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1、 多聚酶链式反应扩增DNA片段衡阳市一中 吴世玉学习目标1尝尝试试PCR（DNA多多聚聚酶酶链链式式反反应应）技术的基本操作。技术的基本操作。2理解理解PCR的原理和反应过程。的原理和反应过程。3讨论讨论PCR的应用。的应用。基础知识（一）（一）DNA分子的结构分子的结构1、DNA分子的基本组成单位分子的基本组成单位？2、脱氧核苷酸的结构模式、脱氧核苷酸的结构模式:脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，简称脱氧核苷酸简称脱氧核苷酸。基础知识（一）（一）DNA分子的结构分子的结构3、多脱氧核苷酸链的结构模式、多脱氧核苷酸链的结构模式:DNA的的羟羟基基(-OH)末末 端端 称称为为3端端，而而磷磷酸酸
2、基基团团的的末末端端称为称为5端端。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析：内容，分析：1、DNA复复制制需需要要哪哪些些基基本本条条件件？它它们们分分别别起起什么作用？什么作用？解旋酶：打开解旋酶：打开DNA双链；双链；DNA母链：提供母链：提供DNA复制的模板；复制的模板；4种脱氧核苷酸：合成子链的原料；种脱氧核苷酸：合成子链的原料；DNA聚合酶：催化合成聚合酶：催化合成DNA子链；子链；引引物物：使使DNA聚聚合合酶酶能能够够从从引引物物的的3端端开开始始连连接脱氧核苷酸。接脱氧核苷酸。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析
3、内容，分析：3、 DNA聚合酶的作用有何特性？聚合酶的作用有何特性？ DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，而而只只能能从从3端延伸端延伸DNA链，因此，链，因此，DNA复制需要引物。复制需要引物。2、什什么么是是引引物物？若若要要克克隆隆DNA，需需要要加加入入几几种特定的引物？种特定的引物？ 【提提示示】引引物物是是指指能能与与DNA母母链链的的一一段段碱碱基基序序列列互互补补配配对对的的一一小小段段DNA或或RNA片片段段。克克隆隆DNA时应加入两种引物。时应加入两种引物。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析：内容，分析：4、 为为什
4、什么么DNA的的合合成成方方向向总总是是从从子子链链的的5端端向向3端延伸？端延伸？ DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，而而只只能能从从3端端延延伸伸DNA链链。当当引引物物与与DNA母母链链通通过过碱碱基基互互补补配配对对结结合合后后，DNA聚聚合合酶酶就就能能从从引引物物的的3端开始延伸端开始延伸DNA链。链。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析：内容，分析：5、 在生物体外如何将在生物体外如何将DNA的双螺旋打开？的双螺旋打开？ DNA的的热热变变性性原原理理：在在80-1000C的的温温度度范范围围内内，DNA的的双双螺螺旋旋结
5、结构构将将解解体体，双双链链分分开开，这这个个过过程程就就称称为为变变性性。当当温温度度缓缓慢慢降降低低后后，两两条条彼彼此此分分离离的的DNA链链又又会会重重新新结结合合成成双双链链，这这称称为复性。为复性。 PCR就就是是利利用用了了DNA的的热热变变性性原原理理，通通过过控控制温度来控制双链的解聚与结合。制温度来控制双链的解聚与结合。基础知识（二）（二）PCR原理原理请阅读请阅读教材教材P58内容，分析：内容，分析：6、 高高温温能能将将将将DNA的的双双螺螺旋旋打打开开，但但同同时时也也可能使可能使DNA聚合酶失活，怎么办？聚合酶失活，怎么办？ 耐耐高高温温的的TaqDNA聚聚合合酶酶
6、的的发发现现和和应应用用解解决决了以上矛盾。了以上矛盾。基础知识（二）（二）PCR原理原理 小小结结：PCR反反应应需需要要在在一一定定的的缓缓冲冲溶溶液液中中才才能能进进行行，并并需需要要提提供供：DNA模模板板，两两种种引引物物，四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸，耐耐热热的的DNA聚聚合合酶酶（如如TaqDNA聚聚合合酶酶），同同时时通通过过控控制制温温度度使使DNA复复制制在在体体外外反反复复进行。进行。基础知识 PCR一一般般要要经经历历30多多次次循循环环，每每次次循循环环可可以以分分为为三三步步：变变性性、复复性性和和延延伸伸。在在循循环环之之前前常常要要进进行行一一次次预预变变性性（
7、目目的的是增加模板是增加模板DNA彻底变性的概率）。彻底变性的概率）。（二）（二）PCR的反应过程的反应过程基础知识（二）（二）PCR的反应过程的反应过程1变变性性：当当温温度度上上升升到到_0C以以上上时时，双链双链DNA解聚为单链。解聚为单链。2复复性性：温温度度下下降降到到_0C左左右右，两两种种引引物物通通过过_与与两两条条单单链链DNA结合。结合。3延延伸伸：温温度度上上升升到到_ 0C左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在_的的作作用用下下，根根据据碱碱基基互互补补配配对对原原则则合合成成新新的的DNA链。链。9050碱基互补配对碱基互补配对72DNA聚合酶聚合
8、酶基础知识 从从第第二二轮轮循循环环开开始始，上上一一次次循循环环的的产产物物也也可可以以作作为为模模板板参参与与反反应应，并并且且由由引引物物延延伸伸而而成成的的DNA单单链链会会与与引引物物结结合合，进进行行DNA的的延延伸伸。DNA聚聚合合酶酶只只能能特特异异性性地地复复制制处处于于两两个个引引物物之之间间的的DNA序序列列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。使这段固定长度的序列呈指数扩增。（二）（二）PCR的反应过程的反应过程383实验操作（一）设备及用具PCR仪、微量离心管、微量移液器等等。仪、微量离心管、微量移液器等等。（二）PCR仪的循环程序预预变变性性的的目目的的: :增增加加模模板板DNADNA彻彻底底变变性性的的概率。概率。操作提示阅读教材阅读教材P62。结果分析与评价DNA在在260nm的的紫紫外外线线波波段段有有一一强强烈烈的的吸吸收收峰峰，可可以以利利用用DNA的的这这一一特特点点进进行行DNA含量的测定。含量的测定。课题延伸快快速速、高高效效、灵灵活活和和易易于于操操作作是是PCR的的突突出出优优点点。可可从从基基本本的的PCR中中衍衍生生出出许多新方法。许多新方法。
