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1、第六讲第六讲 蛋白质分子设计蛋白质分子设计二、蛋白质分子设计的基础二、蛋白质分子设计的基础 在对一个天然蛋白质进行分子设计时，首先要通过各种方法来获得蛋白质的三维结构信息，在此基础上利用生物信息学及计算机模拟技术确定其特定功能相关位点或结构域作为突变位点或要改变的序列区域，然后利用PCR等技术构建突变体并进行突变体的性质表征直到获得所需的蛋白质。（一）蛋白质生物功能的多样性（一）蛋白质生物功能的多样性蛋白质作为一类生物大分子，具有重要的生理功能一个基因编码多种蛋白质一种蛋白质产生多种活性多肽一种活性多肽产生多种功能而且，在同一蛋白质分子内部，不同的肽段之间也可能存在着相互调控的现象。u Pr分
2、子生物功能的多样性，为我们进行分子设计提供了可能。（二）蛋白质的功能由其高级结构决定（二）蛋白质的功能由其高级结构决定 蛋白质的功能是与其高级结构相联系的，蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整性马肌细胞磷酸甘油酸激酶（马肌细胞磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase）结构域）结构域 （三）蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系（三）蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系 1.蛋白质一级结构的氨基酸顺序，决定多肽链的折叠方式和高级结构； 2.一级结构是空间构象的基础，空间构象遭破坏的多肽链只要其肽键不断，其就能恢复到原来的三级结构； 3.一级结构相似的蛋白质，大
3、多数其基本构象及功能也相似；但关键活性部位的残基发生变化，会影响其空间构象或生理功能，例：“分子病”（四）蛋白质的空间构象与功能活性的关系（四）蛋白质的空间构象与功能活性的关系别构效应（allostery）:肌红蛋白（Mb）：153个AA残基血红蛋白（Hb）：亚基和亚基141个AA中，只有21个位置上的AA相同，但其三维结构十分相似（五）结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子（五）结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子设计设计结构生物学对蛋白质的静态空间结构研究及其动态结构与功能关系的研究为蛋白质分子合理设计提供理论依据，使蛋白质分子设计的目标性更加明确；蛋白质数据库（theproteindata
4、bank,PDB）：X衍射晶体结构数据、NMR实验数据。三、蛋白质分子设计的原则三、蛋白质分子设计的原则 1活性设计活性设计是蛋白质分子设计的第一步，主要考虑被研究的蛋白质功能，涉及选择化学基团和化学基团的空间取向；另外，可以借助量子力学计算预测所需的催化基团。 2对专一性的设计对专一性的设计蛋白质的功能区域可分为催化部位和底物结合部位，其专一性与底物结合部位相关，因此，理解并设计化学基团与底物的专一性结合对蛋白质设计是十分重要的。3Scaffold设计框架设计，是指对蛋白质分子的立体设计；在分子设计中，框架设计是最难的一步：例：最小的酶分子约10000Da，但只有3个基团参与催化，还有几个基
5、团参与与底物结合，这些基团具有特定功能的关键条件之一就是框架化。溶菌酶结构例如鸡蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3端。4疏水基团与亲水基团需合理分布不是简单的使暴露在外面的残基具有亲水性，埋藏在里面的残基具有疏水性，而是还应安排少量的亲水残基在表面，少量的亲水残基在内部。5最优的氨基酸侧链几何
6、排列蛋白质的侧链构象由空间两个立体因素决定：侧链构象决定于旋转每条链的立体势垒；侧链构象由氨基酸在结构中的位置决定。四、蛋白质分子设计的程序四、蛋白质分子设计的程序蛋白质分子设计是一门实验性科学，是理论设计过程与实验过程相互结合的产物，在设计过程中，计算机模拟技术和基因工程操作技术是两个必不可少的工具。蛋白质分子设计步骤蛋白质分子设计步骤修正设计修正设计获得目标蛋白质获得目标蛋白质序列合成序列合成检测检测结构信息分析结构信息分析建立结构模型建立结构模型设计目标设计目标蛋白质数据库蛋白质数据库就目前的水平而言，所选择的目标均是一些残基不多（60-80个AA残基）、结构简单并且具有对称性的多肽结构
7、。选择设计目标选择设计目标序列设计序列设计设计螺旋螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成螺旋的残基；设计全全结构结构时，应选择Val、Ile等易于形成折叠片的残基；而在设计转角转角时常选择Pro-Asn残基对。第二节第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 ：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。一、定位突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“ “小改小改小改小改”
8、”，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为程中最广泛使用的方法，主要可分为程中最广泛使用的方法，主要可分为程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修蛋白质修蛋白质修蛋白质修饰饰饰饰和和和和基因定位突变基因定位突变基因定位突变基因定位突变两类。两类。两类。两类。 （一）定位突变的设计目标及解决方法（
9、一）定位突变的设计目标及解决方法 定位突变常见的设计定位突变常见的设计目标目标是提高蛋白质的是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能功能关系的研究等。关系的研究等。 Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷
10、电基团，His、Cys以及Tyr的置换专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度 （二）定位突变的种类（二）定位突变的种类 要进行基因定位突变，改变要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。技术等。 根据基因突变的方式，分为以下根据基因突变的方式，分为以下三类三类三类三类： 插入一个或多个氨基酸残基；插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目
11、的，多采用体外重组要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技技术或术或PCR方法。方法。1. 定点突变定点突变是当前蛋白质工程研究的主体是当前蛋白质工程研究的主体2. 盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体种不同氨基酸的突变体突变的加和性原则（三）定位突变的程序（三）定位突变的程序1建立所研究蛋白质的结构模型建立所研究蛋白质的结构模型可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。2找出对所要求的性质有重要影响的位
12、置找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。 例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键具有一定的结构特征，随机选择
13、突变位点引入二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。 3预测突变体的结构预测突变体的结构 根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白
14、质结构比较； 利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质； 同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。4构建突变体，获得突变体蛋白构建突变体，获得突变体蛋白依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。5突变体蛋白质的检验突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。要想得到预期的蛋白质，可能需要经过几轮的循环实验
15、才行。蛋白质中功能蛋白质中功能残基的鉴定残基的鉴定突变方法鉴定突变突变方法鉴定突变功能残基功能残基利用蛋白质同源性利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基鉴定突变功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定（四）蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息根据结构信息确定残基的突变确定残基的突变1根据结构信息确定残基的突变根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸
16、部分的作用。2突变方法鉴定突变功能残基突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变3. 利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关，这些残基常作为突变及功能进化的候选基因；非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究；探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。（五）定位突变的应用（五）定位突变的应用目前集中在对具有明显生物功能的天然蛋白质分子加以改性，如胰岛素。RNase T1的结构改造是分于设计中的一个成功实例：的结构改造是分于设计中的一个成功实例：T1核糖核酸酶含有10
17、4个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，建立了RNaseT1S突变体，其热稳定性增加，在55保留70%的活性，而野生型的仅有10%的活性。T4噬菌体溶菌酶噬菌体溶菌酶包含164个AA，Gassner和Matthews对其研究的结果证明，在该酶结构中不存杂二硫键，只有Cys54和Cys97两个半胱氨酸残基。Matthews通过分子设计引入3对二硫键，其中5个Cys均是由突变而来，实验证明突变体比天然蛋白质更为稳定。二、蛋白质分子拼接小的蛋白质分子，有些只有一个结构域，如蝎
18、毒、蛇毒、蜘蛛毒素等多肽类神经毒素；有的由多个结构域组成：例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它所起的细胞识别和粘合作用。丙酮酸激酶的分子则有四个完全不同的结构域组成。蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元件，期望能够转移相应的功能，把优秀的功能结合在一起从而创造出新型蛋白质，最终显著地改变蛋白质的特性。一般是将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质
19、基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验。 我们知道我们知道, , 蛋白质的空间结构受其氨基酸序蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制列控制, , 而功能又与结构密切相关。而功能又与结构密切相关。 如果能够找到构造蛋白质结构的方法如果能够找到构造蛋白质结构的方法, , 我们我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质, , 这这就是蛋白质全新设计问题。就是蛋白质全新设计问题。第三节 全新蛋白质设计 全新蛋白质设计过程全新蛋白质设计过程设计目标设计目标
20、序列生成序列生成结构预测结构预测合成合成构建模型构建模型检测检测 蛋白质从头设计概念蛋白质从头设计概念 从头设计能够根据生物分子的活性位点特征从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生产生一系列的结构片段一系列的结构片段，通过连接这些结构片段通过连接这些结构片段可以构成一个可以构成一个全新分子全新分子；或者在结合腔内对一个；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。已知的结构骨架进行化合物的衍生化。 从头设计方法可以生成全新的分子结构。从头设计方法可以生成全新的分子结构。全新蛋白质设计包括全新蛋白质设计包括一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法二、蛋白质结构的从头设计二、蛋白
21、质结构的从头设计三、蛋白质功能的从头设计三、蛋白质功能的从头设计（一）全新蛋白质设计程序模拟模拟 分析分析 设计设计 实验实验 一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法（二）全新蛋白质设计目标的选择依据设计的目的可以分为：结构的从头设计二级结构功能的从头设计主要进行天然蛋白质功能的模拟选定氨基酸顺序用Monte Carlo法或分子动力学计算其三维模型目标：使构象的能量水平达到最低和稳定（三）设计方法设计方法的分类构建新蛋白质的路径主要有两种：1. 完全通过分子中原子的交互作用而设计出一种称之为氨基酸的蛋白质分子链；2. 氨基酸可以随机进行多种化合物的排列组合，这种逻辑的结论就是只要进行足够
22、的组合最终就能够得到想要的新型蛋白质。首先选择某种主链骨架作为目标结构，随后固首先选择某种主链骨架作为目标结构，随后固定骨架，寻找能够折叠成这种结构的氨基酸组定骨架，寻找能够折叠成这种结构的氨基酸组合，即合，即所谓的所谓的“逆折叠逆折叠”方法方法。从头设计的蛋白质经常是具有正确的拓扑学结构、明显的二级结构、合理的热力学稳定性，但缺乏天然蛋白质的那种高度堆积特异的构象，呈一种“熔球”状态，或者说是部分折叠，这是目前面临的最大困难和最大挑战。设计中的困难为达到一种特异的构象，必须有一个高度特异的核心构象，这个核心在所有可能的状态中具有最低能量，并且与其他竞争状态有个较大的能量差异。有两种办法可以达
23、到这个目的。一种是“反面设计”，即升高竞争构象的能量。 例如，使用一个甘氨酸或脯氨酸使该段不易形成a-螺旋而容易形成一个转角，或者在一些关键点上放上极性残基使该段不易形成错误的疏水核。另一种方法是“靶构象优化”，就是尽可能地搜索具有最小能量的靶构象。二、蛋白质结构的从头设计（一）蛋白质结构的从头设计原则1二级结构的设计原则螺旋折叠片转角2超二级结构和三级结构的设计原则u二级结构的设计原则a-螺旋结构简单，在溶液中比较稳定，因而，对a-螺旋的设计积累了一些经验。1、选择倾向于形成a-螺旋的氨基酸，如Leu、Glu、Met等。2、在设计两亲性的a-螺旋时，为了使结构中形成一个亲水面和一个疏水面，疏
24、水性氨基酸残基应按3或4的间隔排列。3、为稳定a-螺旋，常需要在其N端加一个N帽，形成N帽的氨基酸残基有Gly Asn Met等，在其C端加一个C帽，形成C帽的氨基酸有Gly Ser Arg Gln等。4、设计a-螺旋时，常使带正电荷的氨基酸残基靠近C端，带负电荷的氨基酸残基靠近N端，因为a-螺旋中所有的氢键指向同一方向。-折叠片的设计原则主要是选择形成-折叠片倾向性较大的氨基酸残基及使亲水性残基和疏水性残基相间排列。折叠片转角Pro和Gly是a-螺旋的中断者，Glu是-折叠的中断者，可利用这些氨基酸残基来终止和分割不同的二级结构。蛋白质的几种超二级结构考虑疏水中心的形成，处于螺旋间的界面选择
25、疏水性氨基酸，暴露的表面选择亲水性氨基酸残基。（二）蛋白质结构的从头设计实例最著名的是四螺旋捆结构，这个结构可以作为一个独立的折叠单位，易于独立研究。Degrado等应用“设计循环”的策略，在1986年完成了一个四聚体螺旋捆，每个单体为16个残基，选择三种氨基酸残基 Leu、Lys或Glu，使用Leu作为疏水残基，放在螺旋的内侧，用Lys或Glu作为极性残基，置于螺旋的外侧，每个螺旋用Gly(螺旋终结者)结束，而Gly又为将来加环区埋下了伏笔。之后，研究者在两个反平行的螺旋间加了环区，并根据第一步的结果对螺旋进行了一些修改。环区开始是用单个Pro与两个螺旋的终结者Gly构成Gly-Pro-Ar
26、g-Gly的连接区，结果发现产物成了三聚体(含6个螺旋)，而不是期望的二聚体(4个螺旋)。后来将连接的环区改成Gly-Pro-Arg-Arg-Gly，才得到二聚体。第三步，在二聚体之间加了第三个连接体，用的仍是Pro-Arg-Arg，这个肽共74个残基。最后，他们合成了该多肽的基因，在E.coli中实现了表达。这项工作被誉为蛋白质分子设计的里这项工作被誉为蛋白质分子设计的里程碑。程碑。Degrado设计四螺旋束四螺旋束Richardson设计的四螺旋捆后来Richardson等也设计了四螺旋捆，称为Felix(意为fourhelix)，含79个残基，由非重复序列组成，并在l-4螺旋间加了一个二
27、硫键。除-螺旋外，还有-折叠。-折叠比-螺旋要困难一些，后者主要靠局域性的氢键就可以设计出来，而前者却涉及了序列上靠近或不靠近的不同股之间的氢键。著名的Betabellin(-喇叭筒状蛋白质)是由前后两个-折叠组成，每个折叠由四股组成，由美国学者Erickson和Richardson等设计的。从头设计的三股式折叠 从头设计的从头设计的20个氨基酸残基的三股式个氨基酸残基的三股式折叠折叠（Kortemme T, et al. 1998）型异源四聚体的设计历程(A)23个氨基酸自动折叠成的锌指结构（5）的核磁共振（NMR）结构(Struthersetal.,1996,1998)；(B)5同源四聚体
28、衍生物T2的X-射线结构（Alietal.,2004)；(C)T2异源四聚体衍生物hetT1的X-射线结构(Alietal.,2005).结构域替换结构域替换寡聚化策略寡聚化策略异源专一性异源专一性的计算机重的计算机重新设计新设计/-筒状蛋白质的全新设计(Offredi1,etal.2003)(A)-sheetbarrel(红色)(B)四周环绕-helixbarrel(蓝色)(C)二者由简单结构域1、3和AB（灰色）连接(D)全新/-筒状蛋白质。三、蛋白质功能的从头设计三、蛋白质功能的从头设计蛋白质功能设计主要涉及蛋白质功能设计主要涉及键合和催化键合和催化，为达，为达到这一目的，可以采用两条不
29、同的途径：到这一目的，可以采用两条不同的途径：1.反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；功能；2.从头设计功能蛋白质。从头设计功能蛋白质。北京大学来鲁华教授课题组发展了一种北京大学来鲁华教授课题组发展了一种“蛋白蛋白质关键残基嫁接质关键残基嫁接”的算法来进行蛋白质功能设的算法来进行蛋白质功能设计。主要依据的是蛋白质和蛋白质结合时，往计。主要依据的是蛋白质和蛋白质结合时，往往存在往存在少数几个非常关键的残基少数几个非常关键的残基对结合起到主对结合起到主要作用。基于这种情况，用于将一个蛋白质的要作用。基于这种情况，用于将一个蛋白质的关键功能性残基嫁接到另一个
30、不同结构的蛋白关键功能性残基嫁接到另一个不同结构的蛋白质上，并取得了成功。质上，并取得了成功。促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）通过和它的受体）通过和它的受体（EPOREPOR）相互作用，促进红细胞的分化和成熟。）相互作用，促进红细胞的分化和成熟。将将EPOEPO上的关键功能性残基嫁接到一个结构完上的关键功能性残基嫁接到一个结构完全不同的全不同的PHPH结构域蛋白上后，结构域蛋白上后，PHPH蛋白具有了和蛋白具有了和EPOREPOR结合的功能，而这种功能在自然界中是不结合的功能，而这种功能在自然界中是不存在的。存在的。因此，这种办法将有可能应用在更为广泛的例因此，这种办法将有可能应
31、用在更为广泛的例子上，实现蛋白质功能的自由设计。子上，实现蛋白质功能的自由设计。四、蛋白质全新设计的现状和前景四、蛋白质全新设计的现状和前景现状现状 蛋白质全新设计不仅使我们有可能得到自然蛋白质全新设计不仅使我们有可能得到自然界不存在的具有全新结构和功能的蛋白质界不存在的具有全新结构和功能的蛋白质, ,并并且已经成为检验蛋白质折叠理论和研究且已经成为检验蛋白质折叠理论和研究蛋白质蛋白质折叠规律的重要手段折叠规律的重要手段。由于我们对蛋白质全新由于我们对蛋白质全新设计的理论基础即蛋白质折叠规律的认识还不设计的理论基础即蛋白质折叠规律的认识还不够够, , 所以所以蛋白质全新设计还蛋白质全新设计还处
32、在探索阶段处在探索阶段。蛋白质从头设计这个领域还有许多挑战性的问题，如-折叠蛋白质、/交替蛋白的设计还有困难。即使对-螺旋蛋白而言，要设计与天然蛋白质各种性能一样的蛋白质仍然是个问题。序列组合中只有极少数序列能形成精确的结构、高水平的活性，要设计出这样的分子无疑是个难度更高的课题。例：例：在设计思想上，目前偏重考虑某一蛋白质结构在设计思想上，目前偏重考虑某一蛋白质结构的稳定因素，的稳定因素，而不是综合考虑各种因素，在超而不是综合考虑各种因素，在超二级结构和三级结构的设计中，常常是力求使二级结构和三级结构的设计中，常常是力求使各二级结构片段都具有最大的稳定性，这与天各二级结构片段都具有最大的稳定
33、性，这与天然蛋白质中三级结构的形成是二级结构形成和然蛋白质中三级结构的形成是二级结构形成和稳定的重要因素刚好相反。稳定的重要因素刚好相反。在设计结果上，目前还只能设计较小的蛋白质，在设计结果上，目前还只能设计较小的蛋白质，现有的蛋白质分子设计工作一般侧重于一些结现有的蛋白质分子设计工作一般侧重于一些结构简单、规律明显的蛋白质，而且其水溶性也构简单、规律明显的蛋白质，而且其水溶性也很差，大多数不具备确定的三级结构。很差，大多数不具备确定的三级结构。前景前景 随着新实验技术的发展随着新实验技术的发展, , 蛋白质全蛋白质全新设计的速度和效率必将得到极大的提新设计的速度和效率必将得到极大的提高。如组
34、合化学方法应用到蛋白质全新高。如组合化学方法应用到蛋白质全新设计中必然能够大大地缩短设计的周期设计中必然能够大大地缩短设计的周期, , 并将彻底改变蛋白质全新设计的面貌并将彻底改变蛋白质全新设计的面貌。蛋白质工程在医学研究中的应用蛋白质工程在医学研究中的应用一、提高一、提高蛋白质蛋白质的稳定性的稳定性葡萄糖异构酶(G1)在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Glyl38)为目标氨基酸后，用双引钩法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸(Pr0138)替代Glyl38，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达。结果突变型GI比野生型的热半衰期长1倍，酶比活性相同。据分析，
35、PM替代Glyl38后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Glyl38附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。二、融合蛋白质二、融合蛋白质脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与S型受体结合的基本功能区域，干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。黎孟枫等人化学合成了EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用H-胸腺嘧啶核苷掺人法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过纳洛酮竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。三、
36、蛋白质活性的改变三、蛋白质活性的改变通常饭后30-60min，人血液中胰岛素的含量达到高峰，120-180min内恢复到基础水平。而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后120min后才出现高峰，且持续180-240min，与人生理状况不符。实验表明，胰岛素在高浓度(大于1015mol/L)时以二聚体形式存在，低浓度时(小于09mol/L)时主要以单体形式存在。设计速效胰岛素的原则就是避免胰岛素形成聚合体。胰岛素生长因子-I(1GF-1)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF-I不形成二聚体。IGF-I的B结构域(与胰岛素B链相对应)中B28B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28Lys-B29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床试验。
