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1、 质粒提取和限制性内切酶消化质粒提取和限制性内切酶消化2021/8/21目目 的的巩固质粒的概念，通过原理部分的学习加深对质粒DNA与染色体DNA理化性质差异的认识 学习碱裂解法提取质粒DNA的方法掌握酶切反应的操作2021/8/22质粒提取2021/8/23质粒是染色体外小型（质粒是染色体外小型（1-2001-200kbkb）的共价、闭合、的共价、闭合、环状的双链环状的双链DNADNA分子，能自主复制并能稳定遗传分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。的遗传因子。 是进行是进行DNADNA重组的常用载体。重组的常用载体。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因常常编码一些对宿主有利的酶的基
2、因，这些基因的表型主要为抗生素抗性。的表型主要为抗生素抗性。质质 粒粒 2021/8/24AmpAmpr r抗性基因抗性基因AmpAmpr r抗抗性性基基因因编编码码一一种种周周质质酶酶（- -内内酰酰胺胺酶酶）可可特特异异地地切割切割AmpAmp的的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力内酰胺环，从而使其失去杀菌能力2021/8/25常常 用用 质质 粒粒 提提 取取 方方 法法煮沸法煮沸法 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。提取的质粒DNA中会含有RNA。碱裂解法碱裂解法2021/8/26碱裂解法提取原理碱裂解法提取原理 宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DN
3、A的结构状态的差异 加入碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开 当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。环、闭环超螺旋。 2021/8/27收菌重悬裂解中和过柱洗涤洗脱质粒提取试剂盒操作步骤质粒提取试剂盒操作步骤 P1: 50mM葡萄糖，25mMTris-HCl, 10mM EDTA pH8.0 P2: 0.2MNaOH,1%SDS P3: 3M醋酸钾, 2M醋酸 硅基质膜在高盐低pH值（pH7.5）时可结合
4、DNA，在低盐及高pH值（pH8）条件下洗脱。75%乙醇对数生长后期2021/8/28取菌液12,000rpm离心离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清）用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮加入250uLP2，温和温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮)加入350uLN3, 立即温和立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀）12,000rpm离心10min小心吸取上清，加入吸附柱小心吸取上清，加入吸附柱 12,000rpm离心离心1min 弃滤液弃滤液加入700uL buffer PW 12,000rpm 离心离心1min， 弃滤液空柱12,000rpm 离心离心2min， 室
5、温开盖放置3 5 min加入500uL buffer PW 12,000rpm 离心离心1min， 弃滤液吸附柱置于新离心管中，加入50-100uLbuffer EB, 室温放置室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，收集质粒溶液到离心管，-20 保存。保存。CWBIO2021/8/29取菌液12,000rpm离心离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清）用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮加入250uLP2，温和温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮)加入350uLP3, 立即温和立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀）12,000rpm离心1
6、0min小心吸取裂解上清，加入吸附柱小心吸取裂解上清，加入吸附柱 12,000rpm离心离心1min 弃滤液弃滤液加入500uL buffer PD 12,000rpm 离心离心1min， 弃滤液空柱12,000rpm 离心离心2min， 室温开盖放置3 5 min加入600uL buffer PW 12,000rpm 离心离心1min， 弃滤液 （重复一次重复一次）吸附柱置于新离心管中，加入50-100uL洗脱液洗脱液 EB, 室温放置室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，收集质粒溶液到离心管，-20 保存。保存。T&G（500uL 平衡液平衡液BL，加入吸附柱，加入吸附柱 12,000rpm离心离心1min 弃滤液）弃滤液）2021/8/210质粒电泳图质粒电泳图开环的双链环状开环的双链环状DNA直线直线DNA共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA2021/8/211部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
