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1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2024/9/82024/9/81 11基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定（前提）（前提）（核心）（核心）（关键）（关键）（保证）（保证）2一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、
2、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段也可以是一些具有调控作用的因子也可以是一些具有调控作用的因子也可以是一些具有调控作用的因子也可以是一些具有调控作用的因子3一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类: :种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分
3、基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库（先建立基因文库，再从中筛选；）（先建立基因文库，再从中筛选；）4提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库3 3、构建基因文库、构建基因文库（1 1）构建基因组文库）构建基因组文库5某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载
4、体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）构建）构建cDNAcDNA文库文库3.3.构建基因文库构建基因文库6基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较注意：注意：u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，中不是直接保管相应基因，而是而是保存受体菌保存受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。74 4、从基因文库直接获取目的基因、从基因文库直接获取目的基因怎样从基因文库中获取目的基因呢？怎样从基因文库中获取目的基因呢？（1 1）获取目的基因的根据：）获取目的基因的根据：如：根据基因的核苷酸序列；如：根据基因的核苷酸
5、序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置； 基因的转录产物基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。8为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。式。如果所需要的目的基因序列已知如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过，就可以通过PCR方式方式从含有该基因的生物的从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录中，直接获得，也可以通过
6、反转录，用，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。中获得，不一定要构建基因文库。但如果但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。到一种生物的全基因
7、组序列，往往就需要构建基因文库。13（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因14（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便合成引物。以便合成引物。原理：利用原理：利用DNA双链复制原理双链复制原理15n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至9095双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至5560部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部
8、位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至7075在在TaqTaq酶作用下，酶作用下，合成互补的新合成互补的新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸注意：双链注意：双链DNA中，中，G和和C比例越高，比例越高，DNA变性温度越高。变性温度越高。16（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因17 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链
9、式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制有一段已知基因的核苷酸序列有一段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物耐热的耐热的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增二、利用二、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因18PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复
10、制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水解引物水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料、能量、酶、引物等模板、原料、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断氢键在高温下断裂，双链全部解裂，双链全部解开开解旋酶催化氢键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等结果结果在短时间内形成在短时间内形成大量的大量
11、的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因技术扩增目的基因2024/9/82024/9/8202020 33.(8 33.(8分分) )请回答基因工程方面的有关问题：请回答基因工程方面的有关问题： （1 1）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNADNA复制复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNADNA片段，它是子片段，它是子链合成延伸的基础。链合成延伸的基础。“汉水丑生的生物同行汉水丑生的
12、生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012 年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。21 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片段片段所占比例为所占比例为 。 在第在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的长的DNADNA片段。片段。15/16 三三 “汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公
13、益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012 年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。2229 （2 2）设计引物是）设计引物是PCRPCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。别说明理由。第一组：第一组：_引物引物I和引物和引物II局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效 引物引物II自身折叠
14、后会出现局部碱基互补配对而失效自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效“汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012 年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。“汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。20
15、12 年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。30目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使使使RNARNARNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的，然后在酶的，然后在酶的，然后
16、在酶的作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链DNADNADNADNA，从而，从而，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的氨基的氨基的氨基的氨基酸序列酸序列酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷的核苷的核苷酸序列酸序列酸序列酸序列结构基因结构基因结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸序列序列序列序列目的目的目的目的基因基因基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）人工化学合成法人工化学合成法 ：（三）、人工合成目的基因（三）、人工合成目的基因（在在DNA合成仪中合成）合成仪中合成）根据已知的氨基酸序列合
17、成根据已知的氨基酸序列合成DNA基因比较小，核苷酸序列已知基因比较小，核苷酸序列已知31二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。322、表达载体的组成、表达载体的组成1.1.启动子启动子2.2.终止子终止子3.3.目的基因目的基因4.4.标记基因等标记基因等37质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获
18、得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种3.3.过程过程: :381、构建重组质粒时，需用、构建重组质粒时，需用 切割切割含目的基因的含目的基因的DNA和载体。目的是和载体。目的是 。切割含目的基因的切割含目的基因的DNA和载体并非只能用同一种限制酶。和载体并非只能用同一种限制酶。2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？、目的基因与载体成功连接的基础是什么？4、目的基因的插入位点不是随机的。、目的基因的插入位点不是随机的。目的基因的插入不能破坏载体
19、上自身需要的基因片段，目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段，以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差异。差异。40三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化（一）转化 （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2+Ca2+处理法
20、处理法目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达42四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功48（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 .首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示
21、出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:49归纳步骤51（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程: 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录
22、出了表明目的基因转录出了mRNA52思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1 1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；基因的启动子才能比
23、较有利于基因的表达；（2 2） 通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；编码序列导入受体生物中无法转录；2024/9/82024/9/8535353（3 3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；一些其他调控元件，如增强子等；（5 5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标
24、识存在部位的基因的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。荧光蛋白基因等。2024/9/82024/9/8545454思考与探究思考与探究2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双子根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理叶植物的机理, ,你能分析出不能导入单子叶植物的你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗原因吗? ?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中, ,理论上讲理论上讲你应该怎样做你应该怎样做? ?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌要选择合适的农杆菌菌株，因为
25、不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的和激活农杆菌的VirVir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNAT-DNA转移转移并插入到染色体并插入到染色体DNADNA上。上。2024/9/82024/9/85555553.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，细
26、胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。白是不可能的。思考与探究：思考与探究：2024/9/82024/9/85656564 4.
27、-.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？2024/9/82024/9/85757（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA）。）。）。）。（2 2）
28、将将将将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进
29、入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养
30、进入了）培养进入了）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取后从中提取后从中提取后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。57归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌
31、转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：58练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）aa59
