11人工模拟酶2hours

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1、第一节第一节 模拟酶的理论基础和策略模拟酶的理论基础和策略模拟酶的概念与理论基础、设计要点模拟酶的分类与制备第二节第二节 分子印迹技术分子印迹技术分子印迹技术的起源与概况分子印迹技术的起源与概况分子印迹技术的原理与特点分子印迹技术的原理与特点分子印迹聚合物合成材料与制备方法分子印迹聚合物合成材料与制备方法分子印迹技术的应用分子印迹技术的应用分子印迹技术存在问题与展望分子印迹技术存在问题与展望第三节第三节 生物分子印迹酶生物分子印迹酶所谓所谓模拟酶模拟酶就是利用就是利用有机化学的方法有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子合成一些比酶简单的非蛋白质分子，可以模拟酶对底物的络合和催化过程，可以

2、模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。服酶的不稳定性。一、模拟酶的概念、基础与设模拟酶的概念、基础与设计要点计要点第一节第一节 模拟酶的理论基础和策略模拟酶的理论基础和策略 模拟酶模拟酶是在是在分子水平上模分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征、酶及其微环境等结构特征、酶作用的机理和立体化学等特作用的机理和立体化学等特征的一门科学。征的一门科学。 分子水平上模拟生物功能分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。的一门边缘科学。酶的模拟工作可分为酶的模拟工作可分为3 3个层次：个层次：(

3、1)(1)合成有类似酶活性的简单络合物；合成有类似酶活性的简单络合物；(2)(2)酶活性中心模拟；酶活性中心模拟；(3)(3)整体模拟，即包括微环境在内的整个整体模拟，即包括微环境在内的整个酶活性部位的化学模拟。酶活性部位的化学模拟。 目前模拟酶的工作主要集中在第二层次。 E.G. E.G. 可以通过对某些天然或人工合可以通过对某些天然或人工合成的化合物引入某些活性基团，使其具成的化合物引入某些活性基团，使其具有酶的行为。有酶的行为。 构建模拟酶的酶模型分子：构建模拟酶的酶模型分子：环糊精环糊精、穴醚、卟林等。穴醚、卟林等。 1.酶的作用机制酶的作用机制：2. 过渡态理论过渡态理论2 2 主客

4、体化学：主客体化学： 主体和客体在主体和客体在结合部位结合部位的空间及电子排列的空间及电子排列的互补。配位键或其他次级键连接。的互补。配位键或其他次级键连接。模拟酶的理论基础模拟酶的理论基础设计要点设计要点设计前：了解酶的结构和酶学性质设计前：了解酶的结构和酶学性质酶活性中心酶活性中心- -底物复合物的结构底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式与能力酶的专一性及其同底物结合方式与能力反应的动力学及各中间物的知识反应的动力学及各中间物的知识 设计中：设计中：为底物提供良好的微环境为底物提供良好的微环境催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近功

5、能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性保持其催化活性二、二、 模拟酶的分类和制备模拟酶的分类和制备按照模拟酶的属性按照模拟酶的属性胶束酶模型、肽酶、抗体酶、分子印迹酶模型、胶束酶模型、肽酶、抗体酶、分子印迹酶模型、半合成酶半合成酶胶束酶模型Cyclodextrin 模型CD分子的修饰： 在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能 目前：桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用。A:将电荷中继系统的酰基酶催化部位引入将电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD第二面，第二

6、面，催化叔丁基苯基乙酸酯的水解。催化叔丁基苯基乙酸酯的水解。B:将咪唑基与环糊精相结合。咪唑在将咪唑基与环糊精相结合。咪唑在N上直接与上直接与 -CD的的3相连，催化硝基苯醋酸酯（相连，催化硝基苯醋酸酯（p-NPAc）水解。）水解。C:通过修饰底物增加底物与通过修饰底物增加底物与CD结合结合,从而增加与过渡从而增加与过渡态的结合。如设计二茂铁、金刚烷为结合位点的硝态的结合。如设计二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯酯，催化酯水解加速基苯酯，催化酯水解加速105-106倍。倍。第二节 分子印迹技术人们研究分子印迹技术的出发点之一是想人们研究分子印迹技术的出发点之一是想从合成的聚合物出发，构建人工酶模

7、型。从合成的聚合物出发，构建人工酶模型。为了产生酶的为了产生酶的活性中心模型活性中心模型，需要有一种，需要有一种方法，它能方法，它能产生和底物相应的形状产生和底物相应的形状，特别，特别是被催化的反应过渡互补的空穴。是被催化的反应过渡互补的空穴。这种技术能诱导功能基团以预先排列方式这种技术能诱导功能基团以预先排列方式的进入空穴。的进入空穴。分子印迹技术内容分子印迹技术内容选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应反应在印迹分子在印迹分子- -单体复合物周围发生聚合反应单体复合物周围发生聚合反应用抽提法从聚合物中除掉印迹分子用抽提法从聚合物中除掉印迹分子分子印

8、迹技术可以产生与底物特异性结合分子印迹技术可以产生与底物特异性结合部位，并将催化官能团以确定的排列引入部位，并将催化官能团以确定的排列引入结合部位，从而制备出催化活性聚合物。结合部位，从而制备出催化活性聚合物。一、分子印迹技术的起源与概况一、分子印迹技术的起源与概况1、分子印迹技术也叫分子膜板技术，最初分子印迹技术也叫分子膜板技术，最初出现于出现于2020世纪世纪4040年代的免疫学，当时年代的免疫学，当时PaulingPauling首次提出首次提出抗体形成学说抗体形成学说。 要点要点：抗体在形成时其三维结构尽：抗体在形成时其三维结构尽可能地同可能地同抗原形成多重作用位点抗原形成多重作用位点，

9、抗原，抗原作为一种模板就会作为一种模板就会“铸造铸造”在抗体的结在抗体的结合部位。为分子印迹奠定了基础。合部位。为分子印迹奠定了基础。 2 2、19721972年年WulffWulff G G研究小组首次研究小组首次成功制备出成功制备出分子印迹聚合物分子印迹聚合物（molecular inprinted polymers，MIPs）使这方面的研究产生了突破使这方面的研究产生了突破性进展。性进展。 3 3、8080年代，年代，非共价型膜板聚合物非共价型膜板聚合物的出现，的出现，19931993年年MosbachMosbach等人研究有关等人研究有关茶碱分子印迹聚合物茶碱分子印迹聚合物，使这一技术

10、有了新的发展，并由此使其成为化学使这一技术有了新的发展，并由此使其成为化学和生物交叉的新兴领域之一。和生物交叉的新兴领域之一。 目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国在内的美国、中国在内的1010多个国家、多个国家、100100个以上的学术个以上的学术机构和企事业单位在从事这一技术的研究与开发。机构和企事业单位在从事这一技术的研究与开发。 模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富挑战的课题。挑战的课题。分子印迹技术的原理分子印迹技术的原理 当当模板分子模板分子（印迹分子）与带有（印迹分子）与带有官能团的单官

11、能团的单体分子体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成接触时，会尽可能同单体官能团形成多重多重作用点作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来，待聚合后，这种作用就会被固定下来，当模板分子被除去后，当模板分子被除去后，聚合物聚合物中就形成了与模板中就形成了与模板分子在分子在空间上互补空间上互补的具有的具有多重作用位点的结合部多重作用位点的结合部位，位，这样的结合部位对模板分子可产生相互作用，这样的结合部位对模板分子可产生相互作用，因而对以此模板分子具有特异的结合能力。因而对以此模板分子具有特异的结合能力。二、分子印迹技术的原理与特点二、分子印迹技术的原理与特点 分子印迹：是制备对某一化合物具有选择

12、性的聚合物的过分子印迹：是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，这个化合物叫印迹分子。程，这个化合物叫印迹分子。 生物印迹类似于分子印迹，主体分子为生物分子。生物分生物印迹类似于分子印迹，主体分子为生物分子。生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消了，其构象被固定了，因子构象的柔性在无水有机相中被取消了，其构象被固定了，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化在移入无水有机相中才能得以保持。在移入无水有机相中才能得以保持。 生物印迹（生物印迹（bioprintingbioprinting）是以天然生物材料如蛋白质、）是以天

13、然生物材料如蛋白质、糖为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性糖为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。识别空腔的过程。 蛋白质分子有丰富的氨基酸残基，它们与印迹分子能产生蛋白质分子有丰富的氨基酸残基，它们与印迹分子能产生很好的识别作用，可用于制备生物印迹酶。很好的识别作用，可用于制备生物印迹酶。（一）定义（一）定义： 原理步骤：原理步骤： 分子印迹技术（分子印迹技术（MITMIT）是指为获得在空间、）是指为获得在空间、结构和结构和 结合位点上与某一分子（印迹分子）结合位点上与某一分子（印迹分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术。完全匹配的聚合物的实验制备

14、技术。 （1 1）在一定溶剂中，膜板分子）在一定溶剂中，膜板分子（Template Molecular，即印迹分子）与功，即印迹分子）与功能单体（能单体（Functional Monomer）依靠官能团）依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物之间的共价或非共价作用形成主客体配合物- -两者的互补反应两者的互补反应（2 2）加入交联剂（）加入交联剂（Cross linker），），通过引发剂通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在膜板分子周围形成高交联的通过自由基共聚合在膜板分子周围形成高交联的刚性聚合物。刚性聚合

15、物。-聚合反应聚合反应（3 3）将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。）将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在这样在聚合物中聚合物中便留下了与便留下了与模板分子大小和形状模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了，同时孔穴中包含了精确排列精确排列的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团。功能基团。这便赋予该聚合物特异的这便赋予该聚合物特异的“记忆记忆”功功能，即类似生物自然的识别系统。能，即类似生物自然的识别系统。 分子印迹聚合物原理图分子印迹聚合物原理图-功能单体功能单体分子印迹技术的特点分子印迹技术的特点（1

16、1）预定性（）预定性（predetermination）即它可以根据不同的目的制备不同的即它可以根据不同的目的制备不同的MIPsMIPs，以满足，以满足不同的需要。不同的需要。（2 2）识别性（）识别性（recognition）即即MIPsMIPs是按照膜板分子定做的，可专一地识别印迹是按照膜板分子定做的，可专一地识别印迹分子分子（3 3）实用性（）实用性（practicibility）即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体等相比拟。抗原与抗体等相比拟。 但由于它是由化学合成方法所制备的，因此又但由于它是由化学合成方法所制备的，因此又

17、具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。（二）分子印迹发展的基本趋向：（二）分子印迹发展的基本趋向： （1 1）预组装方式：）预组装方式： 印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，聚合后再打开共价键去除印迹分子。聚合后再打开共价键去除印迹分子。 印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，如印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，如硼硼酸酯酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯等，所采用的单、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯等，所采用的单体通常

18、是体通常是低分子的化合物低分子的化合物，此单体与印迹分子形成，此单体与印迹分子形成的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合后的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合后又能完全脱除。又能完全脱除。 特点：空间位置固定准确，能够移走大量的印迹分特点：空间位置固定准确，能够移走大量的印迹分子。但是，对携带适当结合基团的化合物选择性低。子。但是，对携带适当结合基团的化合物选择性低。（2 2）自组装方式：）自组装方式： 印迹分子与功能单体之间印迹分子与功能单体之间预先自组织排列预先自组织排列，以，以非非共价键共价键如如氢键作用氢键作用、静电作用静电作用、-作用、疏水作作用、疏水作用、金属用、金属-

19、-配体作用、电荷转移、范德华力等超分子配体作用、电荷转移、范德华力等超分子作用形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。作用形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。 非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。用的方法。由于非共价键法使用由于非共价键法使用超分子超分子作用制备仿生作用制备仿生模型，其分子识别机理类似于天然生物分子，因此是模型，其分子识别机理类似于天然生物分子，因此是分子印迹技术的研究热点，发展很快。分子印迹技术的研究热点，发展很快。 特点特点：非共价法的分子印迹系统具有多样性和普非共价法的分子印迹系统具有多样性和普遍性遍性,

20、, 可使用多种功能单体可使用多种功能单体, ,印迹分子可以用很简单印迹分子可以用很简单的方法除去的方法除去, ,但专一性不如共价结合作用但专一性不如共价结合作用. . （3 3）将共价作用与非共价作用相结合，）将共价作用与非共价作用相结合，应用于制备分子印迹聚合物（应用于制备分子印迹聚合物（MIPsMIPs） 在制备在制备MIPsMIPs及其后续过程中，一般来讲，及其后续过程中，一般来讲，使用单一的作用方式制得的使用单一的作用方式制得的MIPsMIPs的选择性较低，的选择性较低，因此大多使用多种作用相互结合来制备具有高因此大多使用多种作用相互结合来制备具有高选择性和分离能力的选择性和分离能力的

21、MIPsMIPs。 三、分子印迹聚合物合成材料与制备方法三、分子印迹聚合物合成材料与制备方法 1 1、膜板分子的选择、膜板分子的选择 聚合物几乎对膜板分子没有限制，碳水化聚合物几乎对膜板分子没有限制，碳水化合物、羧酸类、氨基酸、乃至金属离子均可合物、羧酸类、氨基酸、乃至金属离子均可被用于制备被用于制备MIPsMIPs。 一般地，分子中含有一般地，分子中含有强极性基团强极性基团的化合的化合物易于制备高效能的物易于制备高效能的MIPsMIPs，选用能与功能单，选用能与功能单体间形成氢键的化合物。体间形成氢键的化合物。 （一）材料的选择（一）材料的选择 2 2、溶剂的选择、溶剂的选择 溶剂对印迹分子

22、不但应具有较高的溶解度，溶剂对印迹分子不但应具有较高的溶解度，最好还能促进印迹分子与功能单体间的相互作最好还能促进印迹分子与功能单体间的相互作用，至少不干扰这种作用。所以必须根据用，至少不干扰这种作用。所以必须根据印迹印迹分子与功能单体间可能的作用力类型分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜选择适宜的溶剂。的溶剂。 极性溶剂会将低印迹分子与功能单体的结合，极性溶剂会将低印迹分子与功能单体的结合，干扰氢键的形成，生成的干扰氢键的形成，生成的MIPsMIPs选择性差。选择性差。 选择：笨、甲苯、氯仿、二氯甲烷等。选择：笨、甲苯、氯仿、二氯甲烷等。 丙酮、乙醇、甲醇等。丙酮、乙醇、甲醇等。 3 3

23、、功能单体的选择、功能单体的选择 制备共价键型印迹聚合物通常使用的功能单制备共价键型印迹聚合物通常使用的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛以及二醇等。因为体是含有乙烯基的硼酸、醛以及二醇等。因为硼酸和邻二醇基团硼酸和邻二醇基团形成的脂键可逆性好，易于形成的脂键可逆性好，易于形成和断裂。形成和断裂。 非共价型印迹聚合物最常用的功能单体是非共价型印迹聚合物最常用的功能单体是- -甲基丙烯酸甲基丙烯酸, ,其分子内除具有一个碳碳双键其分子内除具有一个碳碳双键外外, ,还具有一个羧基还具有一个羧基, ,可以以离子键与胺、羧基可以以离子键与胺、羧基化合物等发生作用，也可以以氢键与酰胺、氨化合物等发生作用，也

24、可以以氢键与酰胺、氨基甲酸酯和羧基化合物发生作用。基甲酸酯和羧基化合物发生作用。 另外采用天然分子如蛋白质制备另外采用天然分子如蛋白质制备MIPsMIPs称蛋白称蛋白质印迹技术（质印迹技术（molecular imprinting of proteins） 4 4、交联剂的选择、交联剂的选择 制备制备MIPsMIPs目前最常用的交联剂是目前最常用的交联剂是乙二醇二甲乙二醇二甲基丙烯脂基丙烯脂(EDMA),(EDMA),主要是因为其价格便宜主要是因为其价格便宜, ,容易纯容易纯化化, ,而且制备的分子印迹聚合物性质稳定。而且制备的分子印迹聚合物性质稳定。 除此之外，除此之外，N N，N N- -

25、亚甲基二丙烯酸胺、亚甲基二丙烯酸胺、3 3，5-5-二丙烯酰胺基苯甲酸、二乙烯苯、等也是常用二丙烯酰胺基苯甲酸、二乙烯苯、等也是常用的交联剂的交联剂。 （二）（二）MIPsMIPs制备的链引发方式和聚合方法制备的链引发方式和聚合方法 1.1.链引发方式链引发方式 MIPsMIPs制备过程中的聚合反应是通过自由基引制备过程中的聚合反应是通过自由基引发的，一般以发的，一般以偶氮二异丁腈（偶氮二异丁腈（AIBNAIBN）或偶氮二异或偶氮二异庚腈为引发剂。庚腈为引发剂。 常用的引发方式有光照、加热、加压、电合常用的引发方式有光照、加热、加压、电合成等。成等。 低温光引发应用最为普遍，其中又以紫外光低温

26、光引发应用最为普遍，其中又以紫外光的能量适中而应用最多。热引发也较为常见，但的能量适中而应用最多。热引发也较为常见，但此法对热不稳定的化合物不适用。此法对热不稳定的化合物不适用。 2.2.聚合方法聚合方法 聚合的方法有原位聚合、悬浮聚合、表面聚合的方法有原位聚合、悬浮聚合、表面印迹、膜制备技术以及封管聚合等多种。印迹、膜制备技术以及封管聚合等多种。 （1 1）原位聚合法）原位聚合法: : 原位聚合采用印迹分子原位聚合采用印迹分子, ,功能单体功能单体, ,交联剂及交联剂及致孔剂在致孔剂在柱内直接聚合成整体柱，柱内直接聚合成整体柱，这是较简便的这是较简便的方法。方法。 （2 2）悬浮聚合法：）悬

27、浮聚合法： Matsui Matsui将印迹分子及单体溶于氯仿将印迹分子及单体溶于氯仿, ,加入有加入有聚乙烯醇的水溶液聚乙烯醇的水溶液, ,用悬浮聚合的方法合成了球用悬浮聚合的方法合成了球形印迹聚合物。形印迹聚合物。 （3 3）表面印迹法：）表面印迹法： PrasadPrasad用对氨基苯甲酸用对氨基苯甲酸, ,二氯乙烷二氯乙烷, ,和和硅胶反应硅胶反应, ,在印记分子存在的条件下在印记分子存在的条件下, ,合成合成了硅胶表面键合印记固定相了硅胶表面键合印记固定相, ,用于进行药用于进行药物及血液样品的净化及物及血液样品的净化及-内酰氨抗生素内酰氨抗生素的富集。的富集。无机物为载体的表面印迹

28、无机物为载体的表面印迹固体材料的表面修饰固体材料的表面修饰蛋白质的表面印迹蛋白质的表面印迹 （4 4）封管聚合法：）封管聚合法： 将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定的比例溶解在惰性溶剂中一定的比例溶解在惰性溶剂中, ,然后移入一玻璃然后移入一玻璃安培瓶中安培瓶中, ,采用超声波脱气采用超声波脱气, ,通氮除氧通氮除氧, ,在真空下在真空下密封安培瓶密封安培瓶, ,经热引发或紫外光照射引发聚合一经热引发或紫外光照射引发聚合一段时间得到块状聚合物。经粉碎、研磨、筛选等段时间得到块状聚合物。经粉碎、研磨、筛选等过程获得适度大小的粒子过程获得适度大小的粒子

29、, ,洗脱除去膜板分子洗脱除去膜板分子, ,经经真空干燥后即成。真空干燥后即成。 该方法制备的该方法制备的MIPsMIPs具有满意的具有满意的“记忆能力记忆能力”, ,对印迹分子有良好的选择性和识别性，合成条件对印迹分子有良好的选择性和识别性，合成条件易于控制，但聚合物粒子均匀度差，制备率较低。易于控制，但聚合物粒子均匀度差，制备率较低。（三）（三） 分子印迹聚合物的特性分子印迹聚合物的特性评价指标评价指标 特性特性物理稳定性物理稳定性 抗机械作用、高温、高压抗机械作用、高温、高压化学稳定性化学稳定性 抗酸碱、有机溶剂、金属离子抗酸碱、有机溶剂、金属离子储存时间储存时间 8 8个月个月( (吸

30、附性能不变吸附性能不变) )吸附容量吸附容量 印记分子印记分子/ /聚合物聚合物=0.11 mg/g=0.11 mg/g对印记分子对印记分子 可重复使用可重复使用100100次以上且不丢失次以上且不丢失的记忆性的记忆性 吸附性能吸附性能四、分子印迹技术的应用四、分子印迹技术的应用（1 1）用于化学仿生传感器）用于化学仿生传感器（2 2）膜技术）膜技术（3 3）天然抗体模拟）天然抗体模拟（4 4）选择性催化剂）选择性催化剂（5 5）用于色谱固定相）用于色谱固定相（6 6）固相萃取剂）固相萃取剂（7 7）药物手性分离）药物手性分离（8 8）药物控制释放）药物控制释放（9 9）农残分析）农残分析化学

31、仿生传感器 化学或生物传感器是由分子识别元件和信号化学或生物传感器是由分子识别元件和信号转换器（如电极、光极、场效应晶体管、压电晶体、转换器（如电极、光极、场效应晶体管、压电晶体、热敏电阻等）所组成。近来，生物传感器技术的发热敏电阻等）所组成。近来，生物传感器技术的发展极为迅速。展极为迅速。 但是，用于生物传感器的生物分子却因为性但是，用于生物传感器的生物分子却因为性能不稳定易被破坏，且种类太少而不能满足实际应能不稳定易被破坏，且种类太少而不能满足实际应用的需要。用的需要。 由于分子印迹聚合物具有可设计性，种类极由于分子印迹聚合物具有可设计性，种类极其丰富，且坚固耐用，有很强的抗酸、碱能力，环

32、其丰富，且坚固耐用，有很强的抗酸、碱能力，环境适应性很强，故科学家们设法用境适应性很强，故科学家们设法用MIPSMIPS来替代生物来替代生物分子以适应生物传感器技术发展的要求分子以适应生物传感器技术发展的要求。 自分子印迹技术用于膜传感器以来，自分子印迹技术用于膜传感器以来，MIPsMIPs在生在生物传感器上的应用就一直是研究热点，尤其是近两物传感器上的应用就一直是研究热点，尤其是近两年来，该技术发展极为迅速，年来，该技术发展极为迅速，Malitesta,HauptMalitesta,Haupt, , Yano, Yano, AnselAnsel等人在这一方面都作了广泛的研究。等人在这一方面都

33、作了广泛的研究。 98 98年在波士顿召开的有关化学传感器的国际性年在波士顿召开的有关化学传感器的国际性会议会议, ,对对分子印迹技术在生物传感器分子印迹技术在生物传感器中的应用的现中的应用的现状和未来作了全面而系统的探讨，为分子印迹技术状和未来作了全面而系统的探讨，为分子印迹技术和传感器技术的发展开辟了新的道路。和传感器技术的发展开辟了新的道路。 将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，然将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，然后通过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号，后通过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号，可定量分析各种小分子有机化合物。可定量分析各种小分子有机化合物。 膜技术膜技

34、术 选择性运输和分离中性分子的模板聚合物选择性运输和分离中性分子的模板聚合物膜的制备技术。仿生膜的稳定性和机械强度明膜的制备技术。仿生膜的稳定性和机械强度明显优于生物膜。显优于生物膜。 天然抗体模拟天然抗体模拟 MIPsMIPs模拟天然抗体具有很大的优越性。不模拟天然抗体具有很大的优越性。不需实验动物和免疫技术，可耐酸、碱、高温、需实验动物和免疫技术，可耐酸、碱、高温、高压环境及有机溶剂，且可回收多次利用。高压环境及有机溶剂，且可回收多次利用。 MosbachMosbach等用等用MIPsMIPs代替抗体在代替抗体在RIARIA测定中检测测定中检测药物中的吗啡、茶碱等，取得了与单抗相似的药物中

35、的吗啡、茶碱等，取得了与单抗相似的交叉反应。交叉反应。 选择性催化剂选择性催化剂 因为分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性因为分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性中心，因此具有模拟酶催化作用。通过选用适当中心，因此具有模拟酶催化作用。通过选用适当的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结合的结合位点和起催化作用的活性基团，这些基合的结合位点和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定排列。模板聚合物团以最佳取向在空间进行确定排列。模板聚合物作催化剂时，许多情况下与用酶作催化剂相似，作催化剂时，许多情况下与用酶作催化剂相似，符合米氏方程动力学。符

36、合米氏方程动力学。 用于色谱固定相用于色谱固定相 MIPsMIPs最广泛的研究领域之一是利用它的特异最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物识别性去分离混合物。 无论是小分子（氨基酸、药品和碳氢化合物）无论是小分子（氨基酸、药品和碳氢化合物），还是大分子（如蛋白质），都已经被用于各种，还是大分子（如蛋白质），都已经被用于各种印迹技术中，并用于印迹技术中，并用于HPLCHPLC、TLCTLC和和CECE分离中。分离中。 分子印迹聚合物作为色谱固定相广泛应用于分子印迹聚合物作为色谱固定相广泛应用于拆分外消旋体。此外在非手性分子的识别分离方拆分外消旋体。此外在非手性分子的识别分离方面也有

37、了新的进展。面也有了新的进展。 药物手性分离药物手性分离 随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的有效成分往往具有不同的手性性质，尽管药物的有效成分往往具有不同的手性性质，尽管分子式相同，但其药效不同，甚至相反。分子式相同，但其药效不同，甚至相反。结构相结构相似的化合物的分离，尤其是药物的手性拆分是似的化合物的分离，尤其是药物的手性拆分是当当前分子印迹技术研究中最为活跃的部分前分子印迹技术研究中最为活跃的部分，因为拆，因为拆分合成药物一直是制药工业中的一大难题。分合成药物一直是制药工业中的一大难题。目前目前MIPsMIPs应用最多的领域是亲和分离。应用

38、最多的领域是亲和分离。 分子印迹聚合物能够识别分子结构上极其细分子印迹聚合物能够识别分子结构上极其细微的差别，在分离异构体上有其独到之处，可用微的差别，在分离异构体上有其独到之处，可用于除去含量很少的对映体异构物，且具有可设计于除去含量很少的对映体异构物，且具有可设计性，适用范围广，成为最有前途的分离手段。性，适用范围广，成为最有前途的分离手段。E.g. 南开大学何锡文等利用分子印南开大学何锡文等利用分子印迹法对迹法对药物扑热息痛、头孢氨苄、药物扑热息痛、头孢氨苄、氟哌酸等分子印迹聚合物的合成和氟哌酸等分子印迹聚合物的合成和结合选择性结合选择性进行了报道；有人研究进行了报道；有人研究利用分子印

39、迹技术对麻黄碱、水杨利用分子印迹技术对麻黄碱、水杨酸、氧氟沙星等药物的分离效果作酸、氧氟沙星等药物的分离效果作了系列研究，取得了较大进展。了系列研究，取得了较大进展。 药物控制释放药物控制释放 印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质的物质, ,可以被用来作为一种反应性控制释放载体。可以被用来作为一种反应性控制释放载体。 研究者提出了药物控制释放机理研究者提出了药物控制释放机理, ,以某种印迹分以某种印迹分子为模板制得的印迹高聚物子为模板制得的印迹高聚物载着一定量载着一定量的与该种印的与该种印迹分子结构相似的药物分子迹分子结构相似的药物分子, ,这

40、种聚合物在该印迹分这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。 可以想象可以想象, ,这种吸附有药物分子的高聚物进入这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后人体后, ,如果人体内存有该种印迹分子如果人体内存有该种印迹分子, ,则其会同药则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附物分子对高聚物产生竞争性吸附, ,从而导致药物分子从而导致药物分子的逐步释放。当然，该高聚物应是可体内降解的。的逐步释放。当然，该高聚物应是可体内降解的。 在生物样品分析上的应用在生物样品分析上的应用: : 生物样品中某种成分的测定在疾病诊断生物样品中某种成分的测定在疾病诊断,

41、 ,药物药物动力学分析动力学分析, ,法医学法医学, ,动物食品检验等领域得到广动物食品检验等领域得到广泛的应用。泛的应用。 在生物样品分析中在生物样品分析中, ,许多许多内源性的物质内源性的物质的存在的存在使得样品的净化成为不可缺少步骤。而分子印记使得样品的净化成为不可缺少步骤。而分子印记固相提取显示了巨大的优越性。固相提取显示了巨大的优越性。 Sellergren采用分子印记固定相选择性采用分子印记固定相选择性地富集地富集尿样中的喷他脒尿样中的喷他脒, ,用用pHpH为为9 9的流动相除去尿样中的的流动相除去尿样中的碱性化合物碱性化合物, ,然后以然后以pHpH为为3 3的流动相洗脱待测的

42、流动相洗脱待测物物, ,直接进行紫外定量检测直接进行紫外定量检测. .痕量物质的富集痕量物质的富集 人们早就认识到，模板分子难以人们早就认识到，模板分子难以100%100%的从的从MIPsMIPs上洗脱掉，一般总留有少量的残余物上洗脱掉，一般总留有少量的残余物( (约约5%)5%)。 过去，人们认为这些残余物深陷于聚合物网过去，人们认为这些残余物深陷于聚合物网络之中而无法去除，但最近的一些研究工作表明络之中而无法去除，但最近的一些研究工作表明事实并非如此，这些经多次反复洗脱而没有除去事实并非如此，这些经多次反复洗脱而没有除去的模板分子会慢慢地从的模板分子会慢慢地从MIPsMIPs上上“泄漏泄漏

43、”掉掉. . 利用这一性质，将利用这一性质，将MIPSMIPS用作固相萃取剂去用作固相萃取剂去富富集低浓度的分析物质集低浓度的分析物质会起到惊人的效果。会起到惊人的效果。AndersonAnderson等采用这一方法富集人体血浆中的等采用这一方法富集人体血浆中的SameridineSameridine药物达到了很好的效果。药物达到了很好的效果。 在分析研究中，毫摩尔水平以下的痕量物质，在分析研究中，毫摩尔水平以下的痕量物质，经这一方法预富集处理后，便可以在气相色谱上经这一方法预富集处理后，便可以在气相色谱上很容易地检测出来很容易地检测出来. .分子印迹固相提取在环境样品分析中应用分子印迹固相提

44、取在环境样品分析中应用 一些极性强的农药在疏水性的一些极性强的农药在疏水性的C18C18键键合固定相上不能与极性干扰物分离合固定相上不能与极性干扰物分离, ,此时此时分子印记固定相就能够将干扰物与待测分子印记固定相就能够将干扰物与待测物分开。物分开。 科研工作者使用科研工作者使用五羟黄酮印迹聚合物五羟黄酮印迹聚合物提取银杏叶中药用黄酮提取银杏叶中药用黄酮, ,在仔细选择净化在仔细选择净化剂后剂后, ,干扰剂可以被除去干扰剂可以被除去, ,提供了提取银提供了提取银杏叶中药用黄酮的可能性杏叶中药用黄酮的可能性五、分子印迹技术存在的问题五、分子印迹技术存在的问题 首先，首先，分子印迹过程和分子识别过

45、程的机理和分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题、结合位点的作用机理、聚合物的形态和表征问题、结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理仍然是研究者们所关注的问题。传质机理仍然是研究者们所关注的问题。 如何从分子水平上更好的理解分子印迹过程和如何从分子水平上更好的理解分子印迹过程和识别过程？识别过程？ 第二，第二，目前使用的功能单体、交联剂、和聚合目前使用的功能单体、交联剂、和聚合方法都有较大的局限性。方法都有较大的局限性。 功能单体种类太少，不能满足某些分子识别的功能单体种类太少，不能满足某些分子识别的要求，因此分子印迹技术远远不能满足实际应用需要求，因此分子印迹技术远远不能满足实际应用

46、需求。求。 第三，第三，目前分子印迹聚合物大多只能在目前分子印迹聚合物大多只能在有机有机相相中进行聚合和应用，而中进行聚合和应用，而天然的分子识别系统大天然的分子识别系统大多是在水溶液中进行的，多是在水溶液中进行的，如何在水溶液或极性溶如何在水溶液或极性溶剂中进行分子印迹和识别仍是一大难题。剂中进行分子印迹和识别仍是一大难题。 第四，目前能用于分子印迹的大多是像目前能用于分子印迹的大多是像药物、药物、氨基酸和农药这样的小分子氨基酸和农药这样的小分子，而像多肽、酶和蛋，而像多肽、酶和蛋白质这样的大分子虽有报道白质这样的大分子虽有报道, ,但并不多见。但并不多见。 综上所诉，分子印迹作为一种新兴的

47、化学分综上所诉，分子印迹作为一种新兴的化学分析技术，已经引起普遍关注，我们相信随着生物析技术，已经引起普遍关注，我们相信随着生物技术、电子技术、合成手段和现代分析检测手段技术、电子技术、合成手段和现代分析检测手段的迅猛发展，的迅猛发展，MIPsMIPs的合成、表征方法和理论系统的合成、表征方法和理论系统将日臻完善，其应用范围将更加广泛。将日臻完善，其应用范围将更加广泛。第三节第三节 生物分子印迹酶生物分子印迹酶 生物印迹是指以天然生物材料生物印迹是指以天然生物材料(如蛋白如蛋白质、糖类质、糖类)为骨架，在其上进行分子印迹为骨架，在其上进行分子印迹而产生印迹分子具有特异性识别空腔的过而产生印迹分

48、子具有特异性识别空腔的过程。程。 由于天然生物材料蛋白质含有丰富的氨由于天然生物材料蛋白质含有丰富的氨基酸残基侧链基团，它们与模板分子会有基酸残基侧链基团，它们与模板分子会有很好的识别作用。很好的识别作用。 用这种方法制备的印用这种方法制备的印迹酶就称为生物印迹酶。迹酶就称为生物印迹酶。通过分子印迹技术可以产生类似于酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。向排列。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖性质：遵

49、循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。反应速度常数。印迹分子：底物、底物类似物、酶抑印迹分子：底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物、产物等。制剂、过渡态类似物、产物等。 生物印迹酶的制备过程生物印迹酶的制备过程： 使蛋白质变性，扰乱其天然构象，使其构象使蛋白质变性，扰乱其天然构象，使其构象柔曲更具有可塑性；柔曲更具有可塑性； 加入模板分子，使模板分子与部分变性蛋白加入模板分子，使模板分子与部分变性蛋白质充分混合；质充分混合； 待模板分子与蛋白质相互作用后，用交联剂待模板分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联蛋白质，固定其与模板分子相结合的构象；交联蛋白质，固定其与模板分子相结合的构象； 经透

50、析或其他方法除去模板分子，产生具有经透析或其他方法除去模板分子，产生具有新的活性中心的蛋白质空穴。新的活性中心的蛋白质空穴。 模板分子通常是某种酶的抑制剂、底物类似物模板分子通常是某种酶的抑制剂、底物类似物或过渡态类似物或过渡态类似物。分子印迹酶的制备的优点：分子印迹酶的制备的优点： 1. 1.制备过程简单、易操作；制备过程简单、易操作； 2.2.印迹分子选择范围广；印迹分子选择范围广； 3.3.具有明显的耐热、耐酸碱和稳定性好具有明显的耐热、耐酸碱和稳定性好 目前，生物印迹酶处于初级阶段，印迹酶的类目前，生物印迹酶处于初级阶段，印迹酶的类型进一步研究。型进一步研究。 * * 印迹分子的结构与印迹的活性中心结构关系印迹分子的结构与印迹的活性中心结构关系 * * 印迹分子结构与酶活性的关系印迹分子结构与酶活性的关系 * * 寻找印迹酶高活性的理论基础寻找印迹酶高活性的理论基础印迹技术与酶的作用机制、酶的结构知识、酶动力印迹技术与酶的作用机制、酶的结构知识、酶动力学等联系起来，创造出高效率的人工酶。学等联系起来，创造出高效率的人工酶。印迹酶研究前景印迹酶研究前景