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1、PCR技术及其应用PCR技术及其应用PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘PCR技术简史DNA的复制1971年，1971年，美国麻省理PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合
2、酶链反应（PCR）；基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制；最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错；耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪；1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。Kary B. MullisKary B. Mullis ，19891989年年美国美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻为十余项重大科学发明之首，比喻19891989年为年为PCRPCR爆爆炸年，炸年，MullisMullis荣获荣
3、获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。PCR技术简史DNA的复制1985年，美国PE-Cetus公引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNATaq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性酶活性酶活性酶活性(%)(%)(%)(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶二、二、PCRPCR的基本原理
4、的基本原理PCR基本原理基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚的基本步聚 1、变性 (Denaturation) ：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火 (Annealing) ：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸 (Extension )：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR
5、循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。二、PCR的基本原理PCR基本原理 类似于DNA的体内复制7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环(30-40)(30-40)变性变性退火退火延伸延伸PCRPCR反应程序反应程序729455PCR循环(30-40)变性退火延伸PCRPCRPCR反应程序反应程序PCR反应程序PCR技术及其应用PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图 模板模板DNA的变性：模板的变性
6、：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；5335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加热加热94PCR Cycle - Step 1 - Denaturat引物酶 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火
7、(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，经加热变性成单链后，温度降至温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533引物酶3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3553引物酶
8、 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复
9、为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板制原理，合成一条新的与模板DNA 链。链。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5533引物引物PCR Cycle - Step 3 - At 72 TEnd of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTar
10、get Sequence 每完成一个循环需每完成一个循环需2-4 min， 2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。3535TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5533End of the 1st PCR Cycle ResuTarget AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664
11、201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconTarget AmplificationNo. ofNo.三、PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应条件：反应条件：10X缓冲液 10 L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.1
12、2gTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L三、PCR反应PCR反应条件标准的PCR反应条件：PCR仪PCR仪PCR仪PCR仪PCR仪PCR仪PCR反应过程PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR反应过程PCR反应条件模板DNA95模板DNA951234522557294时间（min）温度（）PCR反应过程PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR的基本原理PCR反
13、应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72TPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件955072TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束
14、PCR的基本原理PCR反应条件72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的基本原理PCR反应条件重复30轮后模板DNA第1轮扩PCRPCR反应反应的特点的特点PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(10-6g)水平；2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞；3.
15、病毒检测的灵敏度可达3个RFU；4.细菌检测的最小检出率为3个细菌。高度的特异性 Taq酶造成的碱基误配机率大约是1/20000简便、快速1.一次性加好反应液，2-4 h完成扩增；从第3循环开始，DNA双链片段以2n增加。2.扩增产物一般用电泳分析。对标本的纯度要求低，适用样品广泛 u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA。PCR反应的特点PCR反应条件灵敏度高1、PCR反应成分1 1）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA或或RNARNA都可以作为都可以作为PCRPCR的样品。若起始材料是的样品。若起始材料是RNARNA，须先通过逆转录得到第一条须先通过逆转录得到第一条
16、cDNAcDNA。 模板不能混有蛋白酶、核酸酶、模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋结合蛋白类。白类。 一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 l l。模板浓度过高会导致反应的非特模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。四、PCR反应体系模板模板引物引物Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶4种种dNTP混合物混合物MgMg2+2+10缓冲液缓冲液1、PCR反应成分1）模板四、PCR反应体系模板2）引物 （1）浓度 0.1-0.5 M
17、 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键；特异性反应的关键；PCRPCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLCHPLC进行纯化。进行纯化。2）引物引物是PCR特异性反应的关键；引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大,在PCR产物检测时,在溴酚兰前面可以看到1条引物带(由于前后引物等大小)。如果引物太少,使得非特异性扩增发生,从而出现杂带。不同试验对浓度的要求也不一样,而引物浓度大对特异性PCR的结果
18、影响不大,但是会造成试剂的浪费;引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/ L较好。引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大,在PCR产物检测（2)PCR引物的设计一般原则 根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物 引引物物长长度度一一般般以以18-30bp18-30bp为为宜宜，过过短短则则降降低低特特异异性性，过过长长则则会会引引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。起引物间的退火而影响有效扩增，
19、同时也增加引物合成的成本。 避避免免引引物物内内部部出出现现二二级级结结构构，避避免免序序列列内内有有较较长长的的回回文文结结构构，使引物自身不能形成发夹结构。使引物自身不能形成发夹结构。 G/CG/C和和A/TA/T碱碱基基均均匀匀分分布布，G+CG+C含含量量在在40-60%40-60%之之间间，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；ATGC尽尽可可能能选选择择碱碱基基随机分布，避免避免5个以上的嘌呤或嘧啶连续排列。嘌呤或嘧啶连续排列。 要要避避免免两两个个引引物物间间特特别别是是3 3 末末端端碱碱基基序序列列互互补补以以及及同同一一引引物物自自身身33末末端端碱碱基基序序
20、列列互互补补的的，使使它它们们不不能能形形成成引引物物二二聚聚体体或或发发卡卡结结构。构。（2)PCR引物的设计一般原则 根椐待扩增的DNA片段， 引引物物33末末端端碱碱基基一一般般应应与与模模板板DNADNA严严格格配配对对，并并且且33末末端端为为G G、C C或或T T时引发效率较高。时引发效率较高。 引引物物55末末端端碱碱基基可可不不与与模模板板DNADNA匹匹配配，可可添添加加与与模模板板无无关关的的序序列列( (如如限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的识识别别序序列列、ATGATG起起始始密密码码子子或或启启动动子子序序列列等等) )，便便于于克克隆隆和和表表达达，但但其其保保
21、护护碱碱基基有有一一定定的要求。的要求。 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 引物量：每条引物的浓度0.1-1 Ml或10-100 pM，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端3 3 3 3）Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)thermus aquaticus)thermus aquaticus)目前有两种目前有
22、两种TaqTaq脱氧核糖核酸聚合酶供应：脱氧核糖核酸聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯；天然酶：从栖热水生杆菌中提纯；基因工程酶：大肠菌合成；基因工程酶：大肠菌合成；一般一般一般一般0.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/50 l l l l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus4 4）dNTP dNTP ( ( ( (dATP、dCTP、dGTP、dTTP
23、 4） dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度; ; 四种四种四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等浓度应相等浓度应相等; ; PCR常用的浓度为常用的浓度为50-200M，不能低于，不能低于10-15M。 浓度过高浓度过高浓度过高浓度过高会抑制会抑制Taq 酶的活性，酶的活性，易产生错误碱基的易产生错误碱基的易产生错误碱基的易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量; ; dNTP dNTP可与可与可与可与MgMg2+2+结合
24、，使游离的结合，使游离的结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降，影浓度下降，影浓度下降，影浓度下降，影 响响响响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。聚合酶的活性。聚合酶的活性。4）dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4）dNTPdNTP呈颗粒状，呈颗粒状， 保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTPdNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M 1M NaOHNaOH或或1M Tris-HCl1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pHpH调节到调节到7.0-7.0-7.57.5，小量分装，小量分装，-20-20冰
25、冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTPdNTP降解；降解；在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为50-20050-200 M M，尤其是注意，尤其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制），的浓度要相等（等摩尔配制）， 如其中如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低就会引起错配。浓度过低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活5 5）MgMg2+2+ MgMg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活剂，聚合酶的激活剂，对对对对P
26、CRPCRPCRPCR扩增的特异性和产扩增的特异性和产扩增的特异性和产扩增的特异性和产量有显著的影响。量有显著的影响。量有显著的影响。量有显著的影响。 在一般的在一般的在一般的在一般的 PCR PCR PCR PCR反应中，各种反应中，各种反应中，各种反应中，各种NTPNTPNTPNTP浓度为浓度为浓度为浓度为200 200 200 200 M/LM/LM/LM/L时，时，时，时，MgMgMgMg2+2+2+2+浓度为浓度为浓度为浓度为1.5-2.0 mM/L1.5-2.0 mM/L1.5-2.0 mM/L1.5-2.0 mM/L为宜为宜为宜为宜MgMg2+2+浓度过低会使浓度过低会使TaqT
27、aq酶活酶活性丧失、性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；MgMg2+2+过高过高反应特异性降低，出现反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布。 Mg Mg2+2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等的浓度影响反应中游离的的浓度影响反应中游离的MgMg2+2+浓度。浓度。5）Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩6）10PCR缓冲液：缓冲液： 500 mM KCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明胶。明
28、胶。6）10PCR缓冲液：PCR反应体系：反应体系： 10PCR buffer 10l dNTP mix 各各200M 引物引物1 1M 引物引物2 1M DNA模板模板 50ng-1g Taq 酶酶 2U 加双蒸水至总体积为加双蒸水至总体积为100lPCR反应体系：PCR扩增程序扩增程序: 94, 300S 94, 60S 55, 60S 72, 60S 72, 7min 30 循环循环PCR扩增程序: PCR条件的优化条件的优化 1、反应缓冲液：、反应缓冲液：50 mM KCl，10 mM Tris-HCl (pH8.3，室温，室温)，1.5 mM MgCl22、dNTP mix ：常用终
29、浓度为：常用终浓度为50-400M3、Taq DNA聚合酶：聚合酶：2-4 U/100l4、引物引物5、模板：、模板：PCR对模板的要求不高，单、双链对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为均可作为PCR的的样品。样品。6、循环、循环PCR条件的优化 1、反应缓冲液：50 mM KCl，10 2、循环参数(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链 95oC 20-40秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。2、循环参数（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加（3）延伸PCR analysis of transgenic plants M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CKPCR analysis of transgenic pla感谢聆听
