碱性磷酸酶米氏常数的测定碱性磷酸酶米氏常数的测定 浙江中医药大学生命科学学院浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室生物化学教研室 [ [目的与要求目的与要求] ] 1.1.通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义法及意义2.2.学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解应动力学的理解 [原理原理] ] 酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境的温度、的温度、pHpH和酶的浓度等等，在环境的温度、和酶的浓度等等，在环境的温度、pHpH和和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时酶促反应的速度关系表现在反应开始时酶促反应的速度(V)(V)随底物随底物浓度浓度(S)(S)的增加而迅速增加若继续增加底物浓度，的增加而迅速增加若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少当底物浓度增加到某种反应速度的增加率将减少当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度速度( (VmaxVmax) )，如图，如图3737所示所示 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程式表示。
方程式表示 V = V = Vmax[S]/(Km+[SVmax[S]/(Km+[S])]) 上式中上式中VmaxVmax为最大反应速度，为最大反应速度，[S][S]为底物浓度，为底物浓度，KmKm为米为米氏常数氏常数( (MichaelisMichaelis constant) constant)，而其中，而其中V V则表示反应的则表示反应的起始速度当起始速度当V= Vmax/2V= Vmax/2时，时，Km =[S]Km =[S]所以米氏常数是所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度因此反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度因此KmKm的单位以摩尔浓度的单位以摩尔浓度(mol(mol／／L)L)表示 KmKm是酶的最重要的特征性常数，测定是酶的最重要的特征性常数，测定KmKm值是研究酶动力学值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的的一种重要方法，大多数酶的KmKm值在值在0.01-100(mmol/L)0.01-100(mmol/L)间 酶促反应的最大速度酶促反应的最大速度VmaxVmax实际上不易准确测定，实际上不易准确测定，KmKm值也就不易准确测出。
林值也就不易准确测出林- -贝贝 (1ineweaver - (1ineweaver - Burk)Burk)根据根据Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程，推导出如下方程方程，推导出如下方程式，即：式，即：( (两边取倒数）两边取倒数） 1/V = 1/V = （（Km +[S]Km +[S]））/ / Vmax[SVmax[S] ] 或或1/V = Km/ 1/V = Km/ VmaxVmax··（（1/[S]1/[S]））+1/ +1/ VmaxVmax ( (得类似：得类似：y=y=ax+bax+b的直线方程的直线方程 ）） y = 1/Vy = 1/V，， a = Km/ a = Km/ VmaxVmax，， x = 1/[S] b = 1/ x = 1/[S] b = 1/ VmaxVmax 此式为直线方程，以不同的底物浓度此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]1/[S]为横坐为横坐标，以标，以1/V1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km-1/ Km，由此可以，由此可以正确求得该酶的正确求得该酶的KmKm值，如图所示。
值，如图所示 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据的酶活性，再根据LineweaverLineweaver-Burk-Burk法作图，计算其法作图，计算其KmKm值 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的应的酶对于不同的底物有不同的KmKm值本实验以磷值本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与4-4-氨基安替比林氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比根据吸光度的大小可以色深浅和酚的含量成正比根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小反应式如下：量，进而算出酶活性的大小反应式如下： 三、三、[ [试剂与器材试剂与器材] ] 1 1．．0.04mol/L 0.04mol/L 基质液基质液 2 2．．0.1mol0.1mol／／L L碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH10(37℃) pH10(37℃) 3 3．碱性溶液．碱性溶液 4 4．．0.50.5％铁氰化钾％铁氰化钾 5 5．．0.30.3％％ 4-4-氨基安替比林氨基安替比林 6 6．酚标准液．酚标准液(0.1mg/mL) (0.1mg/mL) 7 7．．37℃37℃恒温水浴锅恒温水浴锅 8 8．可见光分光光度计．可见光分光光度计 四、四、[ [操作步骤操作步骤] ] 1 1．酚标准曲线的绘制．酚标准曲线的绘制 ：： 酚含量（酚含量（μgμg）：）： 0 5 10 20 30 400 5 10 20 30 40 (2)(2)混匀后室温放置混匀后室温放置1515分钟，于分钟，于510nm510nm波长处比色。
波长处比色 (3)(3)以酚含量以酚含量( (μgμg) )为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线酚标准曲线 2. 2. 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 最终基质浓度单位：最终基质浓度单位：µmol/mlµmol/ml (2)(2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置各管置37℃37℃水浴中准确保温水浴中准确保温1515分钟3)(3)保温结束，立即加碱性溶液保温结束，立即加碱性溶液1.1mL1.1mL终止反应终止反应 (4)(4)各管分别加入各管分别加入0.30.3％％ 4-4-氨基安替比林氨基安替比林1.OmL1.OmL，，0.50.5％％ 铁氰化钾铁氰化钾2.0mL2.0mL，充分混，充分混匀，放置匀，放置1010分钟，以分钟，以6 6号空白管作对照，号空白管作对照，于于510nm510nm波长处比色测定，根据酚标准曲波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性线计算酶活性 (5)(5)以各管基质浓度的倒数以各管基质浓度的倒数1/[S]1/[S]为横坐为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数单位的倒数1/V1/V作纵坐标，作图求出作纵坐标，作图求出KmKm值。
值 [ [结果与计算结果与计算] ] 在在37℃37℃保温保温1515分钟，每生成分钟，每生成1mg1mg酚为一个酶酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量活性单位，以标准曲线查出释放酚量( (μgμg) )即可即可算出酶活性算出酶活性 100mL100mL血清中酶活性血清中酶活性 = = 释放的酚量释放的酚量××（（1/0.11/0.1））×100××100×（（1/10001/1000））=释放的酚量（释放的酚量（μg）） （释放酚量（（释放酚量（μgμg）、）、1/0.1--0.11/0.1--0.1为实际取血清为实际取血清0.1ml0.1ml、、100100为为100ml100ml血清、血清、10001000为为μgμg变为变为mgmg [ [注意事项注意事项] ] 1 1．血清取量要准确．血清取量要准确 2 2．标准曲线必须是一条直线．标准曲线必须是一条直线 （一）（一） KmKm值测定的意义值测定的意义1.1.当反应速度为最大速度一半时，当反应速度为最大速度一半时，VmVm = 1/2 = 1/2 VmaxVmax，，Km = [S]Km = [S] Km Km是指底物的浓度，含义：是指底物的浓度，含义：KmKm值等于酶促反应速度为最大值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
速度一半时的底物浓度 2. Km2. Km值可表示酶对底物的亲和力值可表示酶对底物的亲和力 KmKm值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的 底物浓度便可容易地达到最大反应速度底物浓度便可容易地达到最大反应速度 3.Km 3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境相关，与酶的浓度无关和反应环境相关，与酶的浓度无关 各种酶的各种酶的KmKm值范围很广大多数酶在值范围很广大多数酶在0.01-100mmol/L0.01-100mmol/L间；对于同间；对于同一底物，不同的酶有不同的一底物，不同的酶有不同的KmKm值；多底物反应的酶对于不同底值；多底物反应的酶对于不同底物也有不同的物也有不同的KmKm值 （二）酶活性（（二）酶活性（U/LU/L））1.1.酶活性单位：在特定条件下，酶促反应在单酶活性单位：在特定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。
底物所需的酶量2.2.酶活性国际单位（酶活性国际单位（IUIU）：按照国际酶学会议）：按照国际酶学会议的规定，的规定，1 1个酶活力单位是指在个酶活力单位是指在25℃25℃、测量、测量的最适条件（指最适的最适条件（指最适pHpH、温度等）下，、温度等）下，1 1分分钟内能引起钟内能引起1 1微摩尔底物转化的酶量微摩尔底物转化的酶量 课后复习题 1.1.写出林贝方程写出林贝方程 2.2.简要叙述碱性磷酸酶简要叙述碱性磷酸酶KmKm测定方法测定方法 。