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1、细胞培养技术细胞培养技术p细胞培养也叫细胞克隆技术。p通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。最核心、最基础的技术。什么是细胞培养？什么是细胞培养？主要内容主要内容o实验设备实验设备o试剂及耗材试剂及耗材o清洗及灭菌清洗及灭菌o细胞培养细胞培养 （细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）一实验设备一实验设备o超净工作台，生物安全柜oCO2培养箱o倒置显微镜o离心机o电热恒温水槽o液氮罐o纯水仪o压力蒸汽消毒器o电热干燥箱 超净台超净台 生物安全柜生物安全柜 酒精灯（酒精灯（），），
2、离开要熄灭离开要熄灭 ！ 酒精灯（酒精灯（）CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定的条件为37，5CO2。倒置显微镜倒置显微镜离心机离心机电热恒温水槽电热恒温水槽 液氮：-196 液氮罐液氮罐配平纯水仪纯水仪 压力蒸汽灭菌器压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱电热干燥箱由工作人员操作，注意安全！由工作人员操作，注意安全！小结一实验设备及功能小结一实验设备及功能o超净工作台，生物安全柜-操作平台oCO2培养箱-细胞生长的空间o倒置显微镜-观察细胞o离心机-离心收集细胞o电热恒温水槽-加热o液氮罐-冻存细胞o纯水仪-制备一级水o压力蒸汽消毒器-灭菌o电热干燥箱-烘干器皿（酒精灯安全）（酒精灯安全）二试剂及耗材
3、二试剂及耗材o培养基培养基 o缓冲液缓冲液 o消化液消化液o血清血清o其他其他o耗材耗材 培养基培养基 供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。成分及作用：成分及作用：氨基酸：组成蛋白质的基本单位碳水化合物：能量来源无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用培养基分类培养基分类 DMEM（高糖高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元 DMEM（低糖低糖，葡萄糖1000mg/L）：间充质干细胞，单抗细胞融合RPMI 1640：血液细胞（HL60）、一些实体
4、瘤细胞（BT474）酚红：酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。ATCC美国模式培养物集存库缓冲液（洗涤细胞）缓冲液（洗涤细胞） PBS：磷酸缓冲盐溶液具有pH缓冲作用的等渗盐溶液（常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面的研究。Hanks：平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。D-Hanks：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。消化液消化
5、液o胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hanks）。oEDTA溶液溶液一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、镁的平衡盐溶液配制。o胶原酶溶液胶原酶溶液主要水解结缔组织中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较差），使用Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）。 提提供供基基本本营营养养物物质质、激激素素和和各各种种生
6、生长长因因子子、提提供供结结合合蛋蛋白白、提提供供促促接接触触和和伸伸展展因因子子使使细细胞胞贴贴壁壁免免受受机机械械损损伤伤、对对培培养养中中的的细细胞胞的的起起到到某某些些保保护作用。护作用。o保存血清最好的方法？保存血清最好的方法？建议血清保存在-20。解冻后存放于4时，请勿超过一个月。（分装）o如何解冻血清才不会使产品质量受损如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议从冷冻箱取出后，置于28冰箱使之缓缓慢慢解解冻冻、融融解解。使用时，必须将解冻的血清充充分分混匀混匀，并且勿将血清置于37太久。 血清血清青霉素青霉素- -链霉素溶液链霉素溶液 青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓
7、度为0.1mg/ml。分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无效。其他实验所需的试剂其他实验所需的试剂：药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子（如SCF）等试剂标注规范试剂标注规范o试剂名称 NaClo配制浓度 0.5 mMo配制人 张三o配制日期 耗材耗材o培养皿、瓶、孔板o离心管、移液管o枪尖o其他小结二试剂及耗材的分类及用途小结二试剂及耗材的分类及用途o培养基（成分、分类） o缓冲液 （PBS、Hanks等）o消化液（分类及应用）o血清（作用、存储及解冻方法）o试剂标签要规范o耗材（分类、用途） o在组织细胞培养中，体外细胞
8、对任何有害物质都非常敏感在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均均能影响培养细胞的生长能影响培养细胞的生长n微生物产品附带杂物n上次细胞残留物n非营养成分的化学物质o需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤）三清洗及灭菌三清洗及灭菌消毒灭菌方法消毒灭菌方法o物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法nCo60辐射（辐射（射线）射线）：破坏生物大分子（塑料制品）n紫紫外外线线（200-300 nm）：30min，阻阻止止细细菌菌、病病毒毒核酸合成。（核酸合成。（细胞室：细胞室：用于空气，操作台表面等用于空气，操
9、作台表面等）n湿湿热热（高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌法法）：121，20min，破破坏坏微微生生物物孢孢子子、蛋蛋白白变变性性。（用用于于大大量量液液体体、玻玻璃璃器器皿皿、部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）n干干热热：160,2小时，高热作用下的氧化作用破坏微生物（耐高温的玻璃和金属制品）n过滤：过滤：m滤膜过滤除菌（少量试剂）消毒灭菌方法消毒灭菌方法o化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法n75%酒精o主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）n1新洁尔灭o主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试消毒（阳离子表
10、面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用）o需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。o清洗的步骤o灭菌的方法：-紫外线（超净台、生物安全柜）-高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502）-75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）小结三清洗及灭菌小结三清洗及灭菌四细胞培养四细胞培养o生长类型o细胞来源o细胞复苏 o细胞传代o细胞冻存o细胞计数o活力测定o污染种类细胞的生长类型细胞的生长类型 n 粘粘附附型型细细胞胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）n 悬悬浮浮型型细细胞胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞
11、等）小鼠单核巨噬细胞白血病细胞细胞贴壁过程细胞贴壁过程每代贴壁细胞的生长过程每代贴壁细胞的生长过程o游离期游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞体圆球形）体圆球形）o贴壁期贴壁期（细胞平均在（细胞平均在10分钟分钟4小时贴壁小时贴壁，底物：胶原、玻，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等）璃、塑料、其它细胞等）o潜伏期潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为（有生长活动，而无细胞分裂，一般为624小时小时o对数生长期对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。 最适合进行实验研究最适合进行实验研究
12、）o停止期（平台期）（停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）（悬浮细胞没有贴壁过程）（悬浮细胞没有贴壁过程）o国内可以买到细胞株的地方有哪些？国内可以买到细胞株的地方有哪些？nATCC（美国模式培养物集存库）国内代理nECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、sigman中国科学院细胞研究所n中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部n武汉大学冷藏中心等细胞来源细胞来源 o确定细胞株的培养信息（确定细胞株的培养信息（ATCC）o配制培养基（基础培养基配制培养基（基础培养基+
13、10%胎牛血清胎牛血清+双双抗）、胰酶、抗）、胰酶、PBSo无菌培养瓶、吸管、离心管的准备无菌培养瓶、吸管、离心管的准备准备工作准备工作细胞复苏（快融）细胞复苏（快融）（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。（3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。（4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。细胞传代细胞传代 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
14、传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。细胞传代细胞传代1 悬浮细胞传代悬浮细胞传代o离离心心法法传传代代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。o直直接接传传代代法法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半贴壁细胞传代半贴壁细胞传代（Hela细胞）o此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。离心新鲜培养基悬浮铺板细胞传代细胞传代 3 贴贴壁壁细细胞胞传传代代o采用酶消化法传代。常用的的胰酶。吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉
15、洗液，加入适量胰酶消化液，37消化1分钟左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。注意：开开放放式式操操作作，小小心心谨谨慎慎、谨谨防防污污染染！细胞冻存（慢冻）细胞冻存（慢冻）1 细胞冻存液（细胞冻存液（1ml/管）管）o基础培养基70o胎牛血清20oDMSO10（二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）2 细胞欲冷冻保存时，细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？o冷冻管内细胞数目一般为1-8x106
16、cells/ml缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。细胞冻存细胞冻存3 慢冻程序慢冻程序n传统方法：410分钟-2030分钟-801618小时（或过夜）液氮长期保存。n程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。细胞冻存细胞冻存小结四小结四 细胞培养过程细胞培养过程o细胞生长类型及传代方法o细胞培养过程培养过程o注意无菌操作无菌操作（全程）准备工作准备工作准备工作准备工作复苏（快）复苏（快）复苏（快）复苏（快）传代（无菌）传代（无菌）传代（无菌）传代（无菌）冻存（慢）冻存（慢）冻存（慢）冻存（慢）实验实验
17、 细胞信息、细胞信息、 方法方法 冻存液成分、冻存液成分、 培养基、耗材培养基、耗材 程序程序细胞计数细胞计数o血细胞计数器：手工计数细胞血细胞计数器：手工计数细胞细胞计数细胞计数计算公式：细胞数/ml4大格细胞总数/4稀释倍数104细胞计数细胞计数注意事项注意事项o记上不记下，记左不记右。o吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡。o镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养细胞活力测定培养细胞活力测定o细胞活力测定是体外实验研究中应用最广的技术手段之一。o任何培养瓶内生长的细胞都由死细
18、胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。培养细胞活力测定培养细胞活力测定1 细胞克隆形成率实验细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。n克隆形成率（克隆形成数接种细胞数）100%n优点：精确、可靠，适于贴壁细胞培养细胞活力测定培养细胞活力测定2 台盼蓝法（台盼蓝法（0.4%）n细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。n用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。培养细胞活力测定培养细胞活力测定3 四唑盐（四唑盐（M
19、TT）比色法）比色法o四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。o原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。oMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。细胞培养的污染类型细胞培养的污染类型 o细菌污染细菌污染o真菌污染真菌污染o支原体污染支原体污染o病毒污染病毒污染o非同种细胞污染非同种细胞污染o化学污染化学污染细菌污染小鼠胃癌细胞的球菌感染 念珠菌污染真菌污染丝状菌污染真菌
20、污染典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400倍图片支原体污染支原体污染电镜照片(X30k)，煎蛋状和其他形状 细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等开放性开放性操作操作之后。之后。原代操作原代操作尤其注意！因此，细胞培养切记：尤其注意！因此，细胞培养切记： “无菌无菌”理念贯穿始终理念贯穿始终，包括：器皿、器械、耗材、培养，包括：器皿、器械、耗材、培养基、试剂、操作习惯。（基、试剂、操作习惯。（一旦污染、立即弃用！一旦污染、立即弃用！） 如何避免污染？如何避免污染？细节决定成败！细节决定成败！小结五小结五 实验方法实验方法o细胞计数
21、的方法o细胞活力测定的方法分类、原理及应用o注意防止细胞污染总结总结o细胞实验所需设备的类型及功能细胞实验所需设备的类型及功能o试剂及耗材的分类及各自用途试剂及耗材的分类及各自用途o清洗物品的过程及灭菌的方法清洗物品的过程及灭菌的方法o细胞培养细胞培养细胞生长过程，细胞来源细胞培养过程（复苏、传代及冻存）细胞计数及活力测定方法注意无菌操作，防止细胞污染注意无菌操作，防止细胞污染 实验中心细胞培养室规章制度实验中心细胞培养室规章制度o细胞实验室是进行各种细胞培养的净化实验室，研究人员经申请准入、培训合格后方可进入细胞室；所有人员必须遵守实验室规章制度，接受工作人员的管理。o进入细胞室前必须穿工作
22、服、换鞋，非实验物品不得带入室内。严禁带入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激气味的物品。注意消防安全，杜绝一切可能导致火灾的行为。o不得在细胞室内进行病原性微生物等易传染物的操作；进行病毒感染细胞的操作须报管理人员备案，在指定的生物安全柜内（8室）进行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作规范。o实验室公用物品在使用后必须放回原处，不得外借或带到其它实验室；不得擅自更改仪器程序；仪器发生异常时，应立即向管理人员报告。若因不按操作规程使用造成仪器损坏，使用者应酌情赔偿。o配制试剂应数量适当，标注规范，按规定妥善存放。无菌试剂专人专用，防止交叉污染。未经允许，不得使用他人物品及翻看他人细胞。o若发现细胞被污染，应立即弃用，禁止继续培养和冻存。进入细胞实验室的所有新细胞株，由管理人员建立细胞株库。其他细胞的冻存，由实验者标记明确后存入指定位置。o实验结束后，应及时清理桌面和地面，整理实验器材。观察培养箱，待温度及CO2浓度正常后方可离开。废弃物品应及时带出操作间，进行相应处理。o遵守生物垃圾、利器和生活垃圾分类存放规定，禁止向水槽内倒入杂物、腐蚀性液体和有毒试剂等。THANKS!
