第10章DNA的生物合成ppt

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1、目目 录录目目 录录5-末末端端3-末末端端CGA3 5 磷酸二酯键磷酸二酯键3 5 磷酸二酯键磷酸二酯键目目 录录交交替替的的磷磷酸酸基基团团和和戊戊糖糖构构成了成了DNA的的骨架骨架 (backbone)。DNA链的方向是链的方向是5 5 3 3 核苷酸的排列顺序是核酸的核苷酸的排列顺序是核酸的一级结构一级结构5端端3端端3 5 磷酸二酯键磷酸二酯键目目 录录A G P5 P T PG PC PT P OH 3 n书写方法：书写方法：5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 3 1 5 目目 录录DNA的二级结构是双螺旋结构的二级结构是双螺旋结构目目 录录DN

2、ADNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点: :1.1.DNADNA是是反向反向平行、平行、右手螺旋右手螺旋的的双链双链结构结构 脱氧核糖和磷酸基团组成的脱氧核糖和磷酸基团组成的亲水性骨架亲水性骨架位于双螺位于双螺旋结构的旋结构的外侧外侧，疏水的碱基疏水的碱基位于位于内侧内侧。532.DNA2.DNA双链之间形成了双链之间形成了互补碱基对互补碱基对(A(AT,GT,GC)C)3.3.疏水作用力和氢键共同维系着疏水作用力和氢键共同维系着DNADNA双螺旋结构的稳定。双螺旋结构的稳定。横向：横向：氢键氢键维持稳定维持稳定 纵向：纵向：碱基堆积力碱基堆积力维持稳定维持稳定DNA复制时：复制时：

3、双链双链打开打开，以，以亲代亲代DNA为为模板模板，按，按碱基互补碱基互补原则，合成原则，合成子代子代DNA.目目 录录DNADNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis，Replication 第十四章第十四章目目 录录复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制复制(replication) 是以是以DNA为模板的为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代程中，亲代DNA作为模板，按照碱基配对原作为模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。酸聚合反应。 目目 录

4、录n本章主要内容：本章主要内容：DNADNA复制的基本特征复制的基本特征DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化原核生物原核生物DNADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA生物合成过程生物合成过程逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 目目 录录DNADNA复制的基本特征复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节目目 录录半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontin

5、uous replication) nDNA复制的主要特征复制的主要特征 目目 录录l半保留复制半保留复制(概念概念)l双向复制双向复制 (复制子）复制子）l半不连续复制半不连续复制(前导链链、后随链、岡崎片段）前导链链、后随链、岡崎片段） 知识要点：知识要点：目目 录录子链继承母链遗传信息理论上几种可能子链继承母链遗传信息理论上几种可能的的方式方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目目 录录 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。 含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于培养于普普通通培养液培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通普通培养液培养

6、液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果重重-DNA重氮重氮-DNA杂合杂合-DNA杂合杂合-DNA普通普通-DNA重重-DNA一、一、 DNA以半保留方式进行复制以半保留方式进行复制密度梯度实验密度梯度实验目目 录录 DNADNA复复制制时时，亲亲代代DNADNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代细细胞胞的的DNADNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成成。两两个个子子细细胞胞的的D

7、NADNA都都和和亲亲代代DNADNA碱碱基基序序列列一一致致, ,这这种种复复制制方方式式称称为为半半保保留留复制复制。半保留复制的概念半保留复制的概念: :目目 录录AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA目目 录录按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的

8、碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。 半保留复制的阐明，对了解半保留复制的阐明，对了解DNA的功能和物种的延的功能和物种的延续性有重大的意义。续性有重大的意义。目目 录录复制眼复制眼二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个方向延伸两个复制叉两个复制叉复制起始点复制起始点原原核核生生物物基基因因组组是是环环状状DNA，只只有有一一个个复复制制起起点点（orig

9、in）。复复制制从从起起点点开开始始，向向两两个个方方向向进行解链，进行的是单点起始进行解链，进行的是单点起始双向复制双向复制。目目 录录A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C目目 录录53oriorioriori535533真核生物真核生物每个染色体多个起始点每个染色体多个起始点,是是多多复制子的复制。（复制子的复制。（多点双向复制多点双向复制）(replicon)复制子复制子复制子复制子：是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。是含有一个复

10、制起点的独立完成复制的功能单位。*目目 录录3 5 3 5 3535解链方向解链方向后随链后随链 (岡崎片段岡崎片段)(lagging strand)前导链前导链(5 3)(leading strand)另一股链因为复制的方向与解链方向相另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制不连续复制的链称为的链称为后随链后随链。复制中的。复制中的不连续片段称为不连续片段称为岡崎片段。岡崎片段。前导链前导链连续连续复制而复制而后随后随链链不连续不连续复制，就是复制的复制，就是复制的半半不连续性不连续性。 顺着解链方向生成的子链，复制是连

11、顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为续进行的，这股链称为前导链前导链*35三、三、DNA复制反应呈半不连续特征复制反应呈半不连续特征目目 录录 DNA复制的酶学和复制的酶学和拓扑学变化拓扑学变化The Enzymology of DNA Replication第二节第二节目目 录录参与参与DNA复制的物质复制的物质: : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链dATP, dGTP, dCTP, dTTP(dNTP)依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 简写为简写为 DNA-pol模板模板(template) :底物底物(substrate):引物引物(primer): 其他的酶

12、和蛋白质因子等：其他的酶和蛋白质因子等：聚合酶聚合酶(polymerase):*RNA或或DNA分子，提供分子，提供3 -OH末端末端使使dNTP可以依次聚合。可以依次聚合。(5 3) 长度约为数个或数十个核苷酸不等的长度约为数个或数十个核苷酸不等的*目目 录录(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiRNA引物引物RNA引物引物子代子代DNA复制的化学反应复制的化学反应: : DNA链的方向只能链的方向只能是是5 5 3 3 必须要有引物必须要有引物特点特点:原料原料: dNTP3，5磷酸二酯键磷酸二酯键目目 录录一、一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合聚合酶催化脱氧核苷

13、酸间的聚合全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1 1. . 5 53 3 的聚合活性的聚合活性 2.2. 核酸外切酶活性（核酸外切酶活性（3 5 或或 5 3 ）特征：特征：不能从头合成不能从头合成DNA的一条链的一条链(需要一条引物需要一条引物)n引物：引物： 是互补于模板链的一个寡聚核苷酸片断。是互补于模板链的一个寡聚核苷酸片断。n特点：特点： 1、带有一个、带有一个游离的游离的3-OH末端。末端。 2、模板必须转变成单链。、模板必须转变成单链。*目目 录录5 A G C T T

14、 C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5 外切酶活性外切酶活性:5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目目 录录（一）原核生物的有（一）原核生物的有3 3种种DNA聚合酶聚合酶(1) DNA-pol (2) DNA-pol (3) DNA-pol 目目 录录个核心酶个核心酶1个个 -复合物（复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚种亚基）基）1对对

15、-亚基（可滑动亚基（可滑动的的DNA夹子）夹子）(1) DNA聚合酶聚合酶全酶结全酶结构构:全酶结构包括：全酶结构包括：(真正起催化作用的酶真正起催化作用的酶)目目 录录(2) DNA-pol （109kD）（不是主要复制酶）（不是主要复制酶）目目 录录小片段小片段(33kD)5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段(76kD) 5 核酸外切酶活核酸外切酶活性性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶功能功能：1 1、对复制中的错误进行校读，、对复制中的错误进行校读，DNA-pol（单链多肽（单链多肽109KD）2、对复制和修复中出现的空隙进行填补。、对复制和修

16、复中出现的空隙进行填补。*(工具酶工具酶) DNA聚合酶活性和校对活性聚合酶活性和校对活性3 、除去除去DNA合成所需的合成所需的引物引物。*目目 录录(3) DNA-pol （120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。目目 录录原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶聚合速度聚合速度(核苷数核苷数/酶分子酶分子

17、 . 分钟分钟) 600 30 约约30 000功功 能能 切除引物修复填补空缺切除引物修复填补空缺 修复？修复？ 复复 制制 单体单体 单体单体多亚基复合物多亚基复合物*目目 录录DNA-pol 起始引发，有起始引发，有引物酶引物酶活性。活性。延长子链的延长子链的主要酶主要酶，有，有解螺旋解螺旋酶活性。酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞

18、DNADNA聚合酶有聚合酶有5 5种种*目目 录录二、二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性能实现复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目目 录录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。复制出错时有即时校对功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目目

19、录录（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择利用利用“错配错配”实验发现，实验发现，DNA DNA polpol 对核苷酸的对核苷酸的参入（参入（incorporationincorporation）具有选择功能。）具有选择功能。 DNA DNA polpol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。因此实现其选择功能。 目目 录录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不

20、表现不表现外切外切活性。活性。*（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正错配碱基并加以校正目目 录录DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解解成单链，它才能起模板作用。成单链，它才能起模板作用。 *三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化目目 录录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNADNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态* *目目 录录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)又称解链酶或又称解链酶或rep蛋白蛋白利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能

21、，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条解开成为两条单链。单链。Dna BDna C解链方向解链方向目目 录录引物酶引物酶(primase) 依赖依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNA引物的酶引物的酶催化游离的催化游离的NTPNTP聚合，生成短链聚合，生成短链RNARNA，引物的作用为：提供引物的作用为：提供3 3 OHOH末端末端目目 录录 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB)n在复制中维持模板处于单链状态并保护在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。单链的完

22、整性。目目 录录108局部解链后局部解链后（二）（二）DNADNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNADNA超螺旋状态超螺旋状态n复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：目目 录录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点:既能既能水解水解 、又能、又能连接连接磷酸二酯键磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类:目目 录录切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭闭切口切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛

23、。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。作用机制作用机制: : 拓扑异拓扑异构酶构酶拓扑异拓扑异构酶构酶* *复制中理顺复制中理顺DNA链链目目 录录目目 录录连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相邻的相邻的DNA链链连接成一条完整的链。连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式:四、四、DNA连接酶连接复制中产生连接酶连接复制中产生的单链缺口的单链缺口HO5335DNA连接

24、酶连接酶ATPADP5353目目 录录双双链中的链中的单单链缺口链缺口目目 录录DNA连接酶在复制中起最后连接酶在复制中起最后接合缺口接合缺口的作用。的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起修复、重组及剪接中也起缝合缺口缝合缺口作用。作用。也是基因工程的也是基因工程的重要工具酶之一重要工具酶之一。功能功能: :*目目 录录提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的复制中不连续的两条单链两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链

25、改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较 目目 录录原核生物原核生物DNA复制过程复制过程The Process of DNA Replication第三节第三节目目 录录分为三个阶段分为三个阶段n起始n延伸n终止目目 录录起始是复制中较为复杂的环节，在此过程起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引引发体发体，形成，形成复制叉复制叉并合成并合成RNARNA引物。引物。 需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成解开成

26、单链单链，提供，提供模板模板。2. 形成引发体，合成形成引发体，合成引物引物，提供，提供3 -OH末端末端。一、一、复制的起始复制的起始目目 录录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 （一）（一） DNADNA的解链的解链识别区识别区解链区解链区目目 录录原核生物的复制起始

27、部位及解链原核生物的复制起始部位及解链 目目 录录 Dna ADna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶含有解螺旋酶(Dna B)、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(Dna G)和和DNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。 *Dna B(解螺旋酶解螺旋酶)(Dna G)引发体引发体*（二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成目目 录录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶起始完成：起始完成：1. DNA解开成单链，提供解开成单链，

28、提供模板模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端末端。目目 录录复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链的的3 3 -OH -OH 上上，其其化化学学本本质质是是磷磷酸酸二二酯酯键键的的不不断断生生成。成。 二、二、DNA链的延长链的延长目目 录录 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录前导链的合成前导链的合成目目 录录后随链的合成后随链的合成目目 录录5解链方向解链方向目目 录录 在复制叉同时合成前导链和后随

29、链在复制叉同时合成前导链和后随链目目 录录复复制制过过程程简简图图前导链前导链后随链后随链目目 录录原核生物基因是原核生物基因是环状环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处处汇合汇合。三、复制的终止三、复制的终止oriter E.coli8232 ori terSV40500目目 录录3、3553oriter目目 录录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 后随链上不连续性片段的连接后随链上不连续性片段的连接*目目 录录真核生物真核生物DNA生物生物合成过程合成过程The

30、 Process of DNA Replication第四节第四节目目 录录真核生物复制子真核生物复制子多多、冈崎片段、冈崎片段短短、复制叉、复制叉前进速度前进速度慢慢等；等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚聚合酶合酶 / 转换转换；切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是引物的是核酸酶核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异：*目目 录录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期(S期期)G1G2SM 细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键

31、点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性性有关。有关。 蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而实施调控作用。而实施调控作用。 *目目 录录真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分组方式分组方式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。 一、真核生物复制的起始与原核基本相似一、真核生物复制的起始与原核基本相似*目目 录录n真核生物复制起始点比真核生物复制起始点比E.coliE.coli的的oriori C C短。短。n酵母酵母DNAD

32、NA复制起始点含复制起始点含11bp11bp富含富含ATAT的核心序列：的核心序列：A A（T T）TTTATATTTATA（G G）TTTATTTA（T T），称为自主复），称为自主复制序列（制序列（ARSARS，autonomous replication autonomous replication sequence)sequence)。n把把ARSARS克隆至基因工程载体质粒上，可以启动克隆至基因工程载体质粒上，可以启动其它外源基因的复制。其它外源基因的复制。目目 录录复制起始包括打开复制叉、形成引发复制起始包括打开复制叉、形成引发 体和合成体和合成RNARNA引物引物, ,具体机制不

33、详。具体机制不详。复制的起始需要复制的起始需要DNA-DNA-polpol （引物酶活性）（引物酶活性） 和和polpol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑 酶和复制因子酶和复制因子(replication factor, RF)(replication factor, RF)。目目 录录增增殖殖细细胞胞核核抗抗原原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA ）在在复复制制起起始始和和延延长长中中起起关关键键作作用用。PCNA为为同同源源三三聚聚体体，具具有有与与E.coli DNA 聚聚合合酶酶的的亚亚基基相相同同的的功功能能

34、和和相相似似的的构构象象，即即形形成成闭闭合合环环形形的的可可滑滑动动DNA夹夹子子，在在RFC的的作作用用下下PCNA结结合合于于引引物物模模板板链链；并并且且PCNA使使pol获获得得持持续续合合成成能能力力。PCNA水水平平也也是是检检验验细细胞胞增增殖的重要指标殖的重要指标。* 目目 录录拓扑异构拓扑异构酶酶，去除，去除负超螺旋（使解旋超螺旋（使解旋酶酶容易解旋），去除复制叉前方容易解旋），去除复制叉前方产生的正生的正超螺旋超螺旋Tol和和TolDNA双螺旋解双螺旋解链，参与，参与组装引装引发体体DNA解旋解旋酶酶连接接冈崎片段崎片段DNA连接接酶酶核酸核酸酶酶，切除，切除RNA引物引

35、物RNAse H核酸核酸酶酶，切除，切除RNA引物引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引引发酶酶有有依依赖DNA的的ATPase活性活性，结合于引物合于引物-模板模板链，激活，激活DNA聚合聚合酶酶， 促使促使PCNA结合于引物合于引物-模板模板链RFC激活激活DNA聚合聚合酶酶和和RFC的的ATPase活性活性PCNA单链DNA结合蛋白，激活合蛋白，激活DNA聚合聚合酶酶，使解旋，使解旋酶酶容易容易结合合DNARPA功功 能能蛋白蛋白质真核真核DNA复制主要蛋白质的功能复制主要蛋白质的功能*

36、目目 录录DNA-pol 和和pol 分分别别兼兼有有解解螺螺旋旋酶酶和和引引物物酶酶活活性性。在在复复制制叉叉及及引引物物生生成成后后，DNA-pol 通通过过PCNA的的协协同同作作用用，逐逐步步取取代代pol ，在在RNA引引物物的的3 -OH基基础础上上连连续续合合成成前前导导链链。后后随随链链引引物物也也由由pol 催催化化合合成成。然然后后由由PCNA协协同同，pol 置置换换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 二、真核生物复制的延长发生二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目目 录录前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段

37、合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续持续合成能力。合成能力。DNA聚合酶聚合酶 / 转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC。DNA聚合酶聚合酶 / 转换转换*目目 录录3 5 5 3 前导链前导链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核小体三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即组装成合成后立即组装成核小体核小体目目 录录染色体染色体DNA呈线状呈线状，复制在，复制在末端末端停止。停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA

38、子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙（子链变短）。去除后留下空隙（子链变短）。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题目目 录录53oriorioriori535533(replicon)复制子复制子*3 53 5目目 录录前导链前导链产生产生完整完整的子染色单体。的子染色单体。后随链后随链3 3 端留下端留下缩短的缩短的未复制的未复制的ssDNA区区。目目 录录5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录目目 录录目目 录录 真核生物端粒的形成：真核生物端粒的形成：n端粒端粒（telomere）是是指真核

39、生物染色体指真核生物染色体线性线性DNA分子末分子末端的结构部分，通端的结构部分，通常膨大成粒状。常膨大成粒状。目目 录录功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由由末端末端DNA序列序列和和蛋白质蛋白质构成。构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG5335目目 录录端粒酶端粒酶(telomerase)端端粒粒酶酶是是一一种种RNA-蛋蛋白白质质复复合合体体，它它可可以以其其RNA为为模模板板，通通过过逆逆转转录录过过程程对对末末端端DNA链链

40、进进行行延延长。长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构目目 录录端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白1 (human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的组成端粒酶的组成目目 录录端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目目 录录目目 录录ACCCAACCC35逆转录酶活性逆转录酶活性3OH5TTGGGTTGGG53RNA移动移动ACCCAACC

41、C3553TTGGGTTGGGACCCAACCC35TTGGGTTGGGTTGGG53T GT GG目目 录录母链藉非标准碱基配对回折母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶聚合酶进一步加工进一步加工目目 录录端粒及端粒及端粒酶的意义端粒酶的意义n成年人端粒比胚胎细胞端粒短；成年人端粒比胚胎细胞端粒短；n老化与端粒酶活性下降有关；老化与端粒酶活性下降有关；n肿瘤的发生与端粒酶活性有关；肿瘤的发生与端粒酶活性有关；n端粒酶不一定能决定端粒的长度。端粒酶不一定能决定端粒的长度。目目 录录真核所有染色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只

42、能复制一次。五、真核生物染色体五、真核生物染色体DNA在每个细胞周在每个细胞周期中只能复制一次期中只能复制一次目目 录录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第五节第五节目目 录录本节主要内容：本节主要内容：1.逆转录概念、逆转录概念、 cDNA的概念的概念2.逆转录酶催化的反应逆转录酶催化的反应，（，（3个活性）个活性）3.逆转录研究的意义。逆转录研究的意义。目目 录录逆转录逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以在逆转录酶的催化下，以RNA为模为模

43、板合成板合成DNA的过程，又称反转录。的过程，又称反转录。 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒的基因组是一、逆转录病毒的基因组是RNARNA， 以逆转录机制复制以逆转录机制复制目目 录录逆转录酶逆转录酶 (reverse transcriptase) l从逆转录病毒中发现，能催化以从逆转录病毒中发现，能催化以RNARNA为模板为模板合成双链合成双链DNADNA的酶，全称为的酶，全称为RNARNA依赖的依赖的DNADNA聚聚合酶。合酶。(RDDP)(RDDP)l有三种活性：有三种活性：RNARNA指导的指导的DNADNA聚合活性聚合活性 RNaseRNase H H活性活性 DNADNA指导的指导的

44、DNADNA聚合活性聚合活性目目 录录l含有逆转录酶的含有逆转录酶的RNARNA病毒病毒, ,称作称作逆转录病毒逆转录病毒l一些一些逆转录病毒侵染细胞后虽不引起细逆转录病毒侵染细胞后虽不引起细 胞死亡胞死亡, ,却可以使细胞发生恶性转化却可以使细胞发生恶性转化, , 这这 类病毒被称为类病毒被称为RNA肿瘤病毒肿瘤病毒.目目 录录逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶RNA-DNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNARNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性RNaseH的活性的活性DNA指导的指导的DNA聚

45、合酶活性聚合酶活性整合到宿主细胞整合到宿主细胞DNA目目 录录分子生物学研究可应用分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，程目的基因的重要方法之一，此法称为此法称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆为模板，经逆转录合成的与转录合成的与mRNA碱基序碱基序列互补的列互补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发

46、现发展了中心法则p逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。究中的重大发现。 p逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能样兼有遗传信息传代与表达功能p对逆转录病毒的研究，拓宽病毒致癌理论对逆转录病毒的研究，拓宽病毒致癌理论的研究。的研究。 目目 录录DNA-pol dNTP D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mtDNA)的复制形式。的复制形式。 三、真核生物线粒体三、真核生物线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制目目 录录总结总结53

47、3553355335复复制制复制规律复制规律半保留复制（定义）半保留复制（定义）双向复制（复制子）双向复制（复制子）半不连续复制半不连续复制领头链领头链随从链随从链冈崎片段冈崎片段复制的本质：酶促复制的本质：酶促dNMP的聚合反应的聚合反应复制复制目目 录录复复制制复复制制的的酶酶及及蛋蛋白白因因子子一、原核生物一、原核生物引物酶（引物酶（DnaG)解旋酶解旋酶(DnaB)SSB拓扑异构酶拓扑异构酶DNA连接酶连接酶DNA-polDNA-pol功能：及时校读、功能：及时校读、填补空缺填补空缺DNA-pol功能：延长功能：延长子链子链DnaA;辨认起始点辨认起始点目目 录录复复制制复复制制的的酶

48、酶及及蛋蛋白白因因子子真核生物真核生物DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目目 录录复复制制复制过程复制过程原核生物原核生物起始起始延长延长终止终止真核生物真核生物起始起始延长延长终止终止端粒：定义、端粒：定义、结构、功能结构、功能端粒酶构成端粒酶构成端粒的复制端粒的复制其他复制其他复制1.逆转录：逆转录：目目 录录本章复习题本章复习题名词解释名词解释半保留复制半保留复制 双向复制双向复制 冈崎片段冈崎片段 前导链前导链 后随链后随链 Klenow 片段片段 引发体引发体 端粒端粒 逆转录逆转录简答及论述及填空简答及论述及填空原核生物复制的相关酶和蛋白质都有哪些？各自的功能原核生物复制的相关酶和蛋白质都有哪些？各自的功能端粒的结构特点及功能端粒的结构特点及功能原核生物和真核生物复制延长真正起催化作用的酶是哪一个？原核生物和真核生物复制延长真正起催化作用的酶是哪一个？逆转录酶的活性逆转录酶的活性