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1、实验三实验三 DNA DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1一一 实验目的实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。 自从琼脂糖（自从琼脂糖（agaroseagarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNADNA的凝胶电泳技术，已经的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组发展成为一种分析鉴定重组DNADNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段
2、，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如： DNA DNA分型、分型、DNADNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。2二二 实验原理实验原理 DNA DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在时，整个分子带正电；核酸为两性分子，在时，整个分子带正电； pH8 pH8左右时，整个分子带负电。左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核
3、酸分子之糖在碱性环境下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- -磷酸骨架在结磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链构上的重复性质，相同数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNADNA分子的这种迁移速度，亦即电泳分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸
4、分子本身的大小和构型。的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。共价闭环超螺旋分子。共价闭环超螺旋DNADNA直线直线DNADNA开环的双链环状开环的双链环状DNADNA。 3二二 实验原理实验原理 4凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 0000.7%琼脂糖琼
5、脂糖20 0001 0001.4%琼脂糖琼脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 5 DNA DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DN
6、ADNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间之间6 EB(EB(溴溴化化乙乙锭锭) 能能插插入入DNADNA分分子子碱碱基基对对之之间间，导导致致EBEB与与DNADNA结结合合。DNADNA吸吸收收的的260nm260nm的的紫紫外外光光传传递递给给EBEB，或或者者结结合合的的EBEB本本身身在在300300和和360360吸吸收收的的射射线线，均均可可在在可可见见光光区区以以590590波波长长发发射射出出来来，呈呈橙橙
7、红红色色。电电泳时所需泳时所需DNADNA样品量仅样品量仅1 1g.g. EBEB染染料料优优点点：染染色色操操作作简简便便，快快速速，室室温温下下15-20min15-20min；不不会会使使核核酸酸断断裂裂；灵灵敏敏度度高高，10ng10ng或或更更少的少的DNADNA即可检出；可以加到样品中或胶中。即可检出；可以加到样品中或胶中。 EBEB是是诱诱变变剂剂，使使用用时时一一定定要要戴戴手手套套。 EBEB废废液液要经过处理才能丢弃。要经过处理才能丢弃。 在在紫紫外外线线的的照照射射下下结结合合溴溴化化乙锭的乙锭的DNADNA分子发出荧光分子发出荧光7三三 实验步骤实验步骤 称样称样溶解溶
8、解加热加热制板制板倒胶倒胶取样取样点样点样电泳电泳检测检测8三三 实验步骤实验步骤 制胶制胶 1.0 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 (50ml) 凝胶板的制备凝胶板的制备 小心加入小心加入23lEB，摇匀（，摇匀（污染污染EB吸头，不宜再回收使用吸头，不宜再回收使用） 点样点样 样品样品10l，与，与4l溴酚兰混匀溴酚兰混匀 电泳电泳 60v， 大约大约50-60min 观察和拍照观察和拍照254nm紫外灯下观察紫外灯下观察 9四四 实验结果实验结果 五五 注意事项注意事项 EBEB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!六六 习习 题题 1.1.琼脂糖凝胶电泳的适用范围？琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.2.2.2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？4 4 泳道泳道 maker maker1 1 泳道泳道 质粒质粒DNADNA2 2、3 3、5 5、6 6泳道泳道 酶切产物酶切产物1 2 3 4 5 6质粒质粒酶切酶切片段片段10酶切片段标准标准DNA/ECo130I13929774362233472269018824ul2ul11
