二章基因工程及其在食品科学中的应用ppt课件

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1、第二章第二章 基因工程及其在食品科学中的运用基因工程及其在食品科学中的运用uu基因工程根底基因工程根底基因工程根底基因工程根底uu基因工程研讨方法基因工程研讨方法基因工程研讨方法基因工程研讨方法uu基因工程在食品科学中的运用基因工程在食品科学中的运用基因工程在食品科学中的运用基因工程在食品科学中的运用第一节第一节 基因工程根底基因工程根底一、基因工程的定义、意义及研讨内容一、基因工程的定义、意义及研讨内容一、基因工程的定义、意义及研讨内容一、基因工程的定义、意义及研讨内容 一基因工程的定义一基因工程的定义一基因工程的定义一基因工程的定义 gene engineering genetic eng

2、ineering gene engineering genetic engineering recombinant DNA technique Molecular cloning recombinant DNA technique Molecular cloning二基因工程的意义二基因工程的意义二基因工程的意义二基因工程的意义 基因工程是现代生物工程的主体中心技术。基因工程的最大特基因工程是现代生物工程的主体中心技术。基因工程的最大特基因工程是现代生物工程的主体中心技术。基因工程的最大特基因工程是现代生物工程的主体中心技术。基因工程的最大特点是可突破生物种属界限，进展生物种点是可突破生物种属

3、界限，进展生物种点是可突破生物种属界限，进展生物种点是可突破生物种属界限，进展生物种( (属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界) )内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症症、骨质疏松症症、骨质疏松症症、骨质疏松症三基因

4、工程的研讨内容三基因工程的研讨内容三基因工程的研讨内容三基因工程的研讨内容 制制备目的基因目的基因构建重构建重组DNA 获得得转化体化体 挑挑选出重出重组转化体阳性克隆化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物目的基因在受体生物细胞中高效表达隆胞中高效表达隆 二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶 基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的关关关关键键键键技技技技术术术术之之之之一一一一就就就就是是是是先先先先将将将将目目目目的的的的基基基基因因因因DNADNA从从从从供供供供体体体体生生生生物物物物体体体体中中中中分分分分别别别别出出出出来来来来，再再再再与与

5、与与适适适适宜宜宜宜载载载载体体体体DNADNA衔衔衔衔接接接接重重重重组组组组等等等等，这这这这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括： 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 DNA DNA甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、甲基化酶、 DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 依赖于依赖于依赖于依赖于DNADNA的的的的RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 衔接酶衔接酶衔接酶衔接酶 激酶激酶激酶激酶 磷酸酶磷酸酶磷酸酶磷酸酶 核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 一限制性

6、内切核酸酶与一限制性内切核酸酶与一限制性内切核酸酶与一限制性内切核酸酶与DNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶1 1、定义、定义、定义、定义 restriction endonuclease restriction endonuclease：指一类可以识别和切割双链：指一类可以识别和切割双链：指一类可以识别和切割双链：指一类可以识别和切割双链DNADNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶分子内核苷酸序列的内切核酸酶分子内核苷酸序列的内切核酸酶分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA methylase DNA methylase ：是指一类可以识别：是指一类可以识别：是指一类可以识别：是指一类可以

7、识别DNADNA特定序列，并特定序列，并特定序列，并特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2 2、限制性酶甲基化酶的命名和分类、限制性酶甲基化酶的命名和分类、限制性酶甲基化酶的命名和分类、限制性酶甲基化酶的命名和分类(1) (1) 限制酶限制酶限制酶限制酶( (甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶) )的命名的命名的命名的命名 其命名主要是参照其命名主要是参照其命名主要是参照其命名主要是参照HHOOSmithSmith和和和

8、和D. NathansD. Nathans提出的待提出的待提出的待提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原那么进展的，命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原那么进展的，命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原那么进展的，命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原那么进展的，详细如下：详细如下：详细如下：详细如下： 以属名的第一个字母以属名的第一个字母( (大写大写) )和种名的最前两个字母和种名的最前两个字母( (小写小写) )组组成的成的三字母符号三字母符号为为其根本方式其根本方式 如：来源于大如：来源于大肠肠杆菌杆菌(Escherichia coli)(Escherichia co

9、li)的的酶酶用用EcoEco表示；来源于流表示；来源于流感嗜血菌感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(Haemophilus influenzae)的用的用HinHin表示表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全一当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全一样时样时，那么，那么来自后一种微生物的来自后一种微生物的酶酶的符号改用其种名的符号改用其种名词头词头前前缀缀后第一个字母后第一个字母( (小写小写) )替代上述三字母符号中的最后一个字母替代上述三字母符号中的最后一个字母 如：来自如：来自Haemophilus parainfluenzae (Haemoph

10、ilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌) )的用的用HpaHpa表表示，而来自同一属的示，而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血副溶血嗜血杆菌杆菌) )的那么用的那么用HphHph表示。表示。 当微生物具有特殊称号当微生物具有特殊称号时时，那么将代表，那么将代表该该特殊称号的符号置于特殊称号的符号置于上述三字母符号之后上述三字母符号之后 如：来自如：来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的的RdRd株的用

11、株的用HindHind表示；来自表示；来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的的RfRf型的用型的用HinfHinf表示。表示。 当不止一种限制当不止一种限制酶酶( (甲基化甲基化酶酶) )分分别纯别纯化自同一微生物株系化自同一微生物株系时时，那么依其被分那么依其被分别别的先后的先后顺顺序以序以罗马罗马数字数字( (大写大写) )置于上述命名符置于上述命名符号之后号之后 如：来自如：来自Haemophilus aegytiusHaemophilus aegytius的三种的三种酶酶分分别别用用Hae IHae I、HaeHae和和HaeHa

12、e表示；来自表示；来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的的RdRd株的三种株的三种酶酶分分别别用用Hind IHind I、HindHind和和HindHind表示。表示。 为为了区了区别别起起见见，在上述命名称号之前加，在上述命名称号之前加R R表示限制表示限制酶类酶类；在；在上述命名称号之前加上述命名称号之前加MM表示甲基化表示甲基化酶类酶类 如：来自如：来自Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae的的RdRd株的第三种限制性内切核株的第三种限制性内切核酸酸酶为酶为R. HindR. H

13、ind，其相，其相应应的的DNADNA甲基化甲基化酶酶那么那么为为M. HindM. Hind。大鼠生长激素基因大鼠生长激素基因转入小鼠转入小鼠(2) 限制限制酶的分的分类 根据根据酶的性的性质，可将限制，可将限制酶分分为三个三个类型型: I型型: 三种不同三种不同亚基基组成；成；辅助因子助因子为ATP、Mg2+及及S-腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸 其切割位点距其其切割位点距其识别位点至少位点至少1000bp；且切割作用是；且切割作用是随机的随机的 型型: 两个一两个一样亚基基组成；成；辅助因子助因子仅为Mg2+；其；其识别位位点常具旋点常具旋转 对称性；其切割位点与其称性；其切割位点与其识别位点

14、重叠或在其附近；位点重叠或在其附近；且切割作且切割作 用特异性用特异性强 型型: 两种不同两种不同亚基基组成；成；辅助因子助因子为ATP和和Mg2+，也受，也受S-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点普通在距其氨酸激活，但并非必需；其切割位点普通在距其识别位点位点3端端 2426bp处 PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 限制性内切酶的旋转对称性限制性内切酶的旋转对称性 需求指出的是，I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的D

15、NA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有一样的识别序列。 (3)型限制性内切核酸酶的根本特性 识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 切割方式 平齐末端 、5磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端 5 33 5 5 33 55突出突出3突出突出 平端平端5 33 5型限制性内切核酸型限制性内切核酸酶切割方式切割方式 同裂同裂酶与同尾与同尾酶isoschizomer ：在：在型限制性内切核酸型限制性内切核酸酶中，来源不同而中，来源不同而识别

16、序列和切割方式均一序列和切割方式均一样者者 如：如：Hpa和和Msp I两者的两者的识别序列都是序列都是CCGG，切割方式，切割方式也一也一样，因此二者，因此二者为同裂同裂酶 isocaudamer ：来源及：来源及识别序列不同，但序列不同，但DNA经其切割后能构其切割后能构成一成一样黏性末端者黏性末端者 如：如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及及Xho切割切割DNA后都构成一后都构成一样的的GATC四核苷酸突出四核苷酸突出单链黏性末端，因此黏性末端，因此其其为一一组同尾同尾酶 需求指出的是，由同尾需求指出的是，由同尾酶切割切割DNA所得到的黏性末端可以所得到的黏

17、性末端可以彼此彼此衔接起来，但是不能重新切开，即原来同尾接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的的识别序列序列都已不再存在。都已不再存在。 限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段长长度与切割度与切割度与切割度与切割频频率率率率 经经限制性内切核酸限制性内切核酸限制性内切核酸限制性内切核酸酶酶切割后切割后切割后切割后产产生的生的生的生的DNADNA片段称片段称片段称片段称为为限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段(restriction fragment)(restriction fragment)。普通不同限制。普通不同限制。普通不同限制。普通不同限制酶酶切割切割切割切割DNADNA后所构

18、成的后所构成的后所构成的后所构成的限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段长长度不一度不一度不一度不一 假假假假设设在某在某在某在某DNADNA分子中，分子中，分子中，分子中，A A或或或或T T出出出出现现的的的的频频率率率率为为X X，G G或或或或C C出出出出现现的的的的频频率率率率为为Y Y，那么某限制，那么某限制，那么某限制，那么某限制酶酶在在在在该该DNADNA分子上的切割位点出分子上的切割位点出分子上的切割位点出分子上的切割位点出现频现频率率率率( (切割切割切割切割频频率或位点率或位点率或位点率或位点频频率率率率) F) F可用下式表示：可用下式表示：可用下式表示：可用下式表

19、示： F=XnYm F=XnYm 式中：式中：式中：式中：nn该该限制限制限制限制酶识别酶识别序列中双序列中双序列中双序列中双链链A=TA=T碱基碱基碱基碱基对对的数目；的数目；的数目；的数目；mm该该限制限制限制限制酶识别酶识别序列中双序列中双序列中双序列中双链链G=CG=C碱基碱基碱基碱基对对的数目的数目的数目的数目 假设构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为知，那么该限制酶在该DNA分子上的实际切割位点数目(N)为： N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1256

20、，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需求指出的是：实践情况与实际不相符 (4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要要素及优化战略 底物DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物DNA的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底物DNA的构造构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状

21、双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。 酶反响缓冲液的组成： 酶反响的最适温度： 为了提高限制了提高限制酶对底物底物DNA低低纯度制度制备物的反响效率，普通物的反响效率，普通采用如下方法：采用如下方法：a 添加限制添加限制酶的用量的用量(平均每平均每g底物底物DNA可用可用10IU甚至更多些甚至更多些)；b 延伸延伸酶催化反响的保温催化反响的保温时间，使，使酶解更完全；解更完全；c 扩展展酶催化反响的体催化反响的体积，使潜在的抑制要素被稀，使潜在的抑制要素被稀释，以减，以减弱其抑制造用；弱其抑制造用；d 在反响液中参与适量在反响液中参与适量亚精胺精胺(普通运用普通运用浓度度为12.5m

22、molL)，以利限制，以利限制酶对基因基因组DNA的的酶解作用。解作用。(5) 限制性内切核酸酶酶解反响的操作步骤及留意要点限制性内切核酸酶酶解反响的操作步骤及留意要点 (二二) DNA聚合酶聚合酶 最常用的依赖于最常用的依赖于DNA的的DNA聚合酶有大肠杆菌聚合酶有大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶I(全酶全酶)、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(Klenow片段片段)、T4噬菌体编码的噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的聚合酶、耐热的DNA聚合酶聚合酶(TaqDNA聚聚合酶合酶)等等 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，即逆转录酶，优先以聚合酶，即逆转录酶，优先以RNA为模板，也可以

23、为模板，也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板为模板催化合成双链催化合成双链DNA 1 1、大、大、大、大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶I( I(全全全全酶酶) ) 来源：大来源：大来源：大来源：大肠肠杆菌；杆菌；杆菌；杆菌； 分子量：分子量：分子量：分子量：109103109103的多的多的多的多肽链肽链 1 1作用作用作用作用 具有具有具有具有53DNA53DNA聚合聚合聚合聚合酶酶活性，以活性，以活性，以活性，以单链单链DNADNA为为模板，以模板，以模板，以模板，以带带3 3自在自在自在自在羟羟基的基的基的基的DNADNA片段片段

24、片段片段为为引物；引物；引物；引物； 53 53外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶酶活性，从活性，从活性，从活性，从5 5端既降解双端既降解双端既降解双端既降解双链链DNADNA，也降解，也降解，也降解，也降解RNA-DNARNA-DNA杂杂交体中的交体中的交体中的交体中的RNARNA链链(RNA(RNA酶酶HH活性活性活性活性) )； 35 35外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶酶活性，底物活性，底物活性，底物活性，底物为带为带3 3自在自在自在自在羟羟基的双基的双基的双基的双链链DNADNA或或或或单链单链DNADNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 以切刻平移法以切刻平移法以切刻

25、平移法以切刻平移法(nick translation)(nick translation)标标志志志志DNADNA。在一切聚合。在一切聚合。在一切聚合。在一切聚合酶酶中，只需中，只需中，只需中，只需该该酶酶能用于此反响，由于只需其具有能用于此反响，由于只需其具有能用于此反响，由于只需其具有能用于此反响，由于只需其具有5353外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶酶活性。活性。活性。活性。 对对DNADNA分子的分子的分子的分子的3 3突出尾突出尾突出尾突出尾进进展末端展末端展末端展末端标标志。志。志。志。DNA 聚合聚合酶2 2、大、大、大、大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶I

26、 I大片段大片段大片段大片段(Klenow(Klenow片段片段片段片段) ) 来源：由大来源：由大来源：由大来源：由大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶I I全全全全酶经酶经枯草杆菌蛋白枯草杆菌蛋白枯草杆菌蛋白枯草杆菌蛋白酶酶酶酶解解解解获获得，也可得，也可得，也可得，也可经过经过克隆技克隆技克隆技克隆技术获术获得。得。得。得。 分子量：分子量：分子量：分子量：7610376103的多的多的多的多肽链肽链1 1作用作用作用作用 53DNA 53DNA聚合聚合聚合聚合酶酶活性，以活性，以活性，以活性，以单链单链DNADNA为为模板，以模板，以模板，以模板，以带带3 3自在自在

27、自在自在羟羟基的基的基的基的DNADNA片片片片段段段段为为引物；引物；引物；引物； 35 35外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶酶活性，底物活性，底物活性，底物活性，底物为带为带3 3自在自在自在自在羟羟基的双基的双基的双基的双链链DNADNA或或或或单链单链DNADNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 补补平限制平限制平限制平限制酶酶切割双切割双切割双切割双链链DNADNA所所所所产产生的生的生的生的3 3凹端；凹端；凹端；凹端； 假假假假设设以以以以标标志的志的志的志的dNTPdNTP补补平双平双平双平双链链DNADNA的的的的3 3凹端，那么可凹端，那么可凹端，那么可凹端，那么

28、可对对DNADNA分子分子分子分子进进展末展末展末展末端端端端标标志；志；志；志； 对对DNADNA分子的分子的分子的分子的3 3突出尾突出尾突出尾突出尾进进展末端展末端展末端展末端标标志；志；志；志； 在在在在cDNAcDNA克隆中，合成克隆中，合成克隆中，合成克隆中，合成cDNAcDNA第二第二第二第二链链； 运用运用运用运用SangerSanger双脱氧双脱氧双脱氧双脱氧链链末端末端末端末端终终止法止法止法止法进进展展展展DNADNA测测序。序。序。序。 Klenow 酶的作用方式酶的作用方式 3 3、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶 来源：来源：来源：来

29、源：T4T4噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：1141031141031 1作用作用作用作用 53DNA 53DNA聚合聚合聚合聚合酶酶活性，以活性，以活性，以活性，以单链单链DNADNA为为模板，以模板，以模板，以模板，以带带3 3自在自在自在自在羟羟基的基的基的基的DNADNA片片片片段段段段为为引物；引物；引物；引物； 35 35外切核酸外切核酸外切核酸外切核酸酶酶活性，底物活性，底物活性，底物活性，底物为带为带3 3自在自在自在自在羟羟基的双基的双基的双基的双链链DNADNA或或或或单链单链DNADNA；2 2

30、主要用途主要用途主要用途主要用途 补补平限制平限制平限制平限制酶酶切割双切割双切割双切割双链链DNADNA产产生的生的生的生的3 3凹端；凹端；凹端；凹端； 假假假假设设以以以以标标志的志的志的志的dNTPdNTP补补平双平双平双平双链链DNADNA的的的的3 3凹端，那么可凹端，那么可凹端，那么可凹端，那么可对对DNADNA分子分子分子分子进进展末展末展末展末端端端端标标志；志；志；志； 对对DNADNA分子的分子的分子的分子的3 3突出尾突出尾突出尾突出尾进进展末端展末端展末端展末端标标志，并且志，并且志，并且志，并且该酶为该酶为利用此法利用此法利用此法利用此法进进展此展此展此展此类类末末

31、末末端端端端标标志的首志的首志的首志的首选酶选酶； 将双将双将双将双链链DNADNA的突出端的突出端的突出端的突出端转转化成平化成平化成平化成平齐齐端。在制端。在制端。在制端。在制备备与合成接与合成接与合成接与合成接头衔头衔接的双接的双接的双接的双链链DNADNA时时，经经常利用常利用常利用常利用这这一特性。一特性。一特性。一特性。4 4、TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶 来源：水生栖来源：水生栖热热菌菌(Thermus aquaticus)(Thermus aquaticus)，现现可由基因工程途径来消可由基因工程途径来消费费 分子量：分子量：6510365103，是一种非常耐，是一种非

32、常耐热热的依的依赖赖于于DNADNA的的DNADNA聚合聚合酶酶。1 1作用作用 具有具有53DNA53DNA聚合聚合酶酶活性，以活性，以单链单链DNADNA为为模板，以模板，以带带3 3自在自在羟羟基的基的DNADNA片段片段为为引物。引物。2 2主要用途主要用途 对对DNADNA进进展展测测序；序； 经过经过聚合聚合酶链酶链式反响式反响(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction，PCR)PCR)对对DNADNA分子的特分子的特定序列定序列进进展体外展体外扩扩增。增。5 5、逆、逆、逆、逆转录酶转录酶( (依依依依赖赖于于于于RN

33、ARNA的的的的DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶) ) 来源：一种来自禽成髓来源：一种来自禽成髓来源：一种来自禽成髓来源：一种来自禽成髓细细胞瘤病毒胞瘤病毒胞瘤病毒胞瘤病毒(AMV)(AMV)，分子量，分子量，分子量，分子量为为170103170103； 一种来自能表达克隆化的一种来自能表达克隆化的一种来自能表达克隆化的一种来自能表达克隆化的MoloneyMoloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠白血病病毒(Mo-MLV)(Mo-MLV)逆逆逆逆 转录酶转录酶基因的大基因的大基因的大基因的大肠肠杆菌，分子量杆菌，分子量杆菌，分子量杆菌，分子量为为8410384103。1 1作用作用作

34、用作用2 2主要用途主要用途主要用途主要用途6 6、末端脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸、末端脱氧核苷酸转转移移移移酶酶( (末端末端末端末端转转移移移移酶酶) ) 来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺 分子量：分子量：分子量：分子量：60103 60103 1 1作用作用作用作用2 2主要用途主要用途主要用途主要用途( (三三三三) ) 依依依依赖赖于于于于DNADNA的的的的RNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶1 1、SP6SP6噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶 来源：来源：来源：来源：SP6SP6噬菌体感染的鼠噬菌体感染的鼠噬菌体感染的鼠

35、噬菌体感染的鼠伤伤寒沙寒沙寒沙寒沙门门氏菌氏菌氏菌氏菌LT2LT2株。株。株。株。1 1作用作用作用作用 该酶该酶主要具有一种活性，即主要具有一种活性，即主要具有一种活性，即主要具有一种活性，即53 RNA53 RNA聚合聚合聚合聚合酶酶活性，活性，活性，活性，识别识别双双双双链链DNADNA模板上相模板上相模板上相模板上相应应的噬菌体特异性启的噬菌体特异性启的噬菌体特异性启的噬菌体特异性启动动子，并且以此双子，并且以此双子，并且以此双子，并且以此双链链DNADNA为为模板合成模板合成模板合成模板合成RNARNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 合成合成合成合成单链单链RNARNA，制

36、，制，制，制备杂备杂交探交探交探交探针针； 合成合成合成合成单链单链RNARNA作作作作为为体外翻体外翻体外翻体外翻译译系系系系统统中的功能性中的功能性中的功能性中的功能性mRNAmRNA或体外剪接或体外剪接或体外剪接或体外剪接反响的底物。反响的底物。反响的底物。反响的底物。2 2、T7T7或或或或T3T3噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体RNARNA聚合聚合聚合聚合酶酶 来源：来源：来源：来源：T7T7或或或或T3T3噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大肠肠杆菌。杆菌。杆菌。杆菌。1 1作用作用作用作用该类酶该类酶主要具有一种活性，即主要具有一种活性，即主要具有一种活性，即主要具有

37、一种活性，即53 RNA53 RNA聚合聚合聚合聚合酶酶活性，活性，活性，活性，识别识别双双双双链链DNADNA模板模板模板模板上相上相上相上相应应的噬菌体特异性的启的噬菌体特异性的启的噬菌体特异性的启的噬菌体特异性的启动动子，并以此双子，并以此双子，并以此双子，并以此双链链DNADNA为为模板合成模板合成模板合成模板合成RNARNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 合成合成合成合成单链单链RNARNA，制，制，制，制备杂备杂交探交探交探交探针针； 合成合成合成合成单链单链RNARNA作作作作为为体外翻体外翻体外翻体外翻译译系系系系统统中的功能性中的功能性中的功能性中的功能性mRNAm

38、RNA或体外剪接反响的底或体外剪接反响的底或体外剪接反响的底或体外剪接反响的底物；物；物；物； 利用利用利用利用带带有有有有T7T7噬菌体启噬菌体启噬菌体启噬菌体启动动子的子的子的子的载载体在大体在大体在大体在大肠肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。杆菌和酵母中表达克隆化基因。杆菌和酵母中表达克隆化基因。杆菌和酵母中表达克隆化基因。( (四四四四) ) 衔衔接接接接酶酶、激、激、激、激酶酶及磷酸及磷酸及磷酸及磷酸酶酶 DNA DNA衔衔接接接接酶酶(DNA ligase)(DNA ligase)：是指将两段：是指将两段：是指将两段：是指将两段DNADNA拼接起来的拼接起来的拼接起来的拼接起来的酶类酶

39、类。在基因工程中，最常在基因工程中，最常在基因工程中，最常在基因工程中，最常见见的的的的DNADNA衔衔接接接接酶为酶为T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA衔衔接接接接酶酶。 RNA RNA衔衔接接接接酶酶(RNAligase)(RNAligase)：能使含：能使含：能使含：能使含5 5磷酸基端及磷酸基端及磷酸基端及磷酸基端及3 3羟羟基端的基端的基端的基端的单链单链RNA(RNA(或或或或DNA)DNA)共价共价共价共价衔衔接起来。接起来。接起来。接起来。该酶该酶主要用于主要用于主要用于主要用于对对RNARNA进进展展展展3 3 末端末端末端末端标标志，即将志，即将志，即将志，即将3

40、2P32P标标志的志的志的志的3 3，55二磷酸二磷酸二磷酸二磷酸单单核苷核苷核苷核苷(pNp)(pNp)加到加到加到加到RNARNA的的的的3 3羟羟基端。基端。基端。基端。1 1、T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA衔衔接接接接酶酶 来源：来源：来源：来源：T4T4噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌 分子量：分子量：分子量：分子量：68103681031 1作用作用作用作用 该酶该酶主要具有一种活性，即催化主要具有一种活性，即催化主要具有一种活性，即催化主要具有一种活性，即催化DNADNA的的的的5 5磷酸基与磷酸基与磷酸基与磷酸基与3 3

41、羟羟基之基之基之基之间间构成磷酸二构成磷酸二构成磷酸二构成磷酸二酯键酯键。该酶该酶的核酸底物的核酸底物的核酸底物的核酸底物为为黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端DNADNA、平、平、平、平齐齐末末末末端端端端DNADNA、带带切刻的切刻的切刻的切刻的DNADNA等。等。等。等。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 衔衔接接接接带带匹配黏性末端的匹配黏性末端的匹配黏性末端的匹配黏性末端的DNADNA分子。分子。分子。分子。 使平使平使平使平齐齐末端的双末端的双末端的双末端的双链链DNADNA分子相互分子相互分子相互分子相互衔衔接或与合成接接或与合成接接或与合成接接或与合成接头头相相相相衔衔接。接

42、。接。接。这这类类反响要比黏性末端反响要比黏性末端反响要比黏性末端反响要比黏性末端衔衔接慢得多。接慢得多。接慢得多。接慢得多。 2 2、T4T4噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激酶酶 来源：来源：来源：来源：T4T4噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大噬菌体感染的大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌1 1作用作用作用作用 具有激具有激具有激具有激酶酶磷酸化活性，催化磷酸化活性，催化磷酸化活性，催化磷酸化活性，催化ATPATP的广磷酸基的广磷酸基的广磷酸基的广磷酸基转转移至移至移至移至DNADNA或或或或RNARNA的的的的5 5末末末末端；端；端；端； 具有具有具有具有3

43、 3磷酸磷酸磷酸磷酸酶酶活性，活性，活性，活性，该酶该酶的核酸底物的核酸底物的核酸底物的核酸底物为为双双双双链链DNADNA、单链单链RNARNA或或或或DNADNA、DNADNA切刻或缺口、寡核苷酸等。切刻或缺口、寡核苷酸等。切刻或缺口、寡核苷酸等。切刻或缺口、寡核苷酸等。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 标标志志志志DNADNA的的的的5 5端，以供端，以供端，以供端，以供Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法法法法测测序、序、序、序、S1S1核酸核酸核酸核酸酶酶分析以及其他分析以及其他分析以及其他分析以及其他必需运用末端必需运用末端必需运用末端必需运用末端标标志志志

44、志DNADNA操作之需；操作之需；操作之需；操作之需； 对预备对预备用于用于用于用于衔衔接但缺乏接但缺乏接但缺乏接但缺乏5 5磷酸的磷酸的磷酸的磷酸的DNADNA或合成接或合成接或合成接或合成接头进头进展磷酸化。展磷酸化。展磷酸化。展磷酸化。 3 3、碱性磷酸、碱性磷酸、碱性磷酸、碱性磷酸酶酶 来源：大来源：大来源：大来源：大肠肠杆菌及牛小杆菌及牛小杆菌及牛小杆菌及牛小肠肠1 1作用作用作用作用 这这两种来源的碱性磷酸两种来源的碱性磷酸两种来源的碱性磷酸两种来源的碱性磷酸酶酶，即，即，即，即细细菌碱性磷酸菌碱性磷酸菌碱性磷酸菌碱性磷酸酶酶(bacteri (bacteri alalkaline

45、 phosphatasealalkaline phosphatase，BAP)BAP)和牛小和牛小和牛小和牛小肠肠碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸酶酶(calf (calf intestinal alkaline phosphataseintestinal alkaline phosphatase，CIP)CIP)均具磷酸均具磷酸均具磷酸均具磷酸酶酶活性，催化去活性，催化去活性，催化去活性，催化去除除除除5 5磷酸的反响。磷酸的反响。磷酸的反响。磷酸的反响。该酶该酶的底物的底物的底物的底物为单链为单链或双或双或双或双链链DNADNA及及及及RNARNA、rNTPrNTP和和和和dNTPdNTP

46、。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 在用在用在用在用32P 32P 标标志志志志5 5末端前，去除末端前，去除末端前，去除末端前，去除DNADNA或或或或RNARNA分子的分子的分子的分子的5 5磷酸；磷酸；磷酸；磷酸； 去除去除去除去除DNADNA片段片段片段片段5 5磷酸，以防本身磷酸，以防本身磷酸，以防本身磷酸，以防本身环环化。化。化。化。五核酸酶五核酸酶五核酸酶五核酸酶 1 1、BAL31BAL31核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：埃氏交替单胞菌来源：埃氏交替单胞菌来源：埃氏交替单胞菌来源：埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)BAL31(Alteromona

47、s espejiana)BAL31。1 1作用作用作用作用2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 2 2、S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶 来源：米曲霉来源：米曲霉来源：米曲霉来源：米曲霉(Aspergillus oryzae) (Aspergillus oryzae) 1 1作用作用作用作用2 2主要用途主要用途主要用途主要用途3 3、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸酶酶A(RNAA(RNA酶酶A)A) 来源：牛胰来源：牛胰来源：牛胰来源：牛胰脏脏1 1作用作用作用作用 该酶该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种

48、活性，即内切核糖核酸酶酶活性，特异地作用于活性，特异地作用于活性，特异地作用于活性，特异地作用于RNARNA分子上分子上分子上分子上嘧啶嘧啶残基残基残基残基(C(C和和和和U)U)的的的的3 3端，切割其与相端，切割其与相端，切割其与相端，切割其与相邻邻核苷酸构成的磷酸二核苷酸构成的磷酸二核苷酸构成的磷酸二核苷酸构成的磷酸二酯键酯键。在低。在低。在低。在低盐浓盐浓度下，其可切割度下，其可切割度下，其可切割度下，其可切割单链单链、双、双、双、双链链RNARNA及及及及DNA-RNADNA-RNA杂杂交体中交体中交体中交体中的的的的RNARNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 从从从从DN

49、A-RNADNA-RNA杂杂交体和交体和交体和交体和RNA-RNARNA-RNA杂杂交体中去除未交体中去除未交体中去除未交体中去除未杂杂交的交的交的交的RNARNA区。区。区。区。 确定确定确定确定DNADNA或或或或RNARNA中中中中单单碱基突碱基突碱基突碱基突变变的位置。的位置。的位置。的位置。RNA-DNARNA-DNA杂杂交体或交体或交体或交体或RNA-RNA-RNARNA杂杂交体中的交体中的交体中的交体中的单单碱基碱基碱基碱基错错配可被配可被配可被配可被该酶识别该酶识别并切割并切割并切割并切割 4 4、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸、核糖核酸酶酶H(RNAH(RNA酶酶H) H) 来

50、源：大来源：大来源：大来源：大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌1 1作用作用作用作用 该酶该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种活性，即内切核糖核酸主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶酶活性，特异地水解活性，特异地水解活性，特异地水解活性，特异地水解DNA-DNA-RNARNA杂杂交体中交体中交体中交体中RNARNA的磷酸二的磷酸二的磷酸二的磷酸二酯键酯键，但不降解，但不降解，但不降解，但不降解单链单链或双或双或双或双链链的的的的DNADNA或或或或RNARNA。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 特异地降解特异地降解特异地降解特异地降解cDNAcDNA第一第一

51、第一第一链链合成合成合成合成时产时产生的生的生的生的RNA-DNARNA-DNA双双双双链链中的中的中的中的mRNAmRNA分分分分子，以利双子，以利双子，以利双子，以利双链链cDNAcDNA的合成；的合成；的合成；的合成； 经过经过合成合成合成合成DNADNA及与及与及与及与RNARNA构成部分的构成部分的构成部分的构成部分的RNA-DNARNA-DNA杂杂交体，交体，交体，交体，诱发该酶诱发该酶催化催化催化催化特异性的特异性的特异性的特异性的RNARNA降解。降解。降解。降解。5 5、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸酶酶I(DNAI(DNA酶酶1) 1) 来源：牛胰来

52、源：牛胰来源：牛胰来源：牛胰脏脏1 1作用作用作用作用 该酶该酶主要具有一种活性，即内切核酸主要具有一种活性，即内切核酸主要具有一种活性，即内切核酸主要具有一种活性，即内切核酸酶酶活性，活性，活性，活性，优优先从先从先从先从嘧啶嘧啶核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸处处水解双水解双水解双水解双链链DNADNA或或或或单链单链DNADNA。在。在。在。在Mg2+Mg2+存在下，存在下，存在下，存在下，该酶该酶可独立作用于双可独立作用于双可独立作用于双可独立作用于双链链DNADNA的每一条的每一条的每一条的每一条链链，且切割位点呈随机分布；在，且切割位点呈随机分布；在，且切割位点呈随机分布；在，且切割位点呈

53、随机分布；在Mn2+Mn2+存在下，存在下，存在下，存在下，该酶该酶可在可在可在可在双双双双链链DNADNA两条两条两条两条链链的大致一的大致一的大致一的大致一样样位置切割，位置切割，位置切割，位置切割，产产生平生平生平生平齐齐末端末端末端末端DNADNA片段或只片段或只片段或只片段或只带带1 12 2个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸单链单链突出的突出的突出的突出的DNADNA片段。片段。片段。片段。2 2主要用途主要用途主要用途主要用途 在以切刻平移法在以切刻平移法在以切刻平移法在以切刻平移法进进展展展展DNADNA标标志志志志时时，可用，可用，可用，可用该酶该酶在双在双在双在双链链DNADNA上上上上产产生随机生随机生随机生随机切刻；切刻；切刻；切刻； 建立随机克隆，以便利用建立随机克隆，以便利用建立随机克隆，以便利用建立随机克隆，以便利用M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体载载体体体体进进展展展展测测序；序；序；序； 分析蛋白分析蛋白分析蛋白分析蛋白质质-DNA-DNA复合物复合物复合物复合物(DNA(DNA酶酶脚印法脚印法脚印法脚印法) )。