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1、生物化学与分子生物学基础实验 实验一实验一 几种几种蛋白质定量测蛋白质定量测定方法的比较定方法的比较生物化学与分子生物学基础实验1 1 掌握紫外吸收法、掌握紫外吸收法、FolinFolin酚试剂法酚试剂法（LowryLowry法）和考马斯亮蓝染色法法）和考马斯亮蓝染色法（BradfordBradford法）测定蛋白质含量的原法）测定蛋白质含量的原理和方法理和方法2 2 掌握分光光度计的原理和使用方法掌握分光光度计的原理和使用方法实验目的实验目的生物化学与分子生物学基础实验有多少样品可供分析有多少样品可供分析; ; 蛋白质样品浓度大约是多少蛋白质样品浓度大约是多少; ; 样品中含有哪些可能影响定
2、量的样品中含有哪些可能影响定量的化学物质化学物质；所选方法是否简单、可靠；所选方法是否简单、可靠；含量测定的专一性要求是否很高。含量测定的专一性要求是否很高。选择合适的蛋白质含量测定方法主要选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑基于几点考虑：生物化学与分子生物学基础实验常用的方法常用的方法n物理性质：物理性质：紫外吸收法紫外吸收法n化学性质：化学性质：FolinFolin酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法），BCA法法（Bicinchoninic acidBicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等法）
3、，胶体金测定法，等等n染色性质：染色性质：考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法（BradfordBradford法）法）、银染、银染法法 测测定定绝绝对对含含量量应应用用凯凯氏氏定定氮氮法法（蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量为为1616）。）。生物化学与分子生物学基础实验 蛋白质在紫外光区（蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强有两个强烈吸收峰：烈吸收峰：280nm和和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸色氨酸(Trp)、和酪和酪氨酸氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收有芳香
4、环，可吸收280nm波长的光子，苯波长的光子，苯丙氨酸（丙氨酸（Phe）、组氨酸（、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此此相同浓度的不同种类蛋白质，其相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差的吸收值差别很大别很大(图图1)。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验图图1.1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱蛋白质和核酸的紫外吸收光谱图图A A是是1515g g /ml/ml蛋蛋白白的的吸吸收收光光谱谱。图图A A中中插插图图是是1 1mg/mlmg/ml的的牛牛免免疫疫球球蛋蛋白
5、白IgG(I)IgG(I)、牛牛血血清清白白蛋蛋白白( (B)B)和和白白明明胶胶( (G)G)的的吸吸收收光光谱谱，缓缓冲冲液液为为：0.01% 0.01% Brij35,0.1M Brij35,0.1M K K2 2SOSO4 4,5mM ,5mM KHKH2 2POPO4 4,pH7,pH7。 图图B B是是1010g g /ml /ml RNARNA和和DNADNA的的吸吸收收光谱。光谱。生物化学与分子生物学基础实验肽键在肽键在190nm有强吸收峰。有强吸收峰。一般分光光度计在一般分光光度计在190nm的光强较弱，且的光强较弱，且O2在在此波长有吸收，因此通常使用此波长有吸收，因此通常
6、使用205nm或或210nm波长，波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的的侧链在此波长有吸收。优点：侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，灵敏，较稳定。较稳定。缺点缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含干扰因素多。许多化学物质特别是含CC双键和双键和CO双键的物质在此波长范围有双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。吸收，所以必须严格控制反应条件。 紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验优点：优点：不需添加任何试剂，因而对样品没有任何不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；破坏；测量极其简单迅速；测量极其简单迅速；蛋白浓度和吸
7、光度是线性关系，容易计算。蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。质。紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验缺点缺点：干干扰扰测测定定的的影影响响因因素素多多，尤尤其其是是RNA和和DNA在在此此波波长长均均有有强强吸吸收收, 所所以以一一定定要要考考虑虑样样品品中中是是否否有有核核酸酸.要要得得到到准准确确可可靠靠的的结结果果，必必须须严严格格控控制制样样品品溶溶液液的的pH和和化化学学组组成成，使使待待测测样样品品和和标标准准样样品品的的实实验验条条件件一致。一致。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。敏
8、感度低，要求样品的浓度较高，量较大。用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。较大。紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验管号管号0 01 12 23 34 45 56 67 7标准蛋白溶液标准蛋白溶液（mlml）0 01.01.01.51.52.02.02.52.53.03.04.04.00 0双蒸水（双蒸水（mlml）4.04.03.03.02.52.52.02.01.51.51.01.00 00 0蛋白质含量蛋白质含量( (mg/ml)mg
9、/ml)0 00.250.250.3750.3750.50.50.620.625 50.70.75 51.01.0未知蛋白溶液未知蛋白溶液（mlml）-4.04.0A A280280操作步骤操作步骤紫外吸收法紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验考马斯亮蓝染色法（考马斯亮蓝染色法（Bradford法）法）原原理理：该该方方法法由由Bradford于于1976年年建建立立。在在酸酸性性条条件件下下，考考马马斯斯亮亮蓝蓝与与蛋蛋白白质质结结合合后后最最大大光光吸吸收收波波长长由由465465nmnm（红红色色）转转移移为为595595nmnm（蓝蓝色色），起起作作用用的的主主要要氨氨基基酸酸是是A
10、rgArg，另另外外，His, His, Lys, Lys, Tyr, Tyr, TrpTrp和和PhePhe也也有有作用。作用。2 25 5minmin呈呈最最大大光光吸吸收收，至至少少可可稳定稳定1 1小时小时生物化学与分子生物学基础实验n简便简便, 迅速，灵敏度较高迅速，灵敏度较高。只需要一种反应。只需要一种反应试剂试剂n影响因素较少。影响因素较少。去污剂去污剂和和两性物质两性物质对测定有对测定有干扰干扰n小于小于3000Da 的多肽无法测定的多肽无法测定n蛋白浓度高时非线性蛋白浓度高时非线性n配制的染色液需过滤除去未溶解的配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮考马斯亮蓝蓝G250考马斯
11、亮蓝染色法（考马斯亮蓝染色法（Bradford法）法）生物化学与分子生物学基础实验实验操作步骤实验操作步骤 室温室温放置放置5分钟后测分钟后测595nm的光吸。的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。注意混匀，但不要剧烈震荡。 考马斯亮蓝染色法（考马斯亮蓝染色法（Bradford法）法）生物化学与分子生物学基础实验原原理理：Folin-Folin-酚酚试试剂剂法法的的显显色色试试剂剂由由试试剂剂甲甲和和试试剂剂乙乙 组成。组成。试试剂剂甲甲中中的的CuC
12、u2+2+碱碱性性条条件件下下与与肽肽键键形形成成络络合合物物并并被被还还原原成成CuCu+ +。 CuCu+ +以以及及蛋蛋白白质质中中的的TyrTyr等等的的侧侧链链基基团团与与试试剂剂乙乙反反应应，试试剂剂乙乙中中的的磷磷钼钼酸酸盐盐磷磷钨钨酸酸盐盐被被蛋蛋白白质质中中的的Tyr和和Phe残残基基还还原原，产产生生蓝蓝色色化化合合物物（钼钼兰兰和和钨钨兰兰的的混混合合物物），显色反应在显色反应在30分钟内接近极限。分钟内接近极限。颜色深浅与蛋白含量成正比，可在颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640640nmnm下测光吸收。下测光吸收。 Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）生物
13、化学与分子生物学基础实验酸、铜离子螯合剂（如酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙醇、醇、DTT、苯酚等）干扰本反应苯酚等）干扰本反应。不同蛋白质主要因其所含的不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。含量不同而呈现不同的吸收强度。进行测定时，进行测定时，加试剂乙时加试剂乙时要特别小心，因为要特别小心，因为该试剂仅在酸性该试剂仅在酸性pH条件下稳定条件下稳定，但上述还原反应只在，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试的情况下发生，故当试剂乙加到碱性的铜剂乙加到碱性的铜蛋白质溶液中时，蛋白质溶液中时，必须立即混匀必须立即
14、混匀，以便在磷，以便在磷钼酸钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。被破坏之前，还原反应即能发生。这一步混这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱合速度要快，否则会使显色程度减弱。因因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。制时间。费时较长，试剂配制较繁琐费时较长，试剂配制较繁琐。Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）生物化学与分子生物学基础实验实验步骤实验步骤 01234567标准蛋白（准蛋白（1mg/ml）ul02040801201602000待待测样品品 ul-200蒸蒸馏水水 ul10
15、00980960920880840800800Folin-酚酚试剂甲甲 ml44444444混匀，于室温放置混匀，于室温放置10分分钟Folin-酚酚试剂乙乙 ul250250250250250250250250迅速混匀，迅速混匀，30水浴保温水浴保温30分分钟A640Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）生物化学与分子生物学基础实验试剂、实验材料：试剂、实验材料：（已放在每个试验台的架子上）（已放在每个试验台的架子上）标准蛋白溶液：标准蛋白溶液：1mg/ml BSA未知蛋白溶液未知蛋白溶液考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液Folin-酚试剂甲酚试剂甲Folin-酚试剂乙酚试剂乙生物
16、化学与分子生物学基础实验Lowry 法的改进法。法的改进法。碱性条件下，蛋白分子中的肽键与碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并形成络合物，并将将Cu2+还原成还原成Cu+；Cu+与与BCA结合成紫色复合物，在结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓处吸收值与浓度呈正比度呈正比BCA法法生物化学与分子生物学基础实验n与与Lowry方法相比，方法相比，BCA法的操作更简单，法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），），应用更加灵活。应用更加灵活。n可耐受高达可耐
17、受高达5%的表面活性剂的表面活性剂n测定不同蛋白样品时比测定不同蛋白样品时比bradford测定法结果测定法结果均一均一 BCA法法生物化学与分子生物学基础实验常用的测定蛋白质含量方法的比较方方 法法测定范围测定范围（g/ml）不同种类不同种类蛋白的差异蛋白的差异最大吸收最大吸收波长波长(nm)特特 点点凯氏定氮法凯氏定氮法小小标准方法，准确，操作麻烦，费时，标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定灵敏度低，适用于标准的测定紫外吸收法紫外吸收法1001000大大280205灵敏度稍低，快速，不消耗样品，灵敏度稍低，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响核酸类物质有影响双缩脲法双缩
18、脲法100010000小小540重复性、线性关系好，灵敏度低，重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法酚试剂法20500大大500-750灵敏，费时较长，干扰物质多灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝考马氏亮蓝G-25050500大大595灵敏度高，稳定，误差较大，颜色灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移会转移BCA202000大大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长时较长生物化学与分子生物学基础实验1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一
19、样品得出的样品浓度可能会有较大差异。法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。 2、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品化学构成类似的标准蛋白作标准品。 3、所有的样品（包括标准样品），都必须、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间在规定时间内测试内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出。时间过长，得到的吸
20、光值会有变化，导致测出的样品浓度与实际的浓度不符。的样品浓度与实际的浓度不符。 注注 意意生物化学与分子生物学基础实验722型光栅分光光度计型光栅分光光度计光光源源单单色色器器样样品品池池光光电电源源件件读读数数单单元元测量完毕，请把光度计的盖打开测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 讲解完毕后，每个组出一个同学去讲解完毕后，每个组出一个同学去127听老师讲解仪器使用。听老师讲解仪器使用。生物化学与分子生物学基础实验TU1800 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计波长范围：波长范围：2001100nm测光系统：单光束测光系统：单光束功能指标：光度测量功能指标：光度测量 光谱扫描光谱扫描 定量测量
21、定量测量钨灯：钨灯：3401100nm氘灯：氘灯：200340nm生物化学与分子生物学基础实验1 测紫外吸收要用测紫外吸收要用石英比色皿石英比色皿 ！2 定量实验取液要准确。定量实验取液要准确。3 从低浓度到高浓度从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润依次测量，比色皿不要润洗。洗。 因此因此3ml溶液溶液足够测定。足够测定。4 测量完毕，请把光度计的盖打开测量完毕，请把光度计的盖打开 ！5 每次实验时提交上一次的实验报告。每次实验时提交上一次的实验报告。注意事项注意事项生物化学与分子生物学基础实验实验报告实验报告n原始数据需老师签字，附在实验报告上。原始数据需老师签字，附在实验报告上。n真实记
22、录实验数据，以标准蛋白含量为真实记录实验数据，以标准蛋白含量为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并标出未知溶液的蛋白含量。标准曲线，并标出未知溶液的蛋白含量。可以进行各种软件绘图。可以进行各种软件绘图。n单位单位、标示标示要清楚要清楚生物化学与分子生物学基础实验微量移液枪使用注意事项微量移液枪使用注意事项n轻拿轻放，不能摔、砸。轻拿轻放，不能摔、砸。n严禁将量程调出标准使用范围。严禁将量程调出标准使用范围。n使用过程中携带有使用过程中携带有Tip头的移液枪不可以倒过来头的移液枪不可以倒过来(特别是特别是里面还有液体的时候里面还有液体的时候)，以防液体流入枪内，腐蚀部件。，以防液体流入枪内，腐蚀部件。n不用移液枪时不要一直拿在手里，应挂于枪架上。不用移液枪时不要一直拿在手里，应挂于枪架上。n每日实验结束后，应将移液枪量程调至最大，每日实验结束后，应将移液枪量程调至最大， 长期压长期压紧弹簧会影响准确度。紧弹簧会影响准确度。5ml 白色白色Tip头回收！废头回收！废Tip头放入废头放入废物烧杯中！污染问题！安全问题！物烧杯中！污染问题！安全问题！生物化学与分子生物学基础实验实验二实验二 葡聚糖凝胶柱层析葡聚糖凝胶柱层析 实验分两拨： 前两个实验台的同学下个星期来做实验； 后两个试验台的同学下下个星期做
