《兽医流行病学 刘文博 第十三章分子流行病学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兽医流行病学 刘文博 第十三章分子流行病学（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十三章第十三章分子流行病学分子流行病学第一节第一节分子流行病学的发展和定义分子流行病学的发展和定义定义：将分子生物学的理论和技术应用定义：将分子生物学的理论和技术应用于流行病学调查研究，在分子水平上阐于流行病学调查研究，在分子水平上阐明疾病或医学事件在畜群或环境生物群明疾病或医学事件在畜群或环境生物群体中频率分布及其决定因素的学科。体中频率分布及其决定因素的学科。分子流行病学分子流行病学的发展的发展分子流行病学分子流行病学(molecularepidemiology)最早于最早于1973年由年由美国美国Kilboume首先提出首先提出在在80年代形成流行病学的一个分支学科。年代形成流行病学的
2、一个分支学科。1、研究内容更加丰富、研究内容更加丰富传染病：传染源、传播途径、病原体检测鉴定传染病：传染源、传播途径、病原体检测鉴定疾病和健康状态相关生物标志的分布、影响因素、群疾病和健康状态相关生物标志的分布、影响因素、群体易感性、防治效果评价及病原生物的进化与变异规体易感性、防治效果评价及病原生物的进化与变异规律等。律等。2、研究手段越来越多、研究手段越来越多初期：质粒图谱、核酸分子杂交、指纹图谱初期：质粒图谱、核酸分子杂交、指纹图谱目前：核酸和蛋白质测序技术、酶技术、生目前：核酸和蛋白质测序技术、酶技术、生物芯片技术等物芯片技术等3、应用范围不断扩大、应用范围不断扩大预防医学、预防兽医学
3、预防医学、预防兽医学基础医学、生物学和环境科学基础医学、生物学和环境科学分子流行病学分子流行病学产生的基础产生的基础分子生物学理论：分子生物学理论：DNA双螺旋模型、遗双螺旋模型、遗传中心法则、遗传密码、传中心法则、遗传密码、RNA逆转录、逆转录、基因表达调控等。基因表达调控等。遗传的分子基础双螺旋遗传的分子基础双螺旋DNADNA分子模式分子模式BioTech核核苷苷酸酸碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸酯键磷酸酯键表型的分子基础及蛋白质结构表型的分子基础及蛋白质结构MutationCombination分子生物学技术：各种凝胶电泳、核酸体外扩增、分子生物学技术：各种凝胶电泳、核酸体外扩增、DNA测
4、序、蛋白质测序、分子杂交、基因克隆、色谱测序、蛋白质测序、分子杂交、基因克隆、色谱分析等，对核酸、蛋白质等生物大分子的检测鉴定水分析等，对核酸、蛋白质等生物大分子的检测鉴定水平大大提高。平大大提高。分子流行病学与常规流行病学不同点分子流行病学与常规流行病学不同点从从分分子子(基基因因)水水平平上上阐阐明明疾疾病病或或其其它它医医学学事事件件的的频频率率分分布布及及其其决决定定因因素素，常常规规流流行行病学从大体或表型上研究；病学从大体或表型上研究；仅仅研研究究疾疾病病或或医医学学事事件件的的生生物物学学方方面面，因因此较常规流行病学的范围要小一些。此较常规流行病学的范围要小一些。第二节第二节分
5、子流行病学的研究内容分子流行病学的研究内容传染性疾病传染性疾病心血管、肿瘤等慢性疾病心血管、肿瘤等慢性疾病遗传和代谢疾病的研究遗传和代谢疾病的研究（一）传统流行病学研究遇到的难题（一）传统流行病学研究遇到的难题1、病原生物的多样性和变异性、病原生物的多样性和变异性流感病毒、艾滋病病毒、口蹄疫病毒、传流感病毒、艾滋病病毒、口蹄疫病毒、传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒等染性支气管炎病毒、马立克氏病毒等 从从20世纪世纪20年代至年代至50年代，猩红热的病死率年代，猩红热的病死率下降至原来水平的下降至原来水平的3.3%，近年无死亡病例。，近年无死亡病例。2、新传染病不断出现、新传染病不断出现如如SA
6、RS、尼帕病、尼帕病、O157大肠杆菌出血性大肠杆菌出血性肠炎等。肠炎等。过去过去30年来新发现的部分病毒性人兽共患病年来新发现的部分病毒性人兽共患病发现年发现年代代病病毒毒引起的疾病引起的疾病宿主范围及危害宿主范围及危害发现地及流行范围发现地及流行范围1976Hanta肾出血综合症，汉肾出血综合症，汉坦病毒肺综合症坦病毒肺综合症人和啮齿动物（黑线姬人和啮齿动物（黑线姬鼠以及褐家鼠）鼠以及褐家鼠）朝鲜半岛发现，目朝鲜半岛发现，目前在世界广泛流行前在世界广泛流行Ebola埃博拉出血热埃博拉出血热人类及非人灵长类动物人类及非人灵长类动物（黑猩猩等），节肢动（黑猩猩等），节肢动物和果蝠可能是贮存宿物
7、和果蝠可能是贮存宿主主非洲扎伊尔、印度非洲扎伊尔、印度尼西亚和菲律宾尼西亚和菲律宾1981HIV艾滋病艾滋病人人类及非人灵长类类及非人灵长类动物动物美国发现，目前在美国发现，目前在世界广泛流行世界广泛流行1979犬细小病毒犬细小病毒犬细小病毒病犬细小病毒病人、家犬、犬科野人、家犬、犬科野生动物生动物世界广泛流行世界广泛流行1994Hendra马呼吸道症状，人马呼吸道症状，人出现脑炎出现脑炎人、马，果蝠是贮人、马，果蝠是贮存宿主存宿主澳大利亚、巴布亚澳大利亚、巴布亚新几内亚新几内亚1997Menangle猪出现繁殖障碍，猪出现繁殖障碍，人有类似感冒症状人有类似感冒症状猪、人，果蝠可能猪、人，果蝠
8、可能是贮存宿主是贮存宿主澳大利亚澳大利亚发现发现年代年代病病毒毒引起的疾病引起的疾病宿主范围及危害宿主范围及危害发现地及流行范围发现地及流行范围1998Nipah猪猪出出现现呼呼吸吸道道症症状状和和神神经经症症状状，人人出出现脑炎症状现脑炎症状库蚊、禽、畜、人库蚊、禽、畜、人马来西亚马来西亚1999（1937）西尼罗河西尼罗河高高烧烧、倦倦怠怠、有有严严重重的的头头痛痛、眼眼痛痛、全全身身淋淋巴巴腺腺肿肿、脑脑炎炎、脊脊贿灰质炎样综合征贿灰质炎样综合征人，野生动物（？）人，野生动物（？）美国美国（乌干达）（乌干达）2003SARS非典型性肺炎非典型性肺炎冈冈比比亚亚鼠鼠、榛榛睡睡鼠鼠、条条纹纹
9、松松鼠鼠、草草原原犬犬鼠、人鼠、人中国中国猴痘猴痘发发烧烧、咳咳嗽嗽、皮皮疹疹、脓胞和淋巴腺肿脓胞和淋巴腺肿蚊、人蚊、人非洲、美国非洲、美国6个州个州2003（1993，1997）“圣圣路路易易斯斯脑炎脑炎”头头晕晕、发发烧烧、疲疲劳劳、肌肉酸痛、脑炎肌肉酸痛、脑炎美国美国3、耐药性病原体增多、耐药性病原体增多滥用抗生素和磺胺类药物使细菌的耐药性滥用抗生素和磺胺类药物使细菌的耐药性增强。如沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、增强。如沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌、痢疾杆菌等。结核杆菌、痢疾杆菌等。在在1700多种感染性微生物中，近多种感染性微生物中，近50%是动是动物源性的。物源性的。4、慢
10、性病的因果判断困难、慢性病的因果判断困难大多具有多病因、多阶段、多基因、长大多具有多病因、多阶段、多基因、长潜伏期等特征。潜伏期等特征。需要对疾病自然史不同阶段的生物学事需要对疾病自然史不同阶段的生物学事件进行深入研究。件进行深入研究。基因基因环境环境囊性纤维性变囊性纤维性变糖尿病糖尿病爱滋病爱滋病疾病疾病 - - 基因基因 - - 环境环境5、个体的易感性差异、个体的易感性差异暴露因素作用后，在不同时期体内发生的变暴露因素作用后，在不同时期体内发生的变化。化。致癌因子进入机体使正常细胞转化为癌细胞致癌因子进入机体使正常细胞转化为癌细胞经历：启动、促进、转化和发展的过程。需经历：启动、促进、转
11、化和发展的过程。需研究个体在每一个过程中具有什么区别。研究个体在每一个过程中具有什么区别。传染性疾病传染性疾病病原体的分型和分类病原体的分型和分类1、病原体通常以生物学或抗原特性分型或分类，2、以上特征往往是蛋白分子特异性导致，由于每一个个体的个体（种别）特性，它总是喜欢给自己一个特征以和其它个体（种别）相区别，这种特征与一些共同的特征相比，往往占据优势。3、但对于核酸分子，由于它的遗传特性和保守区域的存在在分类上占据一定优势，加上近年来分子生物学的飞速发展，应用越来越广。牛传染性鼻气管炎病毒牛传染性鼻气管炎病毒各临床型分离的毒株具有相同抗原性各临床型分离的毒株具有相同抗原性根据限制性内切酶图
12、谱分析，可分为根据限制性内切酶图谱分析，可分为I、III型，型，型又可分为型又可分为a和和b两个亚型两个亚型I型和型和a亚型亚型鼻气管炎鼻气管炎b亚型亚型外阴外阴阴道炎和龟头包皮炎阴道炎和龟头包皮炎III型型脑炎和流产脑炎和流产传染源和传播途径分析传染源和传播途径分析口蹄疫：欧洲、美国都曾发生病毒从实验口蹄疫：欧洲、美国都曾发生病毒从实验室外逸造成的爆发。室外逸造成的爆发。用于病原体起源和进化研究用于病原体起源和进化研究犬细小病毒（犬细小病毒（CPV）猫细小病毒（猫细小病毒（FPLV）和水貂肠炎病毒）和水貂肠炎病毒（MEV）重组而来）重组而来CPV基因组左端约基因组左端约30与与MEV有较大同
13、源性，有较大同源性，而其余部分与而其余部分与FPLV有较大同源性。有较大同源性。1984年年Holmberg等报道，纽波特沙门氏菌等报道，纽波特沙门氏菌（38Kb质粒耐药）质粒耐药）人群肠炎暴发流行人群肠炎暴发流行牛饲料中添加了四环素，使耐药菌株在牛群中牛饲料中添加了四环素，使耐药菌株在牛群中迅速成为优势菌株。迅速成为优势菌株。用于细菌耐药性研究用于细菌耐药性研究弯曲杆菌弯曲杆菌1997年年10月，美国明尼苏达州卫生部报告月，美国明尼苏达州卫生部报告从商店随机抽检肉鸡，污染率达从商店随机抽检肉鸡，污染率达79%，其中，其中20%为耐药菌；火鸡污染率为为耐药菌；火鸡污染率为58%，其中，其中80
14、%为耐药菌。为耐药菌。耐药菌发展速度因不同细菌而异。耐药菌发展速度因不同细菌而异。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌沙门氏菌沙门氏菌耐药性是否稳定，因不同细菌、抗生素而异。耐药性是否稳定，因不同细菌、抗生素而异。四环素、氯霉素、磺胺类耐药性相对稳定四环素、氯霉素、磺胺类耐药性相对稳定红霉素、庆大霉素相对不稳定红霉素、庆大霉素相对不稳定葡萄球菌、痢疾杆菌产生耐药性后较稳定。葡萄球菌、痢疾杆菌产生耐药性后较稳定。肿瘤和心血管疾病肿瘤和心血管疾病肿瘤肿瘤心血管疾病心血管疾病恶恶性性肿肿瘤瘤和和心心血血管管疾疾病病是是目目前前人人类类死死亡亡的的主主要要原原因，也是动物死亡的重要原因之一。因
15、，也是动物死亡的重要原因之一。据据WHO估估计计，全全世世界界每每年年死死于于肿肿瘤瘤的的有有540万万人人左左右右，而而发发生生恶恶性性肿肿瘤瘤的的新新病病例例每每年年有有740万万人人。中中国国目目前前有有高高血血压压病病人人6000万万，每每年年脑脑卒卒中中新新病例病例130万，现患病例万，现患病例500万。万。目目前前，已已找找到到了了很很多多癌癌基基因因和和高高血血压压相相关关基基因。因。遗传和代谢疾病遗传和代谢疾病各种遗传和代谢疾病都有一定的遗传基础，用各种遗传和代谢疾病都有一定的遗传基础，用分子流行病学方法对有害基因分布及遗传规律、分子流行病学方法对有害基因分布及遗传规律、高危人
16、群进行研究，对有关疾病的病因学和防高危人群进行研究，对有关疾病的病因学和防治研究具有重要意义。治研究具有重要意义。继乳光牙、短指症致病基因发现之后，我国在继乳光牙、短指症致病基因发现之后，我国在人类遗传病基因研究领域取得又一重大进展人类遗传病基因研究领域取得又一重大进展发发现儿童白内障致病基因现儿童白内障致病基因“热休克转录因子热休克转录因子-4”对一种慢性舞蹈病对一种慢性舞蹈病Huntington氏病氏病(HD)的分子的分子流行病学研究就是一例。对不同家族染色体流行病学研究就是一例。对不同家族染色体DNA限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)分析表明，分析表明，HD基因与基因与
17、4号染色体的基因多态片段有关，从号染色体的基因多态片段有关，从而在病因不明的情况下，通过分子流行病学研而在病因不明的情况下，通过分子流行病学研究，确立了疾病相关基因的定位究，确立了疾病相关基因的定位MultiplexPCRanalysisforexondeletionsintheDMDgeneTwolaneswithresultstypicalfordeletions第三节第三节分子流行病学的研究方法分子流行病学的研究方法分分子子流流行行病病学学是是将将分分子子生生物物学学的的理理论论和和方方法法应应用用于于流流行行病病学学调调查查研研究究，其其研研究究方方法法是是分分子子生生物物学学和和流流
18、行行病病学学方方法法的的结结合。合。分子生物学研究方法分子生物学研究方法核酸电泳图谱分析（质粒图谱和核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图电泳图谱）谱）核酸酶切图谱分析核酸酶切图谱分析寡核苷酸指纹图谱分析寡核苷酸指纹图谱分析基因探针和核酸杂交基因探针和核酸杂交聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）核苷酸序列分析核苷酸序列分析多位点酶电泳多位点酶电泳DNA芯片芯片核酸电泳图谱分析（质粒图谱和核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图谱）电泳图谱）核酸酶切图谱分析核酸酶切图谱分析寡核苷酸指纹图谱分析寡核苷酸指纹图谱分析基因探针和核酸杂交基因探针和核酸杂交实例：实例：NDV和和H9亚型亚型AIV的的分
19、子流行病学分子流行病学新城疫部分新城疫部分9090年代以前全球范围内三次大流行，并被认为正在发生年代以前全球范围内三次大流行，并被认为正在发生ND ND 第四次大流行我国第四次大流行我国NDND流行一直严重，以疫苗接种为主的预流行一直严重，以疫苗接种为主的预防工作成为生产常规后没有能很好地控制防工作成为生产常规后没有能很好地控制NDND，并出现新的并出现新的特点特点免疫鸡群中非典型免疫鸡群中非典型NDND九十年代后期，以匈牙利等国科学家组成的研究小组建立了一九十年代后期，以匈牙利等国科学家组成的研究小组建立了一种在基因（种在基因（F）水平上的水平上的NDV毒株分类方法，将毒株分类方法，将ND发
20、现以来发现以来的各国的各国NDV株分为株分为8个基因型，并证明不同基因型分别个基因型，并证明不同基因型分别在不同时期的流行中占主导地位：在不同时期的流行中占主导地位：第一次：基因第一次：基因、型型第二次：出现新的基因第二次：出现新的基因型和型和型型第三次：属于第三次：属于b亚型的鸽源亚型的鸽源NDV是起源是起源当前许多学者认为当前许多学者认为基因基因型型NDV正在引起世界范围内第四次大流正在引起世界范围内第四次大流行行目的目的了解我国鸡群中新城疫流行毒株的同源了解我国鸡群中新城疫流行毒株的同源性与基因型性与基因型常规疫苗对其保护力如何？为探索我国常规疫苗对其保护力如何？为探索我国新城疫的防制策
21、略打基础。新城疫的防制策略打基础。实验路线：实验路线：不同时间和地区病毒不同时间和地区病毒分离（分离（20个）个）常规生物学特性研究常规生物学特性研究选取特定基因的特定片段选取特定基因的特定片段PCR测序测序动物保护实验动物保护实验分子流行病学研究分子流行病学研究制订防制对策制订防制对策执行执行评价和修改评价和修改材料与方法材料与方法病毒来源：病毒来源：23个鸡源个鸡源NDV中，标准毒株中，标准毒株F48E8、Hert33及及LaSota株由本株由本实验室保存，实验室保存，20个分离株均由个分离株均由ND发病鸡群中按常规方法分离并通过与发病鸡群中按常规方法分离并通过与H5、H9亚型亚型AIV的
22、的血凝交叉抑制反应确定不含血凝交叉抑制反应确定不含AIV，分离背景见分离背景见表表1病毒的毒力测定试验病毒的毒力测定试验：按按OIE方法进行方法进行致死鸡胚平均死亡时间致死鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定的测定1 1日龄雏鸡脑内接种致病指数日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定的测定引物设计：引物设计：参照已发表的参照已发表的NDV毒株的毒株的F基因核苷酸序列设计两对引物，基因核苷酸序列设计两对引物，P1和和P2用于扩增用于扩增M基因基因1161nt至至F基因基因889nt间长约间长约970nt的片段，的片段，P3和和P4用于扩增用于扩增F基因基因862nt至至F基因基因1700nt间长约
23、间长约839nt的片段。引物由宝生的片段。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物序列为：物工程（大连）有限公司合成，引物序列为：P15-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3P25-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3P35-CACCGGTACCCCTATTCTGATCG-3P45-TTAAGCTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3分离地点分离地点毒毒株株分离年代分离年代福福建建FJ-1/851985福福建建FJ-2/991999江江苏苏JS-1/971997江江苏苏JS-2/981998江江苏苏JS-3/002000江江苏苏JS-4
24、/012001江江苏苏JS-5/012001江江西西JX-1/941994江江西西JX-2/991999山山东东ShD-1/012001山山东东ShD-2/012001山山东东ShD-3/012001上上海海SH-1/971997上上海海SH-2/981998新新疆疆XJ-1/911991新新疆疆XJ-2/971997新新疆疆XJ-3/971997浙浙江江ZhJ-1/851985浙浙江江ZhJ-2/861986浙浙江江ZhJ-3/971997表表1实验用实验用20个鸡源个鸡源NDV分离株分离株NDVF基因片段的扩增和克隆：基因片段的扩增和克隆：扩增和克隆了扩增和克隆了20个分离株中的个分离株中
25、的18株株病毒纯化病毒纯化基因组基因组RNA的抽提：参照吴艳涛等酚的抽提：参照吴艳涛等酚-SDS法法RT-PCR扩增扩增F基因基因克隆载体克隆载体pGEMR-TEasy和转化感受态大肠杆菌和转化感受态大肠杆菌DH5重组质粒鉴定重组质粒鉴定挑取含阳性克隆的菌液，半固体穿刺培养挑取含阳性克隆的菌液，半固体穿刺培养序列测定：序列测定：阳性克隆交宝生物工程（大连）有限公司测定阳性克隆交宝生物工程（大连）有限公司测定序列分析：序列分析：另从另从Genbank和已发表的文献中获取和已发表的文献中获取37个个NDV参考毒株的参考毒株的相关序列，以相关序列，以DNAStar软件分析和比较软件分析和比较F基因的
26、核苷酸序列及其推导的基因的核苷酸序列及其推导的F蛋白一级蛋白一级aa序列，参照匈牙利等国科学家方法，分析其基因型序列，参照匈牙利等国科学家方法，分析其基因型根据根据F基因基因47nt至至420nt之间的之间的374nt片段序列绘制片段序列绘制NDV遗传进化发生树遗传进化发生树分析分析F基因基因334nt至至1682nt之间的之间的1349nt片段上片段上Hinf I 、BstO I和和Rsa I三种三种RE位点分布位点分布NDV遗传进化发生树的绘制：遗传进化发生树的绘制：55株株NDV分布于树形图上的分布于树形图上的9个主干分个主干分支，其中支，其中8个分支代表了国外已报道的个分支代表了国外已
27、报道的基因型（基因型（见图见图1）毒株毒株FJ-1/85、ZJ-1/85、JS-1/97和和F48E8在在I型和型和III型之间形成了一个新的主型之间形成了一个新的主干分支，彼此之间的同源性干分支，彼此之间的同源性99.5100%,与与I型同源性为型同源性为89.389.9%，与，与III型型同源性为同源性为92.092.5%，差异显著，它们代表了，差异显著，它们代表了NDV的一个新基因型，定名的一个新基因型，定名为为基因基因型。型。其余其余15株位于已知的株位于已知的和和型分支型分支图图1不同不同NDV遗传进化发生树遗传进化发生树基因基因型的分支较多，国外已将其分为型的分支较多，国外已将其分
28、为ae5个亚型。本试验中，有个亚型。本试验中，有7个分个分离毒株归于基因离毒株归于基因型，其中型，其中XJ-1/91、JX-1/94和和XJ-3/97在在型分支中形成型分支中形成一个新的簇，组成了一个新的亚型，定名为基因一个新的簇，组成了一个新的亚型，定名为基因VIf亚亚型型；同样；同样ZJ-2/86、ZJ-3/97、Sh-1/97和和Sh-2/98组成另一新的亚型，定名为基组成另一新的亚型，定名为基因因VIg亚型。亚型。在在与相邻基因亚型的遗传距离上，与相邻基因亚型的遗传距离上，f与与b间为间为9.211.5%，f与与g间为间为6.26.8%，g与与d间为间为2.53.3%。基因基因型毒株中
29、已有型毒株中已有ad4个亚型的报道，本实验中归于个亚型的报道，本实验中归于型的型的8株株NDV间同源性为间同源性为93.199.7%，在遗传进化发生树的，在遗传进化发生树的型主干分支中位于三型主干分支中位于三个不同的亚分支，其中个不同的亚分支，其中JS-4/01、JS-5/01、ShD-1/01、XJ-2/97和和FJ-2/97归归于于d亚型亚型，JS-3/00归于归于c亚型亚型；JS-2/98和和JX-2/99形成了一个新的亚分形成了一个新的亚分支，支，定名为定名为e亚型亚型。从图。从图1可以看出，该亚型毒株位于可以看出，该亚型毒株位于b和和c亚型之间，亚型之间，与前与前者的遗传距离为者的遗
30、传距离为3.05.0%，与后者的遗传距离为，与后者的遗传距离为2.76.2%。限限制制性性内内切切酶酶（RE）位位点点的的分分布布：NDV基基因因型型的的分分类类最最初初是是以以F基基因因3341682nt间间三三种种RE（Hinf I、 BstO I和和 Rsa I）位位点点分分布布的的差差异异为为依依据据的的，有有些些RE位位点点可可作作为为鉴鉴别别基基因因型型的的标标志志。18个个NDV分分离离株株具具有有特特征的征的RE位点分布（见位点分布（见表表3）表表3IIX基因型基因型NDV毒株的毒株的F基因上基因上RE位点分布位点分布736883119813507529531116147816
31、0154068387297315931625基因型和病毒基因型和病毒GenotypeorStrainHinf IBsto IRsa I-+ -+ +-+- +-+- -+- - - -+- +- + +- +- +-+- +- +-+-+ -a-+-+-+-+b-+-+ +-+c-+-+-+ +-+d-+-+-+-+e-+-+-+f(XJ-1/91)-+-+-+-+-+f(JX-1/94)-+-+-+-+-+f(XJ-3/97)-+-+-+-+-+g(ZJ-2/86)-+-+-+-+g(ZJ-3/97)-+-+-+-+-+-+g(SH-1/97)-+-+-+-+-+g(SH-2/98)-+-+
32、-+-+-+-+a-+-+-+-+-+b+-+-+-+-c(JS-3/00)-+-+-+-+-+-d(JS-5/01)-+-+-+-+d(FJ-2/99)-+-+-+-+-d(ShD-/01)-+-+-+-+-+d(XJ-2/97)-+-+-+-+-+-d(JS-4/01)-+-+-+-+-+e(JS-2/98)-+-+-+-+-+e(JX-2/99)-+-+-+-+-+-+-+-+-+(F48E8)-+-+-+-+-(ZJ-1/85)-+-+-+-+-(FJ-1/85)-+-+-+-+-(JS-1/97)-+-+-+-+-动物保护试验动物保护试验常规疫苗对各种不同基因型的分离株均常规疫苗对各
33、种不同基因型的分离株均有保护力有保护力各种不同基因型毒株之间的交叉保护力各种不同基因型毒株之间的交叉保护力为为100%结论结论我国存在不同基因型的我国存在不同基因型的NDV毒株毒株不同基因型之间的主要保护性抗原没有不同基因型之间的主要保护性抗原没有发生改变（在我国的国情下考虑该问题）发生改变（在我国的国情下考虑该问题）H9亚型禽流感部分亚型禽流感部分H9亚型禽流感于亚型禽流感于1970年首次报道。年首次报道。20世纪世纪90年代初，该亚型病毒在野鸟和家禽年代初，该亚型病毒在野鸟和家禽中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。20世纪世纪90年代后期
34、以来，家禽（特别是鸡）年代后期以来，家禽（特别是鸡）的的H9亚型亚型AIV在亚洲和世界其它洲频繁报道。中在亚洲和世界其它洲频繁报道。中国香港于国香港于1999年还报道从有明显类流感症状的病年还报道从有明显类流感症状的病人体内分离到人体内分离到H9亚型病毒。亚型病毒。中国大陆自中国大陆自1994年首次报道鸡群感染年首次报道鸡群感染H9亚型亚型病毒以来，该亚型病毒已在我国大部分省的鸡群病毒以来，该亚型病毒已在我国大部分省的鸡群中引起该病的流行，且在广东省也报道从有明显中引起该病的流行，且在广东省也报道从有明显类流感症状的病人体内分离到类流感症状的病人体内分离到H9亚型病毒亚型病毒几个研究表明，几个
35、研究表明，1999年从香港人体内分离到的年从香港人体内分离到的H9亚型病毒来源于亚型病毒来源于1997年从香港活鸟市场鹌鹑年从香港活鸟市场鹌鹑中分离的中分离的A/Quail/HongKong/G1/97（简称简称G1株）。最近日本、巴基斯坦和沙特阿拉伯等也株）。最近日本、巴基斯坦和沙特阿拉伯等也报道分离到与报道分离到与G1株遗传关系很近的株遗传关系很近的H9N2亚型亚型病毒。病毒。Guo等对亚洲新形成的等对亚洲新形成的H9N2病毒亚系的病毒亚系的研究表明，亚洲研究表明，亚洲H9N2病毒可分为三个不同的病毒可分为三个不同的亚系，其中一个亚系以香港亚系，其中一个亚系以香港G1株为代表，与香株为代表
36、，与香港人体内分离的港人体内分离的H9亚亚型病毒有密切关系，并且型病毒有密切关系，并且对哺乳动物有致病性，氨基酸序列分析还表明对哺乳动物有致病性，氨基酸序列分析还表明这一亚系的毒株这一亚系的毒株HA蛋白具有人受体结合特异蛋白具有人受体结合特异性的氨基酸残基。性的氨基酸残基。李建伟等对山东李建伟等对山东1996年分离的一株年分离的一株H9N2亚亚型毒株的研究认为，该毒株是从北京型毒株的研究认为，该毒株是从北京1994年的年的一个分离株一个分离株A/chicken/Beijing/1/94（H9N2）演演化而来，且与香港人体内分离的化而来，且与香港人体内分离的H9N2毒株的毒株的亲缘关系较远。亲缘
37、关系较远。由此看来，由此看来，H9N2亚型亚型AIV的的感染不仅给养感染不仅给养禽业造成了很大的经济损失，还可能给人类的禽业造成了很大的经济损失，还可能给人类的健康构成新的威胁。健康构成新的威胁。实施严格的生物安全措施和在流行实施严格的生物安全措施和在流行地区使用疫苗是控制该病主要的方法。地区使用疫苗是控制该病主要的方法。因此，弄清我国大陆因此，弄清我国大陆H9N2亚型亚型AIV流行流行株之间的关系以及该亚型病毒在疫苗免株之间的关系以及该亚型病毒在疫苗免疫选择压力下的遗传变异情况对有效控疫选择压力下的遗传变异情况对有效控制和消灭本病的流行具有重要意义。制和消灭本病的流行具有重要意义。研究内容研
38、究内容对从我国对从我国12个省个省1996年年-2001年间分离到的年间分离到的25株株H9N2亚型亚型AIV流行株的流行株的HA基因全序列进行基因全序列进行分析和比较，以阐明这些毒株之间的关系分析和比较，以阐明这些毒株之间的关系本研究的本研究的2525株株H9N2H9N2亚型亚型AIV为我国大陆为我国大陆19961996年年-2001-2001年期年期间的流行株，分别分离自我国：间的流行株，分别分离自我国：研究方法研究方法1.根据已发表的根据已发表的H9亚型亚型AIV的的HA基因序列，借助于基因序列，借助于PrimePrimer5.0软软件设计一对预期扩增件设计一对预期扩增HA基因编码区全序
39、列的特异性引物，引物序列为：基因编码区全序列的特异性引物，引物序列为：P1:5CCCAAGCTTATGGAAACATATTCACTA-3P2:5-CCTGTCGACGTAGAAACAAGGGTGTT-32.通过通过RT-PCR方法扩增出目的片段；方法扩增出目的片段；3.将扩增所得的片段测序，获得了将扩增所得的片段测序，获得了25个个HA基因的编码区全序列；基因的编码区全序列；4.从已发表的资料中搜索得到以下序列：从已发表的资料中搜索得到以下序列：（1）10株病毒株病毒HA基因编码区全序列；基因编码区全序列；（2）32株病毒株病毒HA基因基因55-1152碱基区碱基区1098个核苷酸序列；个核苷
40、酸序列；（3）73株病毒株病毒HA基因基因613-992碱基区碱基区380个核苷酸序列；个核苷酸序列；5.基于本研究测得的基于本研究测得的25个个HA基因序列和搜索得到的以上序列，借助基因序列和搜索得到的以上序列，借助DNAStar软件包中软件包中Megalign软件进行以下几个方面的比较：软件进行以下几个方面的比较：（1）比较）比较35个毒株个毒株HA基因编码区全序列的同源性；基因编码区全序列的同源性；（2）比较）比较57个毒株个毒株HA基因基因HA1上几个重要的氨基酸位点；上几个重要的氨基酸位点；（3）分别以）分别以35个毒株个毒株HA基因编码区全序列、基因编码区全序列、57个毒株个毒株H
41、A基因基因55-1152碱基区碱基区1098个核苷酸序列和个核苷酸序列和98个毒株个毒株HA基因基因613-992碱基区碱基区380个核苷个核苷酸序列建立遗传发生树，进行遗传发生关系研究。酸序列建立遗传发生树，进行遗传发生关系研究。6.通过以上几个方面的比较，分析中国大陆毒株之间的关系以及它们与世通过以上几个方面的比较，分析中国大陆毒株之间的关系以及它们与世界其它国家毒株的关系。界其它国家毒株的关系。结结 果果35株个株个HA基因基因1-1680碱基区（碱基区（1680nt）的遗传发生的遗传发生树树IIIIIIbIIIIIIa1IIIa2IIIa57个个HA基因基因55-1152碱基区（碱基区
42、（1098nt）遗传发生树遗传发生树IIIIIIIIIb2IIIaIIIa1IIIa2IIIbIIIb1IIIb198个个HA基因基因612-993碱基区（碱基区（380nt）遗传发生树遗传发生树IIaIb IIIIIIIIaIIIaIIIbIIIa1IIIa2IIIb1IIIb298个个HA基因基因613-992碱基区（碱基区（380nt）遗传发生树遗传发生树缩略图缩略图IIIIaIbIIIIIIaIIIa1IIIa2IIIbIIIb1IIIb2HK结结 论论通过以上的研究可以得出如下结论：通过以上的研究可以得出如下结论：1.已报道的我国大陆鸡群中已报道的我国大陆鸡群中1994-2001年期间流年期间流行的行的H9N2亚型禽流感病毒为同一来源，已形亚型禽流感病毒为同一来源，已形成了一个稳定的亚系，明显不同于与香港人成了一个稳定的亚系，明显不同于与香港人H9N2病毒感染有关的病毒；病毒感染有关的病毒；2.鸟类的国际贸易在鸟类的国际贸易在H9亚型禽流感的流行病学亚型禽流感的流行病学上具有重要意义。上具有重要意义。
