医学分子生物学上课用11.DNA损伤修复和基因突变

第第11章章DNA损伤修复和基因突变损伤修复和基因突变只有保持低水平的突变率，才能保证遗传物质在世代间的稳定传递在生殖细胞中发生高突变几率，则会毁灭这个物种；在体细胞中发生高突变几率，则会毁灭这一个体如果遗传物质在世代间能够绝对忠实地遗传，将失去推动生物进化的遗传变异因此，生命及其生物多样性的存在有赖于突变与修复之间保持一个恰当的平衡在这章，我们主要学习引发突变的原因，以及回复或纠正系统，从而确保遗传物质受到最低程度的损伤一、基因突变名词解释：•诱变剂：能诱发产生突变的物理和化学因素；•突变：遗传物质中不是由于遗传重组产生的任何的可遗传的改变，这种改变能产生一个突变表型；•突变体：指携带突变的生物个体或群体；•野生型：指没有发生突变的基因；•突变型：指相对的某一性状的野生型基因发生突变后，所表现出来的性状发生改变的表现型；基因突变是DNA分子的碱基对序列发生改变的过程，这种改变可以是较为简单的单个碱基对的置换、插入、缺失；也可以是较为复杂的某条染色体片断的重排、重复、缺失突变可以自发发生，包括由自然界的射线或复制时的错误引发；突变也可以利用诱变剂在实验条件下诱发一).￿可遗传突变的分类染色体突变l染色体结构的变化：缺失、重复、倒位、易位l染色体数目的变化：整倍体、非整倍体1.￿根据碱基改变的数目分类染色体突变DNA点突变——碱基的替换转换：4种è嘌呤￿to￿嘌呤￿è嘧啶￿to￿嘧啶颠换：8种è嘌呤￿to￿嘧啶è嘧啶￿to￿嘌呤￿AGTCAGTC2.￿根据编码的氨基酸的顺序的改变分类：同义突变：错义突变：无义突变：移码突变：F点突变的表型效应Ø同义突变(Synonymous￿mutation):基因突变导致mRNA密码子第三位碱基改变，但基因产物的序列不发生改变；DNA 5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAAAAATGC--- 5’TTT5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAGAAATGC--- 5’TTC5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AA AmRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AA G LysPhe ThrSer Gln AAA  AAG（（Lys））5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAATGC--- 5’AATTGCF点突变的表型效应Ø错义突变(Missense￿mutation):基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，导致基因编码的氨基酸被替换，或功能性的RNA序列发生改变。

DNA 5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAATGC--- 5’AATTAT5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AAAmRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AAG GluPhe ThrSer Gln AAA（（Lys））  GAA（（Glu））5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAATGC--- 5’AATTTAF点突变的表型效应Ø无义突变(Nonsense￿mutation):基因突变导致mRNA密码子碱基被置换成终止密码子，引起多肽链合成的终止DNA 5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG--- 3’AAATGC--- 5’AATTAT5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AAAmRNA LysPhe ThrSer Glnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG--- 3’AAUStopSer Gln AAA（（Lys））  UAA（（Stop））突变改变了mRNA上的密码子读码框￿￿≠￿3x￿dNt￿￿￿￿移码突变￿GCUGCUGCUGCUGCUCUGCUGCUGAlaAlaLeu LeuLeu AlaAlaAlaDeletion = 3x dNt ±n x 氨基酸氨基酸GCUUGCUGCAUGCAU GCUGCUGCAAlaAlaCysCys MetAlaAla HisØ移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸顺序全部发生改变。

F点突变的表型效应正向突变：其突变方向是从野生型向突变型；回复突变：其突变方向是从突变型向野生型；3.根据突变表型和野生型比较，将点突变分为：突变热点：DNA分子上每一个部分发生突变的频率并不相同，在某些位点发生突变的频率远远高于平均数，这些位点称为突变热点自发突变是在不添加任何诱变试剂的情况下发生的，是由复制错误（或在DNA复制过程中其他事件）或环境损伤引发的￿1.￿自发突变vDNA复制的错误vDNA自发的化学改变v转座子的移动(三).基因突变的分子机制u复制中的损伤：指复制中碱基配对时发生误差经过DNA￿pol校正和SSB等综合因素作用下仍存在的DNA损伤u增变基因（mutator）：￿是与DNA复制、DNA损伤修复以及错配校正相关的基因当这些与保证DNA稳定遗传的相关基因突变后，必然会增加其他基因的突变频率￿(1).DNA￿复制中的损伤增变基因类别：DNA￿聚合酶相关基因3’￿￿￿￿5’￿编码功能的基因错配修复系统的基因MCE (mismatch correction enzyme)DNA￿损伤修复系统基因错配修复功能丧失￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿突变率升高 修修复复过过程程是是基基因因突突变变的的重重要要来来源源￿(2).碱基自发的化学改变u￿化学结构的变化è互变异构移位è脱嘌呤或脱氨基作用u氧化作用损伤碱基过氧化氢、羟基(-OH)￿①￿互变异构移位•嘌呤和嘧啶环中芳香族化合物的结构和它的–OH￿和–NH2￿电荷丰富特性可导致异构体的产生，导致H＋的位置移动。

•自发点突变多半是由于嘌呤或嘧啶碱中氢原子的互变异构移位引起的在DNA复制中，这种移位会引起碱基配对的改变imino form 亚氨基形式亚氨基形式amino form 氨基形式氨基形式NH2 NHH腺嘌呤NHNHHenol form 烯醇烯醇式式keto form 酮酮式式鸟嘌呤ONHH2NOHNHH2Nenol form 烯醇烯醇式式keto form 酮酮式式胸腺嘧啶ONOCH3HHOHNOCH3H胞嘧啶NH2NOHNHNOHHimino form 亚氨基形式亚氨基形式amino form 氨基形式氨基形式A（（a））= T（（k）；）；G（（k））≡ C（（a））A（（a））= C（（i））；； G（（k））≡ T（（e））A（（i））= C（（a）；）； G（（e））≡ T（（k））模板链中的稀有同分异构体与非互补的碱基配对，在下一轮复制时，碱基对中错配的碱基分开，然后进行正常的碱基互补配对，最终导致置换突变A(a) T(k) A(a, anti) T(k, anti) C(i) C(a, anti) A(a) A(a, anti) 碱基异构式引起DNA的错配突变￿C(i) C(a)G(k, syn) G(k, syn) G(k, anti)G(k)②② 脱嘌呤或脱氨基作用p脱嘌呤：指在完整的双螺旋DNA分子中失去含氮的碱基，经常是失去嘌呤。

这些位点被称为嘌呤位点（AP位点）￿OCH2OHH1'9CH2HOOPOHOONH2 Gp脱氨基作用是从碱基上去除一个氨基基团NH2OHH2ONH2OOHCUH2ONH2NH2OHCH3OOHCH3T5mC突变热点物理诱变剂高能电离辐射——X、γ、β、α非电离辐射——紫外线￿2.诱导突变化学诱变剂抑制碱基合成：5-氨基尿嘧啶碱基类似物：5-BrU、2-AP碱基修饰剂：NA、HA、烷化剂嵌入试剂：吖啶橙AO、EBè 卫星搭载诱变卫星搭载诱变: : 高真空、强辐射、微重力高真空、强辐射、微重力 dNt电荷及结构改变电荷及结构改变 p(1).电离辐射è￿γ射线和x射线的能量较高•直接影响DNA分子，引起碱基结构改变p￿(2).￿紫外线紫外线照射会引起同一条紫外线照射会引起同一条DNADNA链上相邻的嘧啶碱基发链上相邻的嘧啶碱基发生共价交联而形成嘧啶二聚体生共价交联而形成嘧啶二聚体（（TTTT）CC、CT、TC二聚体同样可以通过紫外线产生，但是数量很少OOCH3HOOCH3HOOCH3HOOCH3HO O12345656p(3).碱基类似物碱基类似物结构与DNA中的正确碱基相似5－溴尿嘧啶是T的类似物，这种碱基替代物的出现可以以烯醇式的形式与G配对。

OOBrHenol form 烯醇烯醇式式keto form 酮酮式式OHOBrHOHN HHG (k)H5-BrU (e)OOBrHHA（（a））NHHHH5-BrU (K)OOBrHH错配u复制的错误:可以导致AT向GC的转换突变A (a)T (k) 5-BrU(k)A (a)5-BrU(k)5-BrU(e)G (k)G (k)C (a)u掺入错误：￿GC向AT的转换突变G (k)C (a)G (k)5-BrU(e)错配5-BrU(e)5-BrU(k)A (a)A (a)T (k) 5BrU5BrU诱发诱发" "复制错误复制错误" "的突变频率低于诱发的突变频率低于诱发" "掺入错误掺入错误" "的突变频率的突变频率. . 2-APHNHHHOOCH3HT (k) •2-氨基嘌呤(2-AP)是另一种腺嘌呤类似物，也有氨式a和亚氨式i两种异构体•正常情况下可发生2-APa=T但在DNA复制的过程中C偶尔会取代T，发生2-APi￿≡￿Cap(4).碱基修饰剂u脱氨基试剂:￿￿HNO2u羟基化试剂:￿￿NH2OHu烷基化试剂:￿EMS、MMSHNO2GN HHOHHOHHHONOHHHxanthine黄嘌呤黄嘌呤NH2OHOOHHNO2CUHHHNHHAp￿Nitrous￿acid￿（HNO2）脱氨基试剂CG TAp Nitrous acid （（HNO2））p￿NH2OH￿(HA￿羟胺，羟基化试剂)OHCNHHNH2OHHHNHHAHOOHHN-OHHNO2AHHCNHHHypoxanthineHHHONHHAT  GCCG  TA•次黄嘌呤次黄嘌呤uEMS(EMS(甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯 ) ) ，，MMS (MMS (甲基磺酸甲基磺酸甲酯甲酯) )等烷化剂都带有等烷化剂都带有1 1个或多个活泼的烷个或多个活泼的烷基，这些烷基能够加入碱基的许多位置基，这些烷基能够加入碱基的许多位置形成烷基化碱基，改变氢键的结合能力。

形成烷基化碱基，改变氢键的结合能力p￿Alkylation￿agents￿烷基化试剂EMS (Ethyl methane sulfanate)乙基甲烷磺酸乙基甲烷磺酸 OH3C SOOCH2CH3MMS(methyl methane sulfanate)甲基甲烷磺酸甲基甲烷磺酸 OH3C SOOCH3SM (Sulfur Mustards gas）） 硫芥子气硫芥子气H SCH2CH2ClCH2CH2ClNitrogen Mustards gas 氮芥子气氮芥子气H3C NCH2CH2ClCH2CH2Cl嵌入剂是含有几个多元环的扁平分子易于在DNA复制过程中插入到dNMP分子之间能与DNA中同样是扁平分子的嘌呤或嘧啶碱基结合，就如在双螺旋中的碱基相互结合或堆积那样EB￿(Ethidium￿Bromide，溴化乙锭)p￿(5).嵌入剂AO￿(Acridine￿Orange，吖啶橙￿)￿Proflavin￿￿￿原黄素＋＋NH2H2NC2H5Ethidium Bromide＋＋H2NNH2H原黄素＋＋(CH3)2NN(CH3)2HAcridine OrangeAO (Acridine Orange) AO (Acridine Orange) 扁平分子扁平分子EB (Ethidium Bromide)EB (Ethidium Bromide)-ATTTTTCG --TAAAAAGC--A TTTCG --T AAAGC-TAO T-AT EB TTTTCG--TA分子插入分子插入AOE B-ATTTCG --TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAX AAAAGC-X AAAAGC-5 基因突变的一般特征基因突变的一般特征基因突变表现出以下的普遍特征：基因突变表现出以下的普遍特征：|(1) (1) 突变的重演性和可逆性突变的重演性和可逆性|(2) (2) 突变的多方向性与复等位基因突变的多方向性与复等位基因|(3) (3) 突变的有害性和有利性突变的有害性和有利性|(4) (4) 突变的稀有性突变的稀有性 基因的定点诱变￿• oligo-dNt 介导的定介导的定点诱变点诱变 合成与目标基因某区合成与目标基因某区段互补，并含突变位段互补，并含突变位点的点的oligo-dNt •可稳定遗传的定点突变基因二、保证遗传稳定性的机制 ——DNA损伤修复DNA损伤是指DNA结构发生的任何改变。

一).￿避免差错的DNA损伤修复•光复活反应•切除修复•重组修复•校读作用——错配修复•交联的修复(二).倾向错误的DNA损伤修复•应急修复系统(SOS)(一).￿避免差错的DNA损伤修复1.光复活修复——复制前修复、直接修复￿￿￿￿修复发生在320-370nm(蓝光)的可见光中CGCA ATAGT TA TCGCA ATAGT TA TCGCA ATAGT TA T+光复活酶通过生色基团（N，N-二甲基四氢叶酸）吸收光能，将能量传递给FAD，￿FADH2通过电子转移引发二聚体的裂解主要用来修复胸腺嘧啶二聚体 A G C G T A T C G C A TCH3uDNA损伤的直接修复HS Enzyme + A G C G T A T C G C A T+ O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶可防止烷化剂所致的死亡和突变效应￿通过把甲基从O6-甲基鸟嘌呤上直接转移到酶的Cys残基上直接修复DNA损伤反应完成后酶失活EnzymeS CH32.￿切除修复——复制前修复u碱基切除修复（BER）u核苷酸切除修复（NER）￿F切除修复是指在一系列酶的作用下，切除错误的碱基或错误核苷酸，然后以另一条完整的互补链为模板，重新合成切去的部分，使损伤DNA恢复正常结构的过程。

是生物体主要的修复方式碱基切除修复（BER）￿￿---尿嘧啶￿N-糖苷酶修复（1）糖苷酶切断糖苷键，释放出损伤碱基，产生AP位点（2）AP内切酶在AP位点切开磷酸二酯键（3）外切酶进一步切割（4）DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶填充缺口5'3'5'3'U*5'3'AP￿位点5'3'ungase5'3'AP内切核酸酶5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'进一步酶切DNA￿Pol￿Ⅰ和连接酶①￿碱基切除修复（BER）uN-糖苷酶与DNA损伤修复￿￿￿￿N-糖苷酶有很多种，如E.coli的3-甲基腺嘌呤-DNA糖苷酶Ⅱ，对于7-甲基鸟嘌呤、3-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤也有作用￿￿￿￿3-甲基腺嘌呤-DNA糖苷酶Ⅰ，专门作用于3-甲基腺嘌呤UvrBAUvrBAAUvrBAAUvrBA②(in￿E.coli)核苷酸切除修复——uvrA、B、C5’UvrB3’CNickNick5’3’5’3’5’3’UvrAB识别嘧啶二聚体和较大的损伤并与之结合，DNA骨架弯曲￿UvrA离开复合体，￿UvrB和UvrC结合，在损伤的5’侧和3’侧产生切口UvrD(解旋酶)将损伤链释放出来，DNA￿polⅠ填补缺口。

着色性干皮病(XP)•￿切除修复缺陷的遗传病•￿XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，表现为皮肤光敏和早发性肉瘤￿跳过损伤部位新链产生的缺口由母链通过重组方式弥补原损伤部位并没有切除，但在后代逐渐稀释3.￿重组修复——复制后修复RecA蛋白引起的DNA链的交换4.￿校读作用——错配修复系统MRSDNA mismatch+ ----- A------ ------C-----DNA￿pol￿(ξ=￿10-8)经第二次校正ξ=￿10-11Mismatch RepairSystemp￿Dam甲基转移酶，￿由dam基因编码，催化5’-GATC-3’中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶Mbo￿I的切断，同时在DNA复制时也起一定的辅助作用￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿p￿MCE-错配修复酶￿：Mut￿HLS￿扫描新生链中错配碱基识别新生链中非￿m6A￿的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段mutSMCE scanningendonucleasePolymeraseligaseGATC GATCCTAG CTAGTCGATC GATCCTAG CTAGTGATC GATCCTAG CTAGTA mutHmutLMutH内切核酸酶与MutSL结合，切割未甲基化的链，从GATC到错配位点之间的序列被切除。

若错配位于切割点5’侧，未甲基化链由核酸内切酶Ⅰ从断裂点按3’→5’方向对DNA链进行降解直至￿除去错配碱基若错配位于切割点3’侧，未甲基化链由核酸外切酶Ⅶ或RecJ蛋白从断裂点按5’→3’方向对DNA链进行降解直至￿除去错配碱基所有错配都可由这一系统修复，但其中以G-T错配修复更为有效，C-C错配的修复为弱由于要降解和置换1000或更多碱基对，这种修复代价显然是高的，但这也说明修复的重要，细胞为此不惜代价Jeam￿Weigle￿发现：Weigle复活效应或W-效应￿￿￿￿UV￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿感染￿￿￿￿￿细菌(用UV照射过)￿－￿￿存活率高λ噬菌体￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿细菌(UV未照射过)￿－￿￿存活率低这些效应是经紫外线诱导产生的，称为SOS反应SOS反应：当生物处于极度逆境下，DNA分子受到较大范围损伤，细胞会应急产生一系列负责的诱导效应•高频突变被SOS修复•倾向差错修复(Error-prone)5.￿应急修复反应-SOS反应￿DNA￿损伤50 X诱导信号RecA￿降解￿LexA SOSUmuC￿￿突变￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿LexA￿RecA,UmuC…等11个基因Neg. repression---UVDNA损伤信号(S.S.￿DNA￿tail￿or￿￿5Nt￿S.S.DNA)lexArecAumuClexArecAumuC紫外线/丝裂霉素C少量表达高效表达1)￿诱导前2)￿诱导•￿RecA消除LexA的阻遏后，首先转录uvrA、sulA等基因，切除修复加强；SulA则抑制细胞分裂。

•￿LexA的进一步分解，使更多SOS网络中的基因表达RecA蛋白：￿两种功能●￿￿与单链DNA结合活性——与DNA重组有关●￿￿蛋白酶活性：可分解LexA蛋白；只有当少量的RecA与受损的单链结合后，此活性被激活LexA蛋白：￿阻遏蛋白￿￿￿￿能阻遏与SOS反应有关的一系列基因RecA蛋白酶活性很快降低lexA基因高水平表达SOS￿基因关闭3)￿恢复状态诱导信号去除细胞恢复正常状态当DNA复制受阻/￿DNA￿damaged能量大量消耗￿￿￿￿细胞内原少量表达的RecA与S.S,￿DNA结合激活RecA的蛋白酶活性修复损伤修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达￿50￿times￿upSOS￿openSOS反应：•DNA复制时遇到损伤位点并不停下或跳过，而是继续向前复制，但并不保证碱基配对的准确性是一种但求保命的应急行为又称为差错倾向修复•修复过程复杂，涉及lexA、recA、uvr等20多种基因产物2. RecA蛋白起作用的修复机制是（蛋白起作用的修复机制是（ ））A. 非同源性重非同源性重组 B. 同源重同源重组 C. 切除修复切除修复 D. 错配修复配修复3. 与修复与修复过程缺陷有关的疾病是（程缺陷有关的疾病是（ ））A. 着色性干皮病着色性干皮病 B. 黄黄嘌呤尿症呤尿症 C. 卟啉病啉病 D. 痛痛风4. 高能量紫外高能量紫外线最常最常导致的致的DNA损失失类型是（型是（ ））A. DNA交交联 B. DNA单链断裂断裂 C. DNA双双链断裂断裂 D. 嘧啶二聚体形成二聚体形成1. 由于遗传密码具有简并性，所以有些碱基替换并不造成氨由于遗传密码具有简并性，所以有些碱基替换并不造成氨基酸的变化，这样的突变叫做（基酸的变化，这样的突变叫做（ ）） A. 错义突变错义突变 B. 同义突变同义突变 C. 无义突变无义突变 D. 移码突变移码突变5. 造成移码突变的原因是（造成移码突变的原因是（ ）） A. 点突变或替换点突变或替换 B. 缺失或插入缺失或插入 C. 倒位或易位倒位或易位 D. 转换或颠换转换或颠换课课 堂堂 练练 习习CBADB6. 5-溴尿嘧啶是经常使用的诱变剂，它的作用是（溴尿嘧啶是经常使用的诱变剂，它的作用是（ ）） A. 在在DNA复制时，可引入额外的碱基复制时，可引入额外的碱基 B. 取代胸腺嘧啶到新合成的取代胸腺嘧啶到新合成的DNA分子中，在新链分子中，在新链DNA复制时产生错配碱基复制时产生错配碱基 C. 使腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶脱氨使腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶脱氨 D. 掺入掺入RNA导致密码子错位导致密码子错位7.￿紫外线引起的DNA损伤可直接修复，该修复机制称为￿[￿￿￿]A.光复活￿￿￿￿B．切除修复￿￿￿￿C.重组修复￿￿￿￿D．SOS作用￿8. 亚硝酸引起的基因突变的机制是（亚硝酸引起的基因突变的机制是（ ）） A. 还原作用还原作用 B. 氧化作用氧化作用 C. 氧化脱氨基作用氧化脱氨基作用 D. 解链作用解链作用BAC9. 经紫外线照射的经紫外线照射的λ噬菌体感染用低剂量的紫外线照射过的噬菌体感染用低剂量的紫外线照射过的大肠杆菌，存活的噬菌体数大为增加，这是大肠杆菌，存活的噬菌体数大为增加，这是（（ ）） A. SOS反应反应 B. 损伤修复损伤修复 C. Weigle复活效应复活效应 D. 诱变诱变C 。