DNA复制与损伤实用教案

《DNA复制与损伤实用教案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA复制与损伤实用教案（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记(bioj)几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。 一、DNA复制(fzh)的半保留性(Semiconservative replication) 第1页/共40页第一页，共41页。二、DNA的半不连续(linx)复制DNA synthesis is semidiscontinuous第2页/共40页第二页，共41页。（一） 起点(qdin)（原点origin）三、复制的起点、方向（即顺序(shnx)性及复制单位）replicationorigin&direction第3页/共40页第三页，共41页。许多实验(shyn)证

2、明，DNA的复制是由固定的起始点开始的。E.coli染色体复制(fzh)原点oriC成串排列3个13bp重复(chngf)序列(GATCTNTTNTTTT)反向重复出现4个9bp序列(TTATCCACA)第4页/共40页第四页，共41页。复制子（replicon）一般把生物体的独立(dl)复制单位称为复制子。一个(y)复制子只含有一个(y)复制起点。即能启动DNA复制(fzh)开始的基因组上的DNA顺序，包括复制(fzh)原点和引发复制(fzh)的结构基因，以及在其控制下的DNA区段统称为复制(fzh)子。第5页/共40页第五页，共41页。5OHTCApppOHCTCAC5OH3+ppi（二）

3、子链DNA延伸(ynshn)方向 新链合成只能(zh nn)从5 到 3 方向第6页/共40页第六页，共41页。不同(btn)细胞的复制参数原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内复制子的数目（个）1（1）多个（103104）复制子平均长度（kb）39106约105106复制方向多为双向多为双向复制速度(bp/s/复制叉)等速（850）等速（6090）第7页/共40页第七页，共41页。32DNA复制酶和相关(xinggun)蛋白一、DNA聚合酶DNA Polymerase特点：1.以4种dNTP为底物；2.反应需要接受模板指导；3.反应需要有3-OH存在；4.DNA链的合成方向为5 3 ；5.

4、产物DNA的性质与模板相同。第8页/共40页第八页，共41页。第9页/共40页第九页，共41页。(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一种(y zhn)多功能酶。包括：5 3 聚合酶活性。3 5 核酸外切酶活性。5 3 核酸外切酶活性。从3端将DNA链水解(shuji)， DNA的校对（proofreading）功能。从5端将DNA链水解，DNA的修复(xif)功能。将dNTP加到DNA链的3-OH上，DNA的聚合功能。第10页/共40页第十页，共41页。第11页/共40页第十一页，共41页。klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小(y xio)两个片段。较大的C

5、末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，具有53的聚合酶活性和35的外切酶活性，常用做体外合成DNA的工具酶。切口平移：DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性从5端切除DNA受损伤(snshng)的部位，DNA聚合酶I的53聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3端延伸，这称为切口平移（nick translation）。 在DNA复制(fzh)中，RNA引物的切除；DNA的损伤修复；在体外，制备高放射性活性的DNA探针。第12页/共40页第十二页，共41页。(二)DNA聚合酶 多亚基不对称(duchn)二聚体结构(10种亚基) 1.亚基、亚基和亚基相连组成(z chn)核心酶（core en

6、zyme） 亚基具有(jyu)53的聚合酶活性.亚基具有35的外切酶活性. 亚基可能起组建的作用.第13页/共40页第十三页，共41页。2.DNA聚合酶具有持续(chx)合成能力.亚基的功能犹如夹子(ji zi):提高了酶的持续合成能力. 夹子装置(zhungzh)器（clamp loader）:两个亚基与另4个亚基（亚基、亚基、亚基、亚基）构成复合物，其主要功能时帮助亚基夹住DNA，故称夹子装置(zhungzh)器。 亚基是一种依赖于DNA的ATP酶 亚基起促使核心酶二聚化的作用 第14页/共40页第十四页，共41页。二、DNA旋转(xunzhun)酶(DNA Gyrase)DNA旋转酶每作

7、用一次产生两个负超螺旋,可去除解螺旋产生的扭曲张力.并依赖于亚基催化ATP水解(shuji),以使酶构象复原.DNA旋转酶的抑制(yzh)剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制(yzh)细菌的合成.第15页/共40页第十五页，共41页。三、DNA解旋酶(DNA Helicase)和单链结合(jih)蛋白(Single-strand DNA binding protein, SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类(y li)酶的总称。 防止核酸(h sun)水解酶的作用 避免解开的单链DNA重新缔合形成双链 对单链DN

8、A有很高的亲和性 它们与DNA结合时有协同作用 2.单链结合蛋白（ SSB ）：第16页/共40页第十六页，共41页。RNA 聚合酶 Rif S 完成(wn chng)对先导链引物的合成 实现DNA复制的转录激活(j hu)起始引发酶 Rif R 完成(wn chng)对后随链引物的合成 较先导链的启动落后一个Okazaki片断完成10 NtRNA引物合成后. DNApolII进行DNA链的延伸四、引发酶(Primerase)第17页/共40页第十七页，共41页。酶- AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5磷酰基团，以焦磷酸的形式活化(huhu)，形成AMP-P-DNA。 五、连接酶

9、(Ligase)DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口(qi ku)的3-OH与5- P酰基形成磷酸酯键。 酶的活化(huhu)通过相邻DNA的3-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3，5-磷酸二酯键，同时释放出AMP。 催化过程： 腺苷酰化DNA亲核攻击完成DNA连接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），与酶活性中心的赖氨酸残基的-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶- AMP； 。 第18页/共40页第十八页，共41页。33DNA的复制(fzh)过程一、E.coli的DNA复制(fzh)（环型双股DNA，双向方式）分为三个阶段：起始、延伸(ynshn)和终止复制体（Replisom

10、e）：在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。DNA复制的阶段表现在于复制体结构的变化。第19页/共40页第十九页，共41页。第20页/共40页第二十页，共41页。2.复制(fzh)的终止1.环行E.coli染色体上的两个复制叉相遇(xin y)在排列有许多重复拷贝Ter序列（长约22bp）的一个终止区域（terminus），并停止复制。 2.称为Tus (terminus utilizatlcon substance，终点利用物质）的蛋白质的结合(jih)于Ter序列 ，Tus_Ter复合物只能够阻止一个方向的复制叉。 3.E.c

11、oli分开连锁体需要拓扑异构酶（属于类型topo酶）参与作用。分开两闭合环。 第21页/共40页第二十一页，共41页。二、滚环复制(fzh)（rolling circle replication）X174的基因组DNA是单链环型DNA，复制中首先合成其互补(h b)链（而非其自身），形成复制型（replication form, RF），然后进行滚环型（roolling circle）复制。滚环复制是在一条断裂的亲本链的3_OH上不断地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价(n ji)延伸（ covalence elongation ）。 第22页/共40页第二十二页，共41页。三、D环复制(fz

12、h)（displacement replication）线粒体DNA的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单向(dn xin)不对称的特殊复制方式,称为环复制。复制从重链（链）的原点开始，新合成的链置换原来链，游离的单链称为(chn wi)取代链（displacement）或环。 当链合成进行到约2/3时，轻链（链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与链的相反。 第23页/共40页第二十三页，共41页。四、真核生物复制(fzh)特点（一）真核生物DNA复制(fzh)与原核生物DNA复制(fzh)的相同点。（二）真核生物(shngw)DNA复制与原核生物(shngw)DNA复制的不同点：真核

13、DNA有多个复制原点；2真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。 3真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。 4真核生物有多种聚合酶。 第24页/共40页第二十四页，共41页。从哺乳动物(brdngw)中分出种DNA pol酶。分别为pol、。 Pol（4亚基）：有引物合成(hchng)酶活性。具有合成(hchng)RNA后45dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。 Pol（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有35核酸外切酶活性（具有校正(jiozhng)功能），完成前导链DNA复制。 Po

14、l（1亚基）：相当于E.coli的pol，是一种修复酶，具有3 5核酸外切酶活性。 Pol（1亚基）：与损伤修复有关。 Pol（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（35外切酶） 第25页/共40页第二十五页，共41页。五、真核生物(shngw)端粒的复制第26页/共40页第二十六页，共41页。端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端 5TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3(richGchain)3AACCCCAACCCCAACCCC5(richCchain)G链T2G4TTGGGGTTGGGC链A2C4telomerase3aaaAACCCCAACuua

15、c5端粒酶(tolomerase)的催化(cu hu)过程第27页/共40页第二十七页，共41页。七、DNA复制(fzh)的忠实性1.DNA复制是按碱基互补配对的原则(yunz)进行的。 2.DNA聚合酶本身(bnshn)具有校正功能。 5.DNA的错配校正和修复系统保证DNA复制的忠实性。3. RNA引物的存在与清除有利于降低错配率。 4. DNA聚合酶催化的反应机制，即DNA聚合酶仅催化53方向的反应。 第28页/共40页第二十八页，共41页。34DNA的损伤(snshng)及修复一、DNA的损伤(snshng)DNA的损伤是指正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些(mu xi)物理、化

16、学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。（P221）（一）物理因素 如电离辐射：使链的断裂、碱基及五碳糖的损伤。紫外照射（254nm）：使DNA分子的相邻的2个T形成二聚体（环丁基二聚体）；（二）化学因素 1.烷基化 2.亚硝基 3.碱基类似物 4.吖啶类分子，如EB 第29页/共40页第二十九页，共41页。（三）自发性损伤(snshng) 1. 脱嘌呤(piolng)和脱嘧啶(AP位点的产生)2. 碱基的脱氨基(nj)作用3. 碱基的互变异构4. 细胞正常代谢产物对DNA的损伤第30页/共40页第三十页，共41页。二、DNA的损伤(snshng)修复（

17、一）错配修复1. 模板(mbn)区分机制催化(cu hu)酶：Dam甲基化酶 发生时制：DNA复制后的一段时间内（约几秒或几分钟） 发生部位：GATC中腺嘌呤N 6的位置均可以发生甲基化 。第31页/共40页第三十一页，共41页。2. 修复(xif)位点的识别 MutS结合(jih)在错配位点， MutH结合(jih)于GATC顺序； MutL可以与MutS形成复合物，并与MutH结合， 在错配碱基两边的DNA链沿着复合物的移动是等速， 穿过MutLMutS复合物产生一个DNA环，直到复合物碰上甲基化的GATC顺序。 MutH催化切断GATC顺序G碱基5一边的未甲基化链，给该修复的链作上记号。

18、 第32页/共40页第三十二页，共41页。3. 修复的切割(qig)与聚合 (1) 当错配点在切点(qidin)5端时，去甲基化以35方向降解（从切点(qidin)错配点）。 这个(zh ge)过程要有： DNA解螺旋酶、 SSB、 外切酶或（由35方向降解）、 DNA聚合酶、 DNA连接酶。 (2) 错配点在切点3端一边时，修复途径类似。 外切酶（53或35方向降解）、 或RecJ蛋白（53方向降解单链DNA ）。 第33页/共40页第三十三页，共41页。（二）切除(qich)修复（excisionrepair）1. 碱基切割(qig)修复（base excision repair）（1）由

19、细胞内一类特异(ty)的DNA糖苷酶（glycosylase）识别DNA中不正常的碱基，并将其水解下来，形成AP位点。 （2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。（不同AP核酸内切酶的作用方式不同，或是在5侧切开，或是在3侧切开）。 （3）核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。 （4）DNA聚合酶兼有外切酶活性，并使DNA链3端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。 第34页/共40页第三十四页，共41页。AP位点的产生(chnshng)第35页/共40页第三十五页，共41页。2.核苷酸切除(qich)修复（nucleotide-excision repair） 切除酶（excin

20、uclease）也是一种核酸(h sun)内切酶，但与一般的核酸(h sun)内切酶不同，在链的损伤两侧同时切开。编码此酶的基因是Uvr基因。 大肠杆菌中ABC切除(qich)酶催化过程： UvrA和UvrB复合物（A2B）寻找并结合到损伤部位。UvrA离解，UvrB与DNA牢固结合。 UvrC蛋白结合到UvrB，UvrB切开损伤部位3端第5个磷酸二酯键，UvrC切开5侧第8个磷酸二酯键。 UvrD解螺旋酶帮助除去。 空缺由DNA聚合酶和连接酶填补。 第36页/共40页第三十六页，共41页。（三）直接(zhji)修复（directrepair）直接修复是指不需要移去任何(rnh)碱基或核苷酸就

21、可以将损伤逆转到正常状态的修复机制。（P229）1. 光复活修复(xif)（potoreactivation repair） 2. O6甲基鸟嘌呤的修复 光复活(photoreactivation)是在可见光(300600nm)的活化之下，光复活酶(photoreactivating enzyme，PR)，或称光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧啶二聚体分解成为单体的过程。 光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。 在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使GC对变为GT，易突变为AT对。 O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6methylguanineDNA methytran

22、sferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。 甲基转移酶因此而失活。 第37页/共40页第三十七页，共41页。（四）重组(zhnz)修复（recombinationrepair）1.复制酶系在损伤部位无法通过碱基配对合成子代DNA链，它就跳过损伤部位，在下一个(y )碱基相应位置处重新合成引物和DNA链，结果子代链在损伤相对应处留下缺口。 2.遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段(pin dun)移至子链缺口，然后用再合成的序列补上母链的空缺。 3.在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。 4.实际上消除了损伤的影响。

23、 第38页/共40页第三十八页，共41页。（四）应急(yngj)反应（SOS）和易错修复（errorpronerepair）应急反应（SOS）：许多(xdu)能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。 SOS反应诱导的修复系统包括避免(bmin)差错的修复（error free repair）和易产生差错的修复（error prone repair）两类。 SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶。 SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的 DNA聚合酶、，它们不具有3核苷酸外切酶校正功能。 第39页/共40页第三十九页，共41页。感谢您的欣赏(xnshng)！第40页/共40页第四十页，共41页。内容(nirng)总结1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。一个复制子只含有(hn yu)一个复制起点。1. 脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点的产生)。发生部位：GATC中腺嘌呤N 6的位置均可以发生甲基化。穿过MutLMutS复合物产生一个DNA环，直到复合物碰上甲基化的GATC顺序。（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。编码此酶的基因是Uvr基因。感谢您的欣赏第四十一页，共41页。