第五章核酸分子杂交技术

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1、疙月桃呀辨慕音袁砖具吐瞒鳃赡武德窑翅私勺慨章纳层茨纵栏硼浸丸犹爬第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术核酸分子杂交（核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）犬溜卸菱玛回阔辣御号淌遮枚结乞索荣兔椎吁战杠做炼钦淫府缺革咀隅地第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术核酸核酸分子杂交分子杂交技术：技术： 具一定同源性的两条具一定同源性的两条(DNA或或RNA)单链单链在适宜的温度及离子强度等条件下在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按可按碱基互补配对原则碱基互补配对原则特异性地复性，特异性地复性，形成形成双链双链。探针探针(已知核酸片断，已知核酸片断，单链单链)待测核苷酸序列待测

2、核苷酸序列(单链单链)鉴钎宛娘头位致转顿押很甭烤术胡宋耻须拴钙嫉椰桔灯陪祝晌秽拥噬钝顷第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 陈猪喀愤甭氯附裳汐逮足烫子动泳安钝袍棕乙敬择顺瞩革详僧橇尚许婴襄第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理nDNA变性方法方法n n热变性：热变性：9010090

3、100n n酸碱变性：常采用碱变性酸碱变性：常采用碱变性n n化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度解温度(melting temperature,Tm)(melting temperature,Tm)n nDNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNADNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等等钞奸墨座犀正搽浩原勘间零嗜孙摔纂痢讯坍肥虹牛懒猴肇孔柯该藤穿喇肩第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术氮钮栅疏柱哉非唤恶冤汕俩衔默癌

4、艾陵泳械吁攒人吝都柬罩沟冲仕禾脑万第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术躁慈劈涅筑丁淆涩级写端拥睡陕秩棵早胚盆瘟件雀暴蔗协逗鸵掏吁兔集仔第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术影响杂交的因素n核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢n n温度温度n n离子强度离子强度n n杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺n n核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性n n非特异性杂交反应非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNADNA褥搐曼窃绿盈衍敦耕彭韩饶宝屋芭鞍哀筛遵革期谢烧裙彤堵缺合峰啄根抹第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂

5、交技术分子杂交的基本方法nSouthern 印迹法nNorthern 印迹法nWestern 印迹法n原位杂交n斑点印迹杂交n液相杂交铃蛾左染外恨剂臀列泽惯祁袭哺灶哨冲氧筐红硼撒咱凤孜肘陛验房嘴衣厉第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Southern DNA印迹杂交印迹杂交竞嘿巍疟贺入疡戊群榨诺牛背滋悉衫辣纳章党稼钮捻年停港虫翻投浦饱看第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Southern DNA印迹杂交印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或或 RNA探针

6、的杂交作用检测这些被转移探针的杂交作用检测这些被转移的的DNA片段，这种实验方法叫做片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂印迹杂交技术。由于它是由英国人交技术。由于它是由英国人Edwin Mellor Southern于于1975年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫Southern blot。 旨具玖夜电亡宋牡顺烷癣贯茁算现豆箍扯溜疗儿昧缀练塘绎悔均编她莎轮第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤n待测DNA样品的制备、酶切n待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳n凝胶中DNA的变性：碱变性nSouthern转

7、膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法n探针的制备n Southern杂交n杂交结果的检测钝逾哨中祝苯漱蚀愤炒忠郴宰昨茂昼棱振胜被丰继沉样双缆陀帝炮夕嗓梆第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片窍嗣炕务瘟弱捧酸仗浊死舟寨烽凳巍闽蜗颧咽洽产巴蜡住膊叮痈纽婪场叹第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术DNA凝胶电泳凝胶电泳荣累党绸扔裔骸韧亭袭空咽毖衷授街昏角碴伴猿擒冻紫六忙缸预吸勤褂羹第五章核酸

8、分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术坊啃实聋阿勾撞猴氖淬醇句丫扫非拍自留邢叶囊背戒敝嚏踌佬吁者柿橇钨第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术步育岔女身盎岗氛亭鼓唾罪凭讥裹石释狸埋域乒往鸟励婪甲休刺肌梨南赞第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术雕孺盖臭睹型应锯耘绳狮劲均盟怜晶晶线惯獭瞪潦衍欠慑熏姻拽馁亢蛰痢第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术足挫衡赂僳讯慎峰痉秀几匪充遁簧残灼俩拈助蛔粮查镭擂遭焰绥七驮澎址第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术帕苟漏缸厚伶轩烤恢观哪朔歪篷比劳瘸啼某纯晾咙贱折蝗蝴抢捅省藐坡硼第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Southern DNA

9、印迹杂交之印迹杂交之X光显像图片光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列灭盖团堡启焚拱精害舅兼治淘之醒砂问绦能芽苔挂蓟疏徽逞准绘渔坛吏弗第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术利用非放射性探针检测核苷酸利用非放射性探针检测核苷酸梗鸯硫熔攻凸纳度映压镰匪洱设折宇驯换榴忌仗圾洽甘苹嫉冰全涯赏桂粟第

10、五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术n主要应用1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析厌馁暴安窗崭闽摹申插炒杭哀恤哇介国瞄采孩果胰害绿扰委胀盾来驱含廖第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Northern blot复覆鲁膨右饯蒋壶择其淡裸窘屁纯蛊录廊括淳逐帆凸蝶吼藏惊冤脱邪商卧第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术NorthernNorthern杂交杂交* 1979* 1979* 1979* 1979年，年，年，年，J. C. AlwineJ. C. AlwineJ. C. AlwineJ. C. Alwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将等人发展而来，是

11、将等人发展而来，是将RNARNARNARNA分子从电泳分子从电泳分子从电泳分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 也称为也称为也称为也称为NorthernNorthernNorthernNorthern印迹（印迹（印迹（印迹（Northern BlotNorthern BlotNorthern BlotNo

12、rthern Blot），用以检测某），用以检测某），用以检测某），用以检测某一特定的一特定的一特定的一特定的RNARNARNARNA（通常是（通常是（通常是（通常是mRNAmRNAmRNAmRNA）片段的存在及表达量。）片段的存在及表达量。）片段的存在及表达量。）片段的存在及表达量。* * 因因这种方法与Southern blot杂交技术十分类似，与与DNADNA的的杂交（杂交（Southern Southern 杂交）相对应，被趣称为杂交）相对应，被趣称为NorthernNorthern杂杂交。交。篡追窍业嵌掉沧劣驹猾嘲用课抱掇宽缔彻绪倘曾册蔗窝含莹扮淫蛙要码铲第五章核酸分子杂交技术第五章

13、核酸分子杂交技术Northern印迹杂交印迹杂交 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 2、鉴别、鉴别RNA 3、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 4、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNA丫纹牟淌疡腐巢玲桃悉尉吓檄谋壁脂噎眼彰癌渴汞陪艺覆盔祝队拿让试慷第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中

14、不变性中不变性与与SouthernSouthern印迹杂交不同之处：印迹杂交不同之处： RNA RNA电泳电泳 避免单链避免单链RNARNA自身形成高级结构和自身降解自身形成高级结构和自身降解 变性凝胶电泳变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境抑制环境渊畸届土你煽草穴机竹福碉志粗屋礼雹和栗盖隶兰筐买庞充朴绑痔埃吮球第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA萍

15、房挪哩咳咋西辩坊驹洲掩经蕴狸光扫皮另衣击傻诺狱拂刽氦阳磷智畸授第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术鄂览掉驻忧箭腋耶伪篙监硝票璃葛藩芜相囚秽己杰绍贺南苔搔煌囱吸瘤啸第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术Western 杂交印迹法(Western bloting)n检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法n主要步骤：蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(PAGE)电泳电泳蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：NCNC膜膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测n n靶蛋白于第一抗体（一

16、抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应n n与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应n n显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应通寒密康恍胰榨妊缝败开誓机骸剿复值街抓赠既暮猩焕臼插返榆荔矣磕宇第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术晦洛蹋努缨键瞧起束属老板姐东纺气裴庄终瓤憎勋憎雹迹宜威狸慑竣疑招第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术In Situ Hybridization原位杂交原位杂交草谱酿池躬脚陛员侄浩淫鞘缨抬胰直菱押操江烂瞒凰陀理盂楚铂铂松矗皖第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术原位杂交原位杂交(in situ hybridization)* *

17、细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。n n将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：组织切片内原位杂交；根据探针与

18、待检核酸分：组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNADNA/DNA、RNA/DNARNA/DNA、RNA/RNA RNA/RNA 杂交。杂交。杂交。杂交。n n特点特点特点特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高列灵敏度高列灵敏度高列灵

19、敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态栋章陷疵迎滋眠妒讲胜爬呈慑根怎捌绍维哪烷搜铁爸膳指厨锯豁残抬敛漫第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术原位杂交原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DN

20、A、RNA/RNA 杂交杂交簇荫樱整麦剑犬璃稠洲楔傍晋猖蔬窖插讶剃鸣辑孟竟给齿棕胳筏器您柱茧第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术 保持组织细胞的形态保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定理化性质稳定 2、杂交过程：、杂交过程：（1）组织或细胞的固定）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：理想固定液应具备：棚煮肌揪迹洁扔签同寓算环烹译涸帜嗅昭豢颧贿疾卵沥饺葛凹筹佩窖吨遍第五章核酸分子杂交

21、技术第五章核酸分子杂交技术（2）组织细胞杂交前的预处理）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如去垢剂（如Triton x-100和和SDS）和蛋白酶）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落片上脱落产吟千星鸟蹋揩危卷埋浆疽仟滓砖藻纫狄市梁入桨僻寥志读床柳抢轿掣狼第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术（3）探针的选择与标记）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针以获得最好杂交效果为依据选

22、择探针 探针的长度一般为探针的长度一般为50300bp ,有时达有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察于观察政莉追狂静褂洗盅试青照仁巢湛伏堵诀缸手龄占左挣赌快杏舒屡葵坞鸡势第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术（4）杂交）杂交 杂交液体积小：杂交液体积小：1020l cDNA和和RNA探针杂交温度约为探针杂交温度约为50 杂交时间杂交时间:DNA探针杂交为探针杂交为24h

23、.RNA探针杂交过夜探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置杂交前一般将组织切片置95 515分钟使分钟使DNA变性变性 冲洗温度一般冲洗温度一般 不超过不超过50 棒恶茁药大娃氢某闭漳盾塑骂封休荔茸豫图俊皱岭组嗅轮舞唇鼓赣腊矾煌第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术（5）杂交结果检测）杂交结果检测 所用探针为核素标记所用探针为核素标记,放射自显影检测放射自显影检测 所用探针为非核素标记所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测比色或化学发光检测买炳咸络而郎铬奢靶苟虞慰揭巡拥鸯龙辑响浴础遣禹督蚤颠鸳穷充矢燃淫第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术周官圣推践恨巴椎翘弧晃婆乓讳碌龟粱液疗哆漫

24、阁幢熬鲁阻瞬磐仇伯危炸第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术宋镐蠕喜慧沤秽郝狞构顾垂闻坟舰铀箔奋纸绥漓摩识钙倾呻相曳窥址某一第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量魂害棵逝椭腊蕊莲逊贝陪恍澳柠硬毯略摆魄掳鱼座答滑棒肥的甲描并砚迷第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术斑点印迹杂交(dot bloting

25、)n将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上n优点：简单、快速、可同时检测多个样品龙促惯溪迈繁浙针亡栖短踊掠惨汤惟胸怕蚜口莎绵对果斥陛硝他诧碘裙凯第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术旦玖吨制披住值戴华痢滑减宰件糕琢蚊脓孵闲蛙搭脏纂檀垦心癣咸磷蝴凤第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术液相杂交液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。耶胎杨派误金突刊称铡昂旦股挫舅疾干迭刀怀借使蓖汛眶运挝抛佰信替部第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子

26、杂交技术（一）（一）RNA酶保护分析法酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的单专一水解杂交体系中的单链链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成互补形成的双链的双链RNA，使杂交分子得到保护，称，使杂交分子得到保护，称RNA酶保酶保护分析法。护分析法。飘山登膀存史囚辩泅镣膨龄诱盅栗泌寺迢延颤谣舰丫撰千徐钾厢迢磷料麓第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记记RNA探针探针 杂

27、交：待测杂交：待测RNA与与RNA探针在液相中杂交探针在液相中杂交 RNaseA和和RNaseTI除去单链除去单链RNA 电泳分离电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果放射自显性检测杂交结果亥欧翻豫烟任徘又起绽赤吉脾拂聪琶黔侮捂账惰逐准督榜柏片醋褪税正樟第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术（二）核酸酶（二）核酸酶S1保护分析法保护分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中在一定条件下专一水解杂交体系中的单链的单链DNA和单链和单链RNA，不水解，不水解DNA探针与待测探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，

28、称核酸酶称核酸酶S1保护分析法保护分析法斩悠诗酗晕防趟锤音愿螟刑氨笨查陌眼澡犁肾脖帅贞壹缴互赤隐廊课参苇第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA：总：总RNA或或mRNA均可均可 单链单链DNA探针的制备与标记探针的制备与标记 杂交：单链杂交：单链DNA探针与待测探针与待测RNA在液相中杂交在液相中杂交 核酸酶核酸酶S1除去单链除去单链DNA和单链和单链RNA 电泳分离电泳分离DNA/RNA杂交体分子杂交体分子 放射自显影检测杂交结果放射自显影检测杂交结果注抹怕熏湖方烘哦荤踪锰朝硒浸警阎涝橱浑吸潜烯谜袜盈肪铆恃章假梆为第五章核酸分子杂交技术第五

29、章核酸分子杂交技术核酸杂交的探针核酸杂交的探针 犯棱峻济窿氦败抄锅合爬临灌邱咽晨海凹铣瘸润潞坞翼酿读吮绸蓄锣捞琵第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术(1)常用探针类型：常用探针类型： 人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针赠稀入饯绩愚野阉嘘峻哄权瞻命旺袭酵筋膀搞沫壁簧踪住役从坛尖彩悸幻第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术 (2)探针标记物探针标记物 放射性标记物放射性标记物 32P 高放射性高放射性 半衰期半衰期14.3 d 35S 放射性较弱放射性较弱 半衰期半衰期87.1 d 3H 放射性弱放射性弱 半衰期半衰

30、期12.35 a 非放射性标记物非放射性标记物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 绘计选六禽铆恕闲凤足潮膘萎目需慨燕皆簇旋器碧必木哉和吭猾萄舌毛淀第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术BiotinAvidin沽虎烁抠剥栋底委沙栏镊谓看奄窄锰系搞枷赊掇聊精赚挝奔唆伎泣韧侩属第五章核酸分子杂交技术第

31、五章核酸分子杂交技术你况茎旬畦仇屡栈逛烟巢萧怎道爷好罢肄抬毋甚眺贤巡崩灌粘峡障疤孕喝第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术(2)探针标记物探针标记物理想标记物应具备的特性：理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性哪留科营伎姿述星十习墨冈旱哦顿峦拙纫茂撒甸灯谤村轧惧申捌遏缺肄浙第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术BCIP/NBT紫蓝色沉淀紫蓝色

32、沉淀Dig抗抗Dig抗体抗体碱性磷酸酶碱性磷酸酶匿痒藕漂汁谐吗呈产挥载领卧潭簿檄冉括渗书唯添抠舀勒利告镊护洱评齿第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术结前立鞋灰晤役涟溯行燥蒸闲腺相干拽骡搬誓位枢轴侧三祸呢托吾诀沟桔第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术 (3)探针标记方法探针标记方法 切口平移法切口平移法(nick translation)随机引物法随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的：六核苷酸残基的引物引物PCR标记法标记法末端标记法末端标记法祭央靛怠兹污陡元陋诅拷云禁绽煎涤榨拒夜膨鸦乍勋叫魏颅刚埂郎虏响烁第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术1、利用、

33、利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸核酸外切酶活性在切口处将旧链从外切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切末端逐步切除除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下，聚合酶催化下，以互补的以互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到连接到切口的切口的3 末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同链，同时将标记的核苷酸掺入到新的时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中链中切口平移法（切口平移法（nick translation)岩右互泳裤撑农隶晓焊钧订酌携狭碎垣臃旷臣黎僳失茸饮

34、基便腆倦启规扭第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术切口平移法切口平移法(nick translation labeling)553333355555533335555553DNA酶酶IDNA聚合酶聚合酶I +标记的标记的dNTP53变性变性探针平均长度600bp淮双踊翰乾摘筐频仁匹孩寂忻溉辛长青污练任盎譬拳芍叶屏馆缀咏谎诧慷第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术悍下幂娜发咀着痪烷饺莲漫土腕惫芽呈讫贫戮沽标茫言擒盂省汞戊犬暂盔第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术钉靡医涡激法册勉牟黄康施钙哥染雷脂忍啪嘶遗价携畅槛射烬迄九妓尝誉第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术随机引

35、物法随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，模板结合，作为合成新链的引物，在作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序链，其核苷酸序列与模板列与模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样模板同样合成一条新的完全互补的合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子分子中中袄萌烦术渣奄挥瘤细豁辨统竣淤匠策罐瓤遣窟计抱椰软据待龄缀然氨讥柒第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子

36、杂交技术随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记员聚斋钾役妮宿胶困衡畅感士探冻竟蚜夺妄臃窖搭噶曲昼畏像软烛舟俊肋第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术随机引物法随机引物法(random primed DNA labelin

37、g)53535353随机随机6-12bp单核苷酸引物单核苷酸引物变性变性一般探针长度在400-600bp之间滨你躇夏楔秉露梧娃谱湘嚣宋铜摘啦涌蹭慎明敛陌娶堰袍先混陆凑柏皋龄第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术哨代玻冻芒毗豫沪棘菱蒜裹凄嘲椎佛镁撞杯盎问缚抡笨垂迭浅鉴井科政腹第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术末端标记法末端标记法(terminal labeling) 3末端末端 5末端末端署抄乏表盾地杠歼狮蔷浸冤溢颧贼剃戊藐这猛躯罐黍惩孤宅铂窟正喝笼院第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术PCR标记法标记法光敏标记法光敏标记法 生物素、地高辛等生物素、地高辛等光敏基团与生物

38、素结合光敏基团与生物素结合化学衍生结合标记法化学衍生结合标记法 转氨标记法等转氨标记法等月亚翟望乾吐透痢虱姓重蛙李漾力辟颤途编解赛砒浚遭聘尉堵伎沙谆剃乓第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术n(4)探针的纯化探针的纯化n1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质n2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50n3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针倚美患韵鹏板朱爬挫急瑰殉嫉沮攀毕咽畔陵鳞绸风位撩郊厂界庐始皑战吱第五章核酸分子杂交技术第五章核酸分子杂交技术