白质提供了条件25灌注层析——高等生物分离技术 以灌注POROS为介质的反相色谱填料类似于硅胶基质的反相填料，其特点是可以在碱性条件下分离血管扩张素异构体ⅰ、ii、iii在通常的酸性条件下（0.1% TFA）无法被完全分离；而在碱性条件下（10 m mol/L Na3PO4）,在POROS R/H 柱上2 min内即得到很好的分离另外，用POROS R/M 填料能在较短时间内完成含有核糖核酸酶、卵清蛋白等蛋白质标准品混合物的分离六、灌注层析的应用六、灌注层析的应用R型：反相 M型:粒径为20um26灌注层析——高等生物分离技术 Q型：强阴离子交换 H型：粒径为10umR型：强阳离子交换 在快速条件下（5 mL/min）,在50 mm × 4.6 mm i.d. 的POROS Q/H 的灌注离子交换色谱柱上，5 min即可完全分离牛血清白蛋白（BSA）和铁传递蛋白,而且在强阳离子交换色谱柱上每5 min循环1次，在1 mL柱体积上可在1天内得到5 g血清蛋白质。
用阳离子交换柱POROS S(100 mm × 4.6 mm i.d.)，在5 mL/min的流速下，经梯度冲洗，5 min内能分离200 μg脉管活化肠多肽（VIP）27灌注层析——高等生物分离技术 • 28灌注层析——高等生物分离技术 • 29灌注层析——高等生物分离技术 用POROS Protein A（醛结合的填料）微型色谱柱（30 mm × 2.1 mm i.d.）纯化杂交细胞培养的上清液中的免疫球蛋白（IgG），IgG在 10 m mol/L 磷酸盐+ 0.15 mol/L NaCl缓冲液中,用0.3 mol/L 乙酸+ 0.3 mol/L MgCl2来洗脱，流速为2 mL/min，进样量为500μL动态柱容量约为每毫升柱体积含12 mg IgG，这种微型柱在快速分离时的线性范围是1-50 μg，大体积的柱型，可以获得高产量的蛋白质制备量30灌注层析——高等生物分离技术 七、灌注层析的问题七、灌注层析的问题Ø商品化的 POROS 等流通色谱介质, 存在着成本高、制备工艺复杂、价格昂贵等问题Ø新型双孔球形介质因制备方法简单快捷、耗时短、价格低廉而引起人们的广泛关注，但是其研制开发技术还不成熟。
31灌注层析——高等生物分离技术 谢谢 谢！谢！灌注层析——高等生物分离技术 。