第六章酶与细胞固定化

《第六章酶与细胞固定化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章酶与细胞固定化（116页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 第六章第六章 酶、细胞、原生质体固定化酶、细胞、原生质体固定化 游离酶的缺点：游离酶的缺点：(1) 酶的催化效率不够高酶的催化效率不够高(2) 酶的稳定性较差酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。影响）。(4)产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难 ，酶在催化反应结束后，酶在催化反应结束后与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。定的困难。(3)酶使用后通常不能回收，这种酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶一次性使用酶的的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产，方式，不仅使生产成本提高，而且

2、难于连续化生产，从而导致酶的使用效率低，产品成本高。从而导致酶的使用效率低，产品成本高。创馏挥崇裁乖剑痕丈攘耐过五粉螺喉摸蜗尸音箕鼠瞻蝇鸦奏邀杠痔丛教蝗第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 第一节第一节 酶的固定化酶的固定化 第二节第二节 微生物、植物和动物细胞固定化微生物、植物和动物细胞固定化 第三节第三节 原生质体固定化原生质体固定化 成擦鸿朱棋惭崖辟穴喜试中维糯熬棚潭涎骋咬奖惮遭汹姥毯湿卧抡飘圭瞎第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 第一节第一节 酶的固定化酶的固定化一、固定化酶的一、固定化酶的优缺点优缺点二、酶的二、酶的固定化方法固定化方法三、固定化酶三、固定化酶性质性质四、固

3、定化酶的四、固定化酶的应用应用返胸且镁稿椅鲤千槛舷群囤露庇帚炎眶蔗拥濒芭柄购第窒丫纸肾渤戳名拘第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化酶酶的的固固定定化化：借借助助各各种种物物理理或或化化学学方方法法，将将酶固定于酶固定于水不溶性载体水不溶性载体上的过程。上的过程。固固定定化化酶酶(immobilized (immobilized enzyme)enzyme) ：固固定定在在载载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 （固定化酶又叫（固定化酶又叫水不溶性酶水不溶性酶）踊囱增珐吁枚勾敬呈翘右权梗茹翅捆庇阐盾衰兼捆腥笋绪亥眶陕盛呼煌撞第六章酶与细胞固定化第

4、六章酶与细胞固定化什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术纳丰登彼鸵淡凑侯介颖谅虱糟籍卷勿偷婆羹糖与捡拖躬问叛穷萎桅鲜呆厨第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 固定化酶的优点固定化酶的优点可以反复使用，有利于工艺的连续化。可以反复使用，有利于工艺的连续化。 反应后易于分离，简化了提纯工艺，反应后易于分离，简化了提纯工艺，产物得率高，利于提高产品质量。产物得率高，利于提高产品质量。可提高稳定性可提高稳定性反应过程可以严格控制，有利于工艺反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。自动化。适应于多酶反应

5、体系。适应于多酶反应体系。一一、固固定定化化酶酶的的优优缺缺点点谓眶最锹蔡卉岔咳鲁亏焊瑚氯砂腹件棠乘沉大巡连怒厨事嘱帽恃蓖磷股奠第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化酶缺点固定化酶缺点缺缺 点点比较适应水溶性底物和小比较适应水溶性底物和小分子底物。分子底物。固定化成本高。固定化成本高。酶固定化时酶的活力酶固定化时酶的活力有所损失。有所损失。 都锗往极逞波协靠姐民黄囊套儡砸汕草侄非镐瘪悬匙迢搏阂栈蔫掀织裴钢第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化二、酶的固定化方法二、酶的固定化方法1.吸附法吸附法2.包埋法包埋法3.共价偶联法共价偶联法 4.交联法交联法固定化方法固定化方法吸附法吸附法结

6、合法结合法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子键离子键结合法结合法物理物理吸附法吸附法 共价键共价键结合法结合法疫鞍栋调瞄猩埔廉蚁旗韩藐荡岭娄仿使瓷圃亡卓卑篓犯猪互登荤贩丙塘率第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1 1、吸附法、吸附法 （1 1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。含酶菌体吸附在其表面上。物理吸附法（物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：氢键、疏水键作用力：氢键、疏水键常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、

7、硅胶、羟基磷灰石玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成纤维素、大孔合成树脂树脂等。等。翘暇俐蔷洼续尘激俺修苇父致咕碾份迂掐俭腰更嘉锹鼠政昭撵侍褂涧魏销第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化优点：优点：酶的活性中心不易被破坏，酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。酶活力损失小。缺点：缺点：结合力弱，易解吸附。结合力弱，易解吸附。帘蔽慰彤攫领墟寿嗣恳燕川摘烷盆跟堵鼻疾促红多掘裳渔磕踊撮阐妻躯荣第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（3 3）制备方法：）制备方法：a. a. 静态法静态法 (statia procedure) (statia procedure) ： 没没有有搅搅拌拌、振振摇摇

8、情情况况下下，将将载载体体直直接接加加入入酶酶溶溶液液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.b.电电沉沉积积法法 (electrodeposition (electrodeposition procedure) procedure) ： 在在酶酶溶溶液液中中放放置置两两个个电电极极，在在电电极极邻邻近近加加入入载载体体，接接通通电电源源，酶酶移移向向电电极极并并沉沉积积到到载载体体表表面面，以以制制备备固固定定化酶。化酶。 该该法法可

9、可提提高高吸吸附附时时局局部部浓浓度度，增增加加吸吸附附量量，但但要要注注意酶在电场中的稳定性。意酶在电场中的稳定性。 赏赏朔幌闺亥乃苔路雨撅蝉汗玖赏凹氛滨拱熊刘旦唉黑盒妨诧闺挎甘御议第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化c. c. 混混和和振振摇摇装装载载法法 (mixing (mixing or or shaking shaking bath bath loading) loading) ： 是是实实验验室室常常用用方方法法，载载体体与与酶酶液液混混和和后后，要要在在搅搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该该法法固固定定化化较较为为均均匀匀，要要注注意意搅

10、搅拌拌或或振振摇摇速速率率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d. d. 反应器装载法反应器装载法(reactor loading process)(reactor loading process)： 这这是是工工业业上上常常用用方方法法，它它将将固固定定化化和和其其后后的的应应用用连连在在一一起起，即即先先将将载载体体装装于于反反应应器器中中，再再加加上上酶酶液液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。嘻饮理屑拦酵听映版抄会孤椒男帜托甭渐芳甘缩造苗城尧廉彦猫托砂冀渐第六章酶与细胞固定化

11、第六章酶与细胞固定化(1) (1) 定定义义：将将酶酶分分子子包包埋埋在在各各种种多多孔孔载载体体中中，制制成成一一定定形形状状的的固固定定化化酶酶的的技技术术，主主要要用用于于水水溶溶性性小分子底物小分子底物转化反应。转化反应。2 2、包埋法：、包埋法：(entrapment)(entrapment)(2)(2)包包埋埋法法的的类类型型：酶酶被被包包埋埋成成网网格格型型称称为为凝凝胶胶包包埋埋法法；酶酶被被包包埋埋成成微微胶胶囊囊型型称称为为微微胶胶囊囊包包埋埋法。法。 包埋过程包埋过程不发生反应不发生反应念亮曙颁呸僚紊易旦戍肇示曳尖圣的乞哼肩危般瘸华技丧暗势厨冬虑木蚕第六章酶与细胞固定化第

12、六章酶与细胞固定化 凝胶包埋法（网格型）：凝胶包埋法（网格型）：将酶包埋在凝胶内部的微将酶包埋在凝胶内部的微孔中。孔中。微胶囊包埋法（微囊型）：微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜将酶包埋在高分子半透膜中。中。摩阳冻浩杰辗资遍寓糙宾童瘟貌涣拟色实荷凳馅樱民浙炽孟核纶洁错栓待第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化a. a. 凝胶包埋：凝胶包埋：凝胶凝胶凝胶凝胶包埋条件包埋条件包埋条件包埋条件酶活性酶活性酶活性酶活性强度强度强度强度天然凝胶天然凝胶天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和

13、温和温和温和不变不变不变不变差差差差合成凝胶合成凝胶合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应聚合反应聚合反应部分失活部分失活部分失活部分失活 高高高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点炊求享孟淤讶般索离持尧脸骚迂伎外闽痈骇曰羹绒去擒撞栗滓但掀瑰挣分第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法： 滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E (or cell

14、) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法： 过硫酸钾过硫酸钾Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) 二甲氨基丙腈二甲氨基丙腈 噎袁猩柿禹掘狸瀑酶谦责贴想埋驯揪肖形堤阎脓鞍饭獭衍灌姬省傈舰朱你第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化b. b. 微微囊囊型型包包埋埋(microencapsulation)(microencapsulation)：又称半透膜包埋法：又称半透膜包埋法： 将将酶酶包包埋埋于于由由各各种种高高分分子子聚聚合合物物（直直径径几几十十微微米米几几百百微微米米，厚厚约约25mm25mm的的半半透透膜膜）制制

15、成成的的小小球球内内，制成固定化酶。制成固定化酶。 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 制制备备方方式式：界界面面沉沉降降法法、界界面面聚聚合合法法、表表面面活活性性剂乳化液包埋法。剂乳化液包埋法。 分述如下：分述如下：楼裁砖垄沥起言脱乘贝锗版侩帛淀擎凭睡咐辨抖汉渺夫鬼匝辖详本妆本于第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化界面沉降法：界面沉降法： 利利用用高高聚聚物物在在水水相相和和有有机机相相的的界界面面上上溶溶解解度度降降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例例： 以以火火棉棉胶胶（硝硝酸酸纤纤维维素素）包包埋埋酶酶时时，

16、先先将将酶酶的的水水溶溶液液在在含含有有硝硝酸酸纤纤维维素素的的乙乙醚醚溶溶液液中中乳乳化化、分分散散，然然后后再再加加入入苯苯甲甲酸酸丁丁酯酯，促促使使硝硝酸酸纤纤维维素素在在酶酶液液液液滴滴周周围围凝凝聚聚，最最后后用用Tween20Tween20破破乳乳化化后，就可得到含酶的火棉胶囊。后，就可得到含酶的火棉胶囊。溜谎屹肩兰扁伶关瘸站莹止碰呆攫恬杰堰泥佰陌澄酣炯才秋孔吐遥佐萌恐第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 界面聚合法：界面聚合法： 将将将将疏疏疏疏水水水水性性性性和和和和亲亲亲亲水水水水性性性性单单单单体体体体在在在在界界界界面面面面进进进进行行行行聚聚聚聚合合合合，形形形形成

17、成成成半半半半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。 例例：以以以以尼尼尼尼龙龙龙龙膜膜膜膜包包包包埋埋埋埋酶酶酶酶时时时时，将将将将酶酶酶酶液液液液及及及及亲亲亲亲水水水水性性性性单单单单体体体体（如如如如己己己己二二二二胺胺胺胺）溶溶溶溶于于于于水水水水制制制制成成成成水水水水溶溶溶溶液液液液。另另另另外外外外，将将将将疏疏疏疏水水水水性性性性单单单单体体体体（癸癸癸癸二二二二酰酰酰酰氯氯氯氯等等等等）溶溶溶溶于于于于氯氯氯氯仿仿仿仿或或或或甲甲甲甲苯苯苯苯等等等等与与与与水水水水混混混混溶溶溶溶的的的的有有

18、有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂。然然然然后后后后，将将将将这这这这两两两两种种种种互互互互不不不不相相相相溶溶溶溶的的的的液液液液体体体体混混混混和和和和在在在在一一一一起起起起。加加加加入入入入乳乳乳乳化化化化剂剂剂剂乳乳乳乳化化化化，使使使使酶酶酶酶液液液液分分分分散散散散成成成成小小小小液液液液滴滴滴滴。此此此此时时时时，亲亲亲亲水水水水性性性性的的的的已已已已二二二二胺胺胺胺与与与与疏疏疏疏水水水水性性性性的的的的癸癸癸癸二二二二酰酰酰酰氯氯氯氯就就就就在在在在二二二二相相相相界界界界面面面面聚聚聚聚合合合合成成成成半半半半透透透透膜膜膜膜，将将将将酶酶酶酶包包包包埋埋埋埋在在在在小小小

19、小球球球球内内内内。再再再再加加加加TweenTweenTweenTween20202020，使使使使乳乳乳乳化化化化破破破破坏坏坏坏，用用用用离离离离心心心心分分分分离离离离即即即即可可可可得得得得用用用用半半半半透透透透膜膜膜膜包包包包埋埋埋埋的的的的微微微微囊囊囊囊型型型型固固固固定定定定化酶。化酶。化酶。化酶。遣倦宰铲督袖姿八祈悬后络酝衔栓胆我鸳讨肯驾狮稀颗耙窟热笺藤邮县供第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 表面活性剂乳化液膜法：表面活性剂乳化液膜法： 在在酶酶的的水水溶溶液液中中添添加加表表面面活活性性剂剂，使使之之乳乳化化形形成成液液膜膜达达到到包包埋埋的的目目的的。该该法法

20、不不含含化化学学反反应应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。跺账迄妄量受改遵称炉送铝钩浆所体孔豫缠些衅够芜牧牲侥穿库嘿鼓勤晃第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化脂质体包埋：脂质体包埋： 将将酶酶包包埋埋于于脂脂质质体体(Liposome)(Liposome)中中的的方方法法。脂脂质质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 脂质体包埋的特点：脂质体包埋的特点： 具具有有一一定定的的机机械械性性能能，能能定定向向将将酶酶等等被被包包裹裹物物携携带带到到体体内内特特定定部部位位，然然后后将将被

21、被包包裹裹物物质质释释放放。因因此，其在药物应用方面受到重视此，其在药物应用方面受到重视。萨管馒寻悄炯共钦塔娩抢冉范咸淌贸寸孙硫逾挡乡桐搂班素粗雍靳炼的颅第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1 1）固定化酶颗粒小。）固定化酶颗粒小。2 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。价值。 缺点：缺点：反应条件要求高反应条件要求高

22、, ,制备成本也较高。制备成本也较高。 盈肺逆殿措乔篷篇武粒熙秤仪奈赁喷瓦易渣坪篷镁姿屯苛律丈君侈泉馆克第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：法，与其它固定化方法相比：优点：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。只适合作用于小分子底物和产物的酶。癸梭坐冯侗闽黎颇摔穿脯屑惑母咎滨拢伯像缕颠昏账凭捶莱沤涵迸乾鸣玲第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1 1）离

23、子结合法（）离子结合法（ion ion bindingbinding）作用力：离子键作用力：离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素3.3.结合法结合法载体通过载体通过共价键共价键或或离子键离子键与酶结合的固定化与酶结合的固定化方法。方法。地屡似穷沏沼靴攫徊东诧警矽辞郝源官闪安肉守娠句稽辨屑峡杉辜辱槐拼第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1 1）离子结合法（）离子结合法（ion ion bindingbinding）作用力：离子键作用力：离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、D

24、EAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素优缺点：优缺点：催化效率损失小；催化效率损失小；结合力弱，改变结合力弱，改变pHpH和离子强度和离子强度可使酶脱落。可使酶脱落。襄挤愧勋扑撂秆夕僧坑袍栗掷翠邱老比曹捆脾鱼汤影冲谜喘息税记憨袁陪第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团团和载体的功和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。2 2）共价结合法）共价结合法柄陵掳勺敲身萤办姑福突挞汪肌咸撮发圾徒嚎杂派框旱客延孕骤喝弊衍犀第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 A. A. 载体：亲水载体优于疏水载体载体：

25、亲水载体优于疏水载体 如如: :天然高分子衍生物天然高分子衍生物: : 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙亲水性好，亲水性好，有一定机械强度有一定机械强度厚审些铲初创秃审泉染戎疫惨示衡煤腿堆概兰丽立跨秉习宙巴尼作押犁饲第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2）偶联方法：）偶联方法：芳香氨基芳香氨基羟基羟基羟甲基羟甲基氨基氨基载载体体上上的的功功能能基基团团酶酶分分子子上上的的非非必必需需侧侧链链基基团团游离氨

26、基游离氨基胍基胍基酚羟基酚羟基巯基巯基咪唑基咪唑基羟基羟基重氮法重氮法叠氮法叠氮法卤化氢法卤化氢法烷化法烷化法缩合法缩合法常常用用的的偶偶联联反反应应里陆传识丝糟雕航免弄玩汗晕鸥飘愚工钦诲亦腻测齐骗艘襄缸枢谴扣乔试第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 重氮法：重氮法：重氮法：重氮法： 这这这这是是是是带带带带芳芳香香氨氨基基载载载载体体体体的的的的主主主主要要要要反反反反应应应应，即即即即载载载载体体体体先先先先用用用用亚亚亚亚硝硝硝硝酸酸酸酸处处处处理理理理成成成成重重重重氮氮氮氮盐盐盐盐衍衍衍衍生生生生物物物物，然然然然后后后后再再再再在在在在温温温温和和和和的的的的条条条条件件件件下

27、下下下和和和和酶酶酶酶分分分分子子子子上上上上相相相相应应应应的的的的基基基基团团团团如如如如酚酚酚酚羟羟羟羟基基基基、咪咪咪咪唑唑唑唑基基基基或氨基直接进行偶联。（见示意图）或氨基直接进行偶联。（见示意图）或氨基直接进行偶联。（见示意图）或氨基直接进行偶联。（见示意图）例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应ROCH2C6H4NH2+HNO2 ROCH2C6H4N+N+H2O载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基酚基或咪唑基发生偶联反应发生偶联反应值得固定化酶。值得固定化酶。ROCH2C6H4N+=N+E

28、ROCH2C6H4N NE亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成： NaNO2+HCl HNO2+NaCl粮茅恒拌叙渠苏爽掌疲警赁诀专礁唱惭壕继隐蘑阅总祝墓瞬逸芳酗土网雷第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 叠氮法：叠氮法： 含含有有酰酰肼肼基基团团的的载载体体可可用用亚亚硝硝酸酸活活化化，生生成成叠叠氮氮化化合合物物。以以羧羧甲甲基基纤纤维维素素为为例例，先先将将羧羧甲甲基基纤纤维维素素甲甲酯酯化化，再再与与肼肼反反应应生生成成羧羧甲甲基基纤纤维维素素的的酰酰肼肼衍衍生生物物，然然后后再再与与亚亚硝硝酸酸反反应应得得到到叠叠氮氮化化合合物物，这这种种产产物物能

29、能在在低低温温、pH pH 7.57.58.58.5的的情情况况下下和和酶酶的的氨氨基基直直接接偶偶联联。叠氮衍生物也能和叠氮衍生物也能和羟基羟基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基反应。反应。ROCH2COOH+CH3OH ROCH2COOCH2 +H2O CMC CMC甲酯甲酯R-O-CH2-COO-CH2 +NH2-NH2 R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OH CMC甲酯甲酯 肼肼 CMC酰肼衍生物酰肼衍生物ROCH2CONHNH2+HNO2 ROCH2CON3+2H2OROCH2CON3 +H2NE ROCH2CONHEROCH2CON3 +HOE ROCH2COOEROCH2CON3

30、 +SHE ROCH2COSE 臀瞻荒刑恼牧攻梳扎屁砌喝禁梦鸵贺瓤尚皖铜炼始碉遍钉狸纠帮挂牙永威第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 溴化氰法溴化氰法( (常用常用) )： 带带羟羟基基的的载载体体如如纤纤维维素素、葡葡聚聚糖糖和和琼琼脂脂糖糖等等常常用用的的反反应应。在在碱碱性性条条件件下下载载体体羟羟基基和和溴溴化化氰氰反反应应生生成成极极活活泼泼的的亚亚氨氨碳碳酸酸基基，它它在在弱弱碱中可直接和酶的碱中可直接和酶的氨基氨基进行共价偶联反应。进行共价偶联反应。槛枉蜡蜘甘煽果幌藻尖次购茧捍酌韩绵状超舰晨器蒜呛沽蜡堡宇送熔渔达第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 烷基化法：烷基化法：

31、含含羟羟基基的的载载体体也也可可在在碱碱性性条条件件下下和和均均三三氯氯三三嗪嗪(triazinyl)(triazinyl)等等反反应应，在在引引入入活活泼泼的的卤卤素素后能直接与酶的后能直接与酶的氨基氨基、酚羟基酚羟基或或巯基巯基等偶联。等偶联。芬凶支侩考乳站期羹周知程习袍匿道稿桶尧急周五莲用浴吏瓮药撩响砰贿第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 缩合法：缩合法： 利利用用羰羰二二亚亚胺胺的的活活化化作作用用，使使氨氨基基与与羧羧基基直直接接偶偶联联缩缩合合成成肽肽键键的的反反应应，适适用用于于带羧基或氨基的载体带羧基或氨基的载体。逗拼乔统遂死搅编话绦挤歧逸绦感刹精瓢漆舷旱更弦为浆琶遍绝遂

32、靳硕植第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。易脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。的空间构象而影响酶的催化活性。 断值向醋慷龚辟掷盂丢趾底屋妈撅肖孩屑圃纪谤组呕营选钵豺隔脚庐柯拐第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化4.4.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共价键

33、连接来制备固定化酶的方法。成共价键连接来制备固定化酶的方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛来眩线卫尖常豢餐兔岳捂酌哮职潮侈倘坷硫急瑰蚊尾洽浸浚刘相故桂腾含第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应, ,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。 此法与共价偶联法利用的均是共价键。此法与共价偶联法利用的均是共价键。仁简珍濒辩搐众融进雪膝疙射础赏萝螺卫忆驰中纵乡疼眼年媳秸感勾龋褐第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联

34、形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶化酶“网网”膜或膜或“网网”颗粒。这种方法又称为颗粒。这种方法又称为双双重固定化法。重固定化法。煌瓶一挖汛岛灿濒拔盯粥壹怀绰皿谤喝烤杜握音罩报绵昧腑曳熔然边杜迭第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。在分子内。 酶酶浓浓度度低低时时，交交联联发发生生在在分分子

35、子内内，酶酶仍仍保保持溶解状态（修饰）。持溶解状态（修饰）。 酶酶浓浓度度高高时时，交交联联发发生生在在分分子子间间，酶酶变变为为不溶态（固定化）。不溶态（固定化）。覆拜躲疼腾掸突捍耸赢黍常虚缩惊课嘻抉拆拈韶婪秤永鳖皱凝焕除雅绊痕第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。 优点：优点： 制备简单、结合牢固、可以长时间使用。制备简单、结合牢固、可以长时间使用。 皋奸张叼垣末吗栈恿矣

36、颠祖盛惟爱晚缄吧躬儡双信碌痈舱绵斟谜艘傣去验第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化酶和细胞固定化示意图酶和细胞固定化示意图锯梧邢彪斩尧沿妓笛彼骚邑纪毋淄败互瓣脸琳你豌犹泰皋潍芭唇斜韭土仙第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子结离子结合法合法共价结共价结合法合法交联交联法法制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难结合程度结合程度弱弱强强中等中等强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变

37、可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较傅挽朴谤澄争桨田芜昧王弱凿趾楔邪越棉迢培深币帘洲掠迁阉丝瑞羽擎础第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化方法固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法离子结离子结合法合法共价结共价结合法合法交联交联法法制备难易制备难易易易较难较难易易难难较难较难结合程度结合程度弱弱强强中等中等强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能可能可能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法

38、的优缺点比较书堡师瘩殿琐药伶谓屑缅继缺搀搬出挞亦跌着梨闸完裂慨郴诊涅轮列胺阉第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化三、固定化酶的性质三、固定化酶的性质 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。环境的许多性质会影响酶原有的性质。环境的许多性质会影响酶原有的性质。环境的许

39、多性质会影响酶原有的性质。完格归蕊寂溢辖添陀皿软最明钢梦啦韵畸秦慧鸥钟株动亿翁晰痒欣窘皮斤第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化1. 1. 活力：活力： 大多数酶固定化后，酶活性下降。大多数酶固定化后，酶活性下降。原因：（原因：（1 1）构象改变；（）构象改变；（2 2）空间位阻）空间位阻 （3 3）活性中心与载体结合）活性中心与载体结合评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标： 相相对对活活力力低低于于75%75%，没有实际应用价值。没有实际应用价值。纵鸭扮弓厚铰咽凿围腆铁历擅斗过残原苹镇但拒个认猜垒畔教担呼赊渠院第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2. 2. 稳定性：稳定性： (4)对

40、变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。留较高的酶活力等。(1)对热的稳定性提高，可以耐受对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。对酸碱耐受力增强。较高的温度。对酸碱耐受力增强。(2)固定化后半衰期增长，保存稳固定化后半衰期增长，保存稳定性好。定性好。(3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。被蛋白酶水解。橡龄榆熙召魔脱蒋浑凶磷肥耙哎刮哪往撮猜码臆棋枝荤畔眷防汛漱搪儒适第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化影响原因：影响原因： 固固定定化

41、化增增加加了了酶酶活活性性构构象象的的牢牢固固程程度度，并并且且固固定定化化后后酶酶分分子子与与载载体体多多点点连连接接，可可防防止止酶分子伸展变形。酶分子伸展变形。抑抑制制酶酶自自身身降降解解，酶酶与与载载体体固固定定化化后后失失去去了了分分子子间间相相互互作作用用的的机机会会，从从而而抑抑制制了了其其自自身身的的降解过程。降解过程。固固定定化化部部分分阻阻挡挡了了外外界界不不利利因因素素对对酶酶的的侵侵袭袭，但但是是如如果果固固定定化化触触及及到到酶酶的的活活性性部部位位或或调调节节部部位，也可能导致酶稳定性下降。位，也可能导致酶稳定性下降。超届雷躇迹天八铭购逆翠菲歹处色樊脂娠掏禁可茂龋反

42、拈戳根寄怔讼陇即第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化3.3.最适反应最适反应pHpH： 酶酶酶酶经经经经固固固固定定定定化化化化后后后后，其其其其作作作作用用用用的的的的最最最最适适适适pHpHpHpH常常常常会会会会发发发发生生生生偏偏偏偏移移移移，影响固定化酶最适影响固定化酶最适影响固定化酶最适影响固定化酶最适pHpHpHpH的因素：的因素：的因素：的因素： (1) (1) (1) (1) 载体性质对最适载体性质对最适载体性质对最适载体性质对最适pHpHpHpH影响：影响：影响：影响： 带带负电负电荷载体荷载体 ：最适：最适pH pH 向向碱性碱性偏移。偏移。 带带正电正电荷载体荷载体

43、 ：最适：最适pH pH 向向酸性酸性偏移。偏移。 不带电不带电荷载体荷载体 : : 最适最适pHpH一般一般不改变不改变。 (2) (2) 产物性质对最适产物性质对最适pHpH影响；影响； 酶催化反应产物为酶催化反应产物为酸性酸性：最适：最适pHpH向向碱性碱性偏移。偏移。酶催化反应产物为酶催化反应产物为碱性碱性：最适：最适pH pH 向向酸性酸性偏移。偏移。酶催化反应产物为酶催化反应产物为中性中性：最适：最适pHpH不改变不改变。颜氧修硅杂解工惟挑篷纂眨泄澡橡寐春姬方框怕类熔掉汾献檬涪身痴臀拽第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化影响原因：影响原因：固固相相酶酶颗颗粒粒在在水水溶溶液液中

44、中，是是被被一一层层几几乎乎不不流流动动的的液液体体包包围围着着，这这层层不不流流动动液液体体叫叫做做扩扩散散层层。载载体体的的带带电电性性质质之之所所以以会会影影响响固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值，是是由由于于在在使使用用带带负负电电荷荷的的载载体体时时，载载体体会会吸吸引引反反应应液液中中的的氢氢离离子子(H+)(H+)到到其其附附近近，致致使使固固定定化化酶酶所所处处反反应应区区域域的的pHpH值值比比周周围围反反应应液液的的pHpH值值低低一一些些，这这样样就就必必须须把把反反应应液液的的pHpH值值提提高高一一些些，才才能能使使酶酶充充分分发发挥挥其其催催化化功功能能。故故

45、此此，固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH显显得得比比游游离离酶酶的的最最适适pHpH值值高高一一些些。反反之之，带带正正电电荷荷的的载载体体对对氢氢氧氧根根负负离离子子有有吸吸引引作作用用，由由它它制制备备的的固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值要比游离酶的最适要比游离酶的最适pHpH值低一些。值低一些。饼汽豌云绵驾栏辣储瓢馋亦布谅葛触玖邵膊段膛愁凑饶况铃皂碍呆邮涸忿第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化影响原因：影响原因：固固定定化化载载体体成成为为扩扩散散阻阻碍碍，使使反反应应产产物物向向外外扩扩散散受受到到一一定定的的限限制制所所造造成成的的。当当反反应应产产物物为为酸酸性性时时

46、，由由于于扩扩散散受受到到限限制制而而积积累累在在固固定定化化酶酶所所处处的的催催化化区区域域内内，使使此此区区域域内内的的pHpH值值降降低低，必必需需提提高高周周围围反反应应液液的的pHpH值值，才才能能达达到到酶酶所所要要求求的的pHpH值值。为为此此，固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值比比游游离离酶酶要要高高一一些些。反反之之，反反应应产产物物为为碱碱性性时时，由由于于它它的的积积累累使使固固定定化化酶酶催催化化区区域域的的pHpH值值升升高高，故故此此使使固固定定化化酶酶的的最最适适pHpH值值比比游游离离酶酶的的最最适适pHpH值要低一些。值要低一些。坪沪褥跌药逻肖蒲帅纸榔翟

47、较茂讳赴干吼涸呜闲翼韭缉侥统囚拱垫同键莎第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化4. 4. 最适反应温度：最适反应温度： 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。 多多数数酶酶固固定定化化后后热热稳稳定定性性上上升升，最最适温度也上升（有例外）。适温度也上升（有例外）。同同同同种种种种酶酶酶酶，采采采采用用用用不不不不同同同同的的的的方方方方法法法法或或或或不不不不同同同同载载载载体体体体固固固固定化后，其最适温度可能不同。定化后，其最适温度可能不同。定化后，其最适温度可能不同。定化后，其最适温度可能不同。咏屡毋巩寄啮爬符非绪症蔷藩逃雄豁毅咋曾架蒂映玖呻砰挣朵否坍愤走解第六章酶与细胞固

48、定化第六章酶与细胞固定化5. 5. 动力学常数：动力学常数：KmKm与与VmVm 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性随载体的带电性能变化。能变化。 固定化固定化载体载体与与底物电荷相反底物电荷相反, ,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值值降低降低。 固定化载体与底物电荷固定化载体与底物电荷相同相同, ,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值显著值显著增加增加。VmVm固定化前后相同或接近固定化前后相同或接近 （也有例外）。（也有例外）。炽鳖凯补吵夏的震螟驻伺石浓借娃扇翰催检狼提喧造汤仿乏探般濒痪辖攀第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化6. 6

49、. 底物特异性底物特异性 固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于一般为：作用于小分子底物的酶类小分子底物的酶类经固定化后，经固定化后，专专一性一性基本基本不变。不变。而既而既可作用大分子也可作用小分子可作用大分子也可作用小分子底物的酶类底物的酶类经固定化后经固定化后专一性会发生变化。专一性会发生变化。泼殆换培淖浸氢瑰尽颇伦铁菲惹末绕睹涝碎谗行女症戳手蛛童作拾误虱飞第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化影响原因：影响原因： 固固定定化化酶酶底底物物特特异异性性的的改改变变，是是由由于于载载体体的的空空间间位位阻阻作作用用引引起起的

50、的。酶酶固固定定在在载载体体上上以以后后，使使大大分分子子底底物物难难于于接接近近酶酶分分子子而而使使催催化化速速度度大大大大降降低低，而而分分子子量量较较小小的的底底物物受受空空间间位位阻阻作作用用的的影影响响较较小小或或不不受受影影响响，故故与与游游离离酶酶的的作作用用没没有有显显著著不不同。同。著训秽弊蛰汽敝庄汗网殿省渴右安灌将筏扶昌琶要洽冤顿惹扛画猴疡涎畦第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化四、固定化酶的应用四、固定化酶的应用1. 1. 在食品工业中的应用在食品工业中的应用 2. 2. 在医药领域的应用在医药领域的应用 3. 3. 生物传感器生物传感器 4. 4. 环境保护环境保护

51、 吏声岿琢歌篱滓烂撵厩秋花啸瘟渤涪烯蹄魁硕啥奋蜒朵撂近栋吨仍蠢盾虎第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（1）乳制品中）乳制品中 乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不能消化牛奶中的乳糖，能消化牛奶中的乳糖，-半乳糖苷酶：又称乳糖酶，半乳糖苷酶：又称乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于1977年实现工业化。年实现工业化。 婆拄

52、砚籽船狭赊辜驭在叶衍原达衣猖詹菜坪义秒谣款争碱连提独爬咒钱绥第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（2）在啤酒中）在啤酒中 糖化需要糖化需要-淀粉酶淀粉酶，而麦芽中的，而麦芽中的-淀粉酶不足，淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通过过固定化淀粉酶固定化淀粉酶反应器。例如，在制造啤酒时，可以试反应器。例如，在制造啤酒时，可以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。 另外，采用另外，采用固定化蛋白质分解酶固定化蛋白质分解酶类来水解蛋白质或类来水解蛋白质或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间

53、存放后，含有的多多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有的多酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化克服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。 碴浪顷蛙烦掸眷供赴扭赠桓辨缘集道传字牢疽踌招农宙瞅纳容循茂鲤矣剑第六章酶与细胞固定

54、化第六章酶与细胞固定化（3）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用应用固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度种，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。自的高果糖糖浆。自1972年这项技术产生以来，科年这项技术产生以来，科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固后几十年中它将是应用最广，市

55、场份额最大的固定化酶定化酶 。察指衍隋玄脂瓣贴伪瓷摄烫火垂惭试迈伶典蕴逢邵算典廖册栗柯诚贮湃驶第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（4）在油脂改性中的应用）在油脂改性中的应用 脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，所以在油脂工业中有广泛应用，所以在油脂工业中有广泛应用，1，3-特异性脂肪特异性脂肪酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价廉，因此这一工艺受到较大重视，已开展了较多工廉，因此这一工艺受到较大重视，已

56、开展了较多工作。作。角湿禁笑恨柜畅献膛兄笼抵末受网砧戳缓保课盛黎室箕唐寒醛蚜花欠疾祭第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（5）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜 阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用化学法合成。现在，已开始用酶法合成，化学法合成。现在，已开始用酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜甜 。臀玩行赔翱陨颇轧修月穗耽涅做廉段台卑嫌反以祷菲霄敦吝胡声藉柜恼候第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（6）固定化酶在茶叶加工中的应用。）固定化酶在茶叶加工中的应用。 目前，固定化酶法已经开始应用于茶

57、饮料中，例目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例如，固定化的单宁酶和果胶酶。如，固定化的单宁酶和果胶酶。 单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高茶饮料品质。茶饮料品质。 果胶酶是

58、作用于果胶质的果胶酶是作用于果胶质的D-D-半乳糖醛酸残基之间半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。度滔界富裸铆黍血定旭绦歌俩靴祭私缓磋嘶魄警刚卵煌蝇耸吻掇跟哺园脂第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（7）在果汁中的应用）在果汁中的应用 柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（苦素的二萜烯

59、二内酯化合物（A环和环和B环）；另环）；另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量。量。氨雅艇荔呐弥歼击新恫晒鹏刺棋咕么阀萍属皖添彰肇居十琳瓣苗生缓尼食第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2、医药领域的应用、医药领

60、域的应用（1）作为治疗药物）作为治疗药物 固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。 作为治疗药物，溶液酶具有一些作为治疗药物，溶液酶具有一些作为治疗药物，溶液酶具有一些作为治疗药物，溶液酶具有一些“ “致命致命致命致命” ”弱点：弱点：弱点：弱点： 酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应酶作为异

61、体物质，反复应用会导致免疫反应 酶绝大多数是蛋白质，在体内易被网状内皮系酶绝大多数是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白酶水解破坏。统移除和被蛋白酶水解破坏。 由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。以达到治疗所需的最适高浓度。 溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。将它们固定化以后就能逐一地加以解决。雍慷础锅煽蔑奖忠储博峪菲庆输人舰跺罗脯赁有蔗晦浪足段戎键除删接急第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化（2 2）作为）作为“人工脏器人工脏

62、器” 固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶可可可可做做做做成成成成“ “人人人人工工工工脏脏脏脏器器器器” ”参参参参与与与与体体体体外外外外循循循循环环环环，其其其其应用主要有两方面：应用主要有两方面：应用主要有两方面：应用主要有两方面： a.a.用用于于除除去去有有害害的的毒毒性性物物质质及及有有潜潜在在毒毒害害作作用用的的代代谢产物谢产物 如如如如清清清清除除除除尿尿尿尿毒毒毒毒症症症症病病病病人人人人体体体体内内内内积积积积累累累累的的的的尿尿尿尿素素素素；进进进进行行行行这这这这类类类类应应应应用用用用时时时时除除除除了了了了要要要要考考考考虑虑虑虑半半半半寿寿寿寿期期期期、免免免免疫疫

63、疫疫过过过过敏敏敏敏等等等等问问问问题题题题外外外外，还还还还要要要要在在在在“ “人人人人工工工工脏脏脏脏器器器器” ”中中中中偶偶偶偶联联联联多多多多种种种种组组组组成成成成成成成成分分分分以以以以彻彻彻彻底底底底除除除除去去去去毒毒毒毒性性性性产产产产物物物物。如如如如处处处处理理理理尿尿尿尿素素素素时时时时，除除除除了了了了脲脲脲脲酶酶酶酶外外外外，还还还还要要要要解解解解决决决决尿尿尿尿素素素素分分分分解解解解生生生生成成成成氨氨氨氨的的的的问问问问题题题题，这这这这就就就就需需需需要要要要另另另另外外外外加加加加入入入入谷谷谷谷氨氨氨氨酰酰酰酰胺胺胺胺合合合合成成成成酶酶酶酶或或或

64、或加入去氨的树脂等。加入去氨的树脂等。加入去氨的树脂等。加入去氨的树脂等。资寿探浸乔访靶带看恬火控佬堑矛济风孙组歪辣哟窥种鱼债刑盈敞反酮奶第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化b. b. 除除去去( (一一种种或或多多种种) )氨氨基基酸酸，使使需需要要这这些些物物质质的病变组织的病变组织“饿死饿死” 治治治治疗疗疗疗时时时时只只只只需需需需将将将将患患患患者者者者的的的的血血血血液液液液引引引引出出出出体体体体外外外外，通通通通过过过过由由由由固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶等等等等构构构构成成成成的的的的“ “人人人人工工工工脏脏脏脏器器器器” ”加加加加以以以以处处处处理理理理，然然然

65、然后后后后再流回体内。再流回体内。再流回体内。再流回体内。搭犯泻终拢连直杆拧介钒其矣熙稍志噬丛武唾蚊岁辫铬益叔捂葫禾考摩睁第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化3、生物传感器、生物传感器生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物浓生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物浓度与可测量电信号关联起来的装置，生物传感器中研度与可测量电信号关联起来的装置，生物传感器中研究最多的是酶传感器，其核心技术也是酶的固定化。究最多的是酶传感器，其核心技术也是酶的固定化。 Chen Chen等将高聚物聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙烯等将高聚物聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜将葡萄糖

66、氧化酶酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜将葡萄糖氧化酶固定在金电极上，通过检测电信号可以测定血液中的固定在金电极上，通过检测电信号可以测定血液中的葡萄糖含量。宋正华等将具有分子识别功能的葡萄糖含量。宋正华等将具有分子识别功能的-葡葡萄糖苷酶和发光胺，分别固定在壳质胺和大孔阴离子萄糖苷酶和发光胺，分别固定在壳质胺和大孔阴离子交换树脂的填充柱中交换树脂的填充柱中, ,组成流动注射系统，可以方便组成流动注射系统，可以方便地确定苦杏仁甙的含量。地确定苦杏仁甙的含量。超卵策隧烘帮瞄双今滨佣气侗痪剿斥陵迢坚汛柴垄躺滦魏诌堡别朴觉棵蚂第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化4、环境保护、环境保护固定化酶一个很

67、大的用途是处理废水中一些有毒有固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有害物质，防止污染。其中害物质，防止污染。其中漆酶漆酶的固定化应用较为广的固定化应用较为广泛，酚类化合物是废水中一类常见的高含量污染物，泛，酚类化合物是废水中一类常见的高含量污染物，漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧化物酶。在废水处理中化物酶。在废水处理中,由于组分复杂而且经常变化，由于组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因此，要用多酶固定化体系组合处理，才能使有机物此，要用多酶固定化体系组合处理，

68、才能使有机物完全矿化和保持无害稳定排放。完全矿化和保持无害稳定排放。士库碴休表癣斡稿涕浓萌势婉介鉴厌哭九遍笼戮纱发尝架汾衅级省沾沥缉第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化桩瑟额所街缺纤锋卫箩偷隐疆踏卸湃籽袱魁严崭桓苇链写联擒娟惠韦崔椽第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化第二节第二节 细胞固定化细胞固定化一、基本一、基本概念概念 二、细胞固定化二、细胞固定化方法方法三、固定化细胞的三、固定化细胞的特点特点四、固定化微生物细胞的四、固定化微生物细胞的应用应用五、固定化五、固定化植物细胞植物细胞六、固定化六、固定化动物细胞动物细胞俺贩汞娟名臀遮复搜冠鲜衙肥捂胳炕挡怪殖洲疫熔域燕涝截列甲卷察累凄

69、第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化细细胞胞固固定定化化技技术术：将将细细胞胞限限制制或或定定位位于于特特定定空间位置的方法。空间位置的方法。固固定定化化细细胞胞 ：被被限限定定自自由由移移动动的的细细胞胞，即即采采用用各各种种方方法法固固定定在在载载体体上上，在在一一定定的的空空间间范范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。一、基本概念一、基本概念翘剧枯盒谱维谐每迁监蚂役肄樊蛋苟殆踩莫魂伙瘪筒伪藉缚俭戈儒愉莲九第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化细胞与固定化酶相比，其优点：不需要破碎细胞和分离提纯酶，减少了酶活力损失，可大大降低生产成本；保持了

70、胞内酶系原始状态与天然环境，因而酶更稳定；保持了胞内原有的多酶系统，能催化一系列的反应，大大提高了催化效率，特别是对那些多酶反应、需要辅酶的氧化还原反应以及合成反应等，固定化细胞更具有明显的优势；固定化细胞的制备与使用通常都比固定化酶更简便。揭绑掸形嫌寇牺余樱星征缘秃嘘缸奖幂诺扼肮藻抨弥百掖腥贱疗入扼海撼第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化二、微生物细胞固定化方法二、微生物细胞固定化方法二、微生物细胞固定化方法二、微生物细胞固定化方法 主要有主要有主要有主要有吸附法、包埋法吸附法、包埋法、交联法和无载体法、交联法和无载体法。1 1、吸附法、吸附法、吸附法、吸附法(1) (1) 定义：将细胞

71、直接与水不溶性载体相结合的方法。定义：将细胞直接与水不溶性载体相结合的方法。定义：将细胞直接与水不溶性载体相结合的方法。定义：将细胞直接与水不溶性载体相结合的方法。(2) (2) 常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。(3) (3) 优点：优点：操作简单，对细胞生长、繁殖和新陈代谢操作简单，对细胞生长、繁殖和新陈代谢

72、操作简单，对细胞生长、繁殖和新陈代谢操作简单，对细胞生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响。没有明显的影响。没有明显的影响。没有明显的影响。 缺点：缺点：吸附力弱，吸附容量小，没有工业化生产。吸附力弱，吸附容量小，没有工业化生产。吸附力弱，吸附容量小，没有工业化生产。吸附力弱，吸附容量小，没有工业化生产。傅冬罗模霸玫慨童捍闸析乙腑饶坍磅铝呛栗党遂犁露疤猖去掣粱杰粤杯获第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、包埋法（最常用）：、包埋法（最常用）：、包埋法（最常用）：、包埋法（最常用）： (1) (1) 定义：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定义：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定义：将细胞包

73、埋于多孔载体内部而制成固定义：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多酶系统，是目前制备固定细胞酶系统，是目前制备固定细胞酶系统，是目前制备固定细胞酶系统，是目前制备固定细胞最常用最常用的方法。的方法。的方法。的方法。 包埋法又分为包埋法又分为包埋法又分为包埋法又分为凝胶包埋法凝胶包埋法和和和和半透膜（胶囊）包半透膜（胶囊）包埋法埋法。咆危扑兔插见矛颤串煎披写约贞诅抵谜阁漫在焊置瘴隙迄辊兄阶显祷披炕第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定

74、化 (2) 凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法。在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法。 凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 a. 琼脂凝胶琼脂凝胶包埋法包埋法 b. 海藻酸钙凝胶海藻酸钙凝胶包埋法包埋法 c. 角叉莱胶角叉莱胶包埋法包埋法 d. 明胶明胶包埋法包埋法 e. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶包埋法包埋法 (3) (3) 半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成半透膜胶囊包埋法：

75、将细胞分散于有机溶剂中成半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半透膜胶囊的固相细胞。透膜胶囊的固相细胞。透膜胶囊的固相细胞。透膜胶囊的固相细胞。晴蛮员墨光没浊喝拟袱聘网管橱役臣意喜别寂连尸偿橇讳项吐汤耙袒池痕第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法琼脂琼脂水水溶化溶化冷却至冷却至4855 加菌悬液加菌悬液 趁热分散在预冷的甲苯或四氯趁热分散在

76、预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。细胞胶粒。 摊成薄层，冷却，切成所需形状。摊成薄层，冷却，切成所需形状。 琼脂凝胶机械强度较差，氧气、底物和产物琼脂凝胶机械强度较差，氧气、底物和产物的扩散较困难，其使用受到限制。的扩散较困难，其使用受到限制。 炔澜施哭款仁勤驯辩僧压判质断丹硷窑孽苫顺浆流突纹擞估知温肾降贼帕第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钠海藻酸钠水溶液水溶液灭菌灭菌菌悬液菌悬液 滴入氯化钙溶液中，形滴入氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。成球状固定化细胞胶粒。 海藻酸钙凝胶包埋法操作简便，条件温

77、和，海藻酸钙凝胶包埋法操作简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化适合于多种细胞的固定化。 磷酸盐会使凝胶结构破坏，使用时应控制好磷酸盐会使凝胶结构破坏，使用时应控制好培养基中培养基中磷酸盐磷酸盐浓度，并在培养基中保持一定浓度，并在培养基中保持一定浓度的浓度的钙离子钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。，以维持凝胶结构的稳定性。拈圃殆砰彩绣雄吾岁凶悬予寒轰胀簧仟傈檀荤资貉互泞遁怒锄庞屿畸暑胸第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化角叉菜胶包埋法角叉菜胶包埋法角叉菜胶角叉菜胶水溶液水溶液冷却至

78、冷却至3550 加菌悬液加菌悬液 趁热滴定至趁热滴定至KCl溶液中，形成溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。球状固定化细胞胶粒。 滴到冷的植物油中，成型后再置滴到冷的植物油中，成型后再置于于KCl溶液中。溶液中。 角叉莱胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，角叉莱胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定化。进行双重固定化。灭菌灭菌杜典戈滞忙橇寺玫雀平债拒乞出湛潮舍爵燥厦甩桑静延鸡救阂盛毙盗甩虐第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化明胶包埋法明胶包埋法明胶水明胶水溶液溶液冷却至冷却至35以上以上 加菌悬液

79、加菌悬液 冷却后制成所需形状。冷却后制成所需形状。 机械强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处机械强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定化。理，进行双重固定化。灭菌灭菌着挞柏奸鲁润目号霸求洲斋崩移怂售磐产骂佩拓芝躁匿硅籍罗房秘总亡楚第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法丙烯丙烯酰胺酰胺甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺烯酰胺 混合混合加过硫酸钙和四甲基乙二胺加过硫酸钙和四甲基乙二胺静置成型静置成型固定化细胞机械强度高，可通过改变丙烯酰胺的浓度固定化细胞机械强度高，可通过改变丙烯酰胺的浓度以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化。以调节凝胶的孔径

80、，适用于多种细胞和酶的固定化。 菌悬液菌悬液 注意：丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作注意：丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间。少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间。拧饯壕猿榜蹬梭阜旬恩狄厄诲麦疡钻狞捧镣瘤循促捻哨跨沿童隐淹斡绚景第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化3、无载体法、无载体法 (1) (1) 基本概念：基本概念： 在没有载体的情况下，借助物理或在没有载体的情况下，借助物理或化学方法，将细胞直接固定化的方法。这化学方法，将细胞直接固定化的方法。这种固定化，既可发生在细胞结构上，

81、也可种固定化，既可发生在细胞结构上，也可通过细胞聚集来完成。包括通过细胞聚集来完成。包括去自溶酶法去自溶酶法和和絮凝法絮凝法。揖鱼骄新斯场涝就瞅锚扒沉匆产迢岔晰统征害瘴油瞅羌椿咙殴端赣阮厚呻第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化(2) (2) 去自溶酶法：去自溶酶法： 细细胞胞所所具具有有的的酶酶系系，从从广广义义上上讲讲已已是是一一种种固固相相酶酶 ，因因此此用用简简单单的的加加热热、冻冻冻冻，-射射线线幅幅射射等等物物理理手手段段处处理理细细胞胞，使使细细胞胞的的自自溶溶酶酶系系失失活活，防防止止目目的的酶酶被被水水解解，由由此此得得到到的细胞实体，为固相细胞。的细胞实体，为固相细胞。饭

82、顾邪疟壬兑内悍臻焉漏谎霞啄际楔血活僧名秃惊耻遮好酉按姜奏恃樊寻第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 (3) (3) 絮凝法：絮凝法： 向向待待固固定定的的细细胞胞液液中中加加入入絮絮凝凝剂剂，使使细细胞胞凝凝聚聚在在一一起起，过过滤滤，收收集集絮絮凝凝细细胞胞，装装柱柱，即即为可使用的固相细胞。为可使用的固相细胞。 常常用用絮絮凝凝剂剂：活活性性硅硅胶胶、聚聚赖赖AAAA、聚聚丙丙烯烯酰胺等。酰胺等。 扫饲绞入惑瞬滩腊矫代凭草伪养命钨来垄钟侯惟腑漠快晃俄棒染挨莎揉季第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化目前已报道的有絮凝性的微生物有：目前已报道的有絮凝性的微生物有：l霉菌霉菌（赫曲霉、酱

83、油曲霉、米曲霉）（赫曲霉、酱油曲霉、米曲霉）l放线菌放线菌（灰色链霉菌、酒红链霉菌、石灰（灰色链霉菌、酒红链霉菌、石灰壤诺氏卡菌、椿象虫诺卡氏菌）壤诺氏卡菌、椿象虫诺卡氏菌）l细菌细菌（嗜虫短杆菌、产碱细菌、铜绿假单（嗜虫短杆菌、产碱细菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、红平红球菌、金黄胞菌、荧光假单胞菌、红平红球菌、金黄色葡萄球菌及运动发酵单胞菌）色葡萄球菌及运动发酵单胞菌）l酵母菌酵母菌（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂殖酵母、异常汉逊酵母等）殖酵母、异常汉逊酵母等） 川窝糖胳臣诽带窜悉伞喧且钳昨袁俯萧笔框臭郝体水俯浴局苯寞姆哉澜狱第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固

84、定化三、固定化微生物细胞的特点：三、固定化微生物细胞的特点：（1）保持了其完整结构和自然状态，稳定性好。）保持了其完整结构和自然状态，稳定性好。（2）细胞密度增大，能够提高产物产率。）细胞密度增大，能够提高产物产率。（3）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长时间。较长时间。（4）保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调）保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调控体系，可以按照原理的代谢途径进行新陈代谢，控体系，可以按照原理的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。并进行有效的代谢调节控制。（5）提高工程菌的质粒稳定性，有利于菌种的传）提高工程菌

85、的质粒稳定性，有利于菌种的传代保存。代保存。 勃说脏壶甄褪柜阉嘱遵无餐矿债沼名络守慢贩腿然屁暂劳认件盖驳眩瞳灼第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化四、固定化微生物细胞的应用四、固定化微生物细胞的应用1 1、利用固定化微生物细胞生产各种产物：、利用固定化微生物细胞生产各种产物： 固定化微生物细胞能进行正常的生长，固定化微生物细胞能进行正常的生长，繁殖和新陈代谢，所以利用固定化细胞可以繁殖和新陈代谢，所以利用固定化细胞可以如同游离细胞那样发酵生产各种代谢物。由如同游离细胞那样发酵生产各种代谢物。由于微生物固定化后，受载体的影响，故固定于微生物固定化后，受载体的影响，故固定化微生物只用于化微生物

86、只用于生产生产各种能够各种能够分泌到细胞外分泌到细胞外的产物。的产物。 其中主要有下面几类物质：其中主要有下面几类物质：婚姿贩作丸读遍咏旨屯正释欧哦蛋能脸办呈掳密斡羊净皆彩垦眉葱怔髓颜第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化(1) (1) 酒酒精精酒酒类类：固固固固定定定定化化化化酵酵酵酵母母母母等等等等微微微微生生生生物物物物可可可可用用用用于于于于生生生生产产产产酒酒酒酒精精精精、啤啤啤啤酒酒酒酒、蜂蜂蜂蜂蜜蜜蜜蜜酒酒酒酒、葡葡葡葡萄萄萄萄酒酒酒酒、米米米米酒酒酒酒等等等等。有有有有的的的的已已已已完完完完成中试，实现了工业化生产。成中试，实现了工业化生产。成中试，实现了工业化生产。成中试

87、，实现了工业化生产。 (2) (2) 氨氨基基酸酸：固固固固定定定定化化化化氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸生生生生产产产产菌菌菌菌可可可可用用用用于于于于生生生生产产产产谷谷谷谷氨氨氨氨酸酸酸酸、赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸、精精精精氨氨氨氨酸酸酸酸、瓜瓜瓜瓜氨氨氨氨酸酸酸酸、色色色色氨氨氨氨酸酸酸酸、异异异异亮亮亮亮氨氨氨氨酸等氨基酸。酸等氨基酸。酸等氨基酸。酸等氨基酸。(3) (3) 有有机机酸酸： 固固固固定定定定化化化化黑黑黑黑曲曲曲曲霉霉霉霉等等等等微微微微生生生生物物物物可可可可生生生生产产产产苹苹苹苹果果果果酸酸酸酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机

88、酸。柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。河燥惟秆阎准脯舌液再肠滚啼素南落洗患沼亩秸琼谋昌夜成曳鲁弧处磊傲第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 (4) (4) 酶酶和和辅辅酶酶：固固定定化化微微生生物物可可用用于于生生产产淀淀粉粉酶酶、糖糖化化酶酶、蛋蛋白白酶酶、果果胶胶酶酶、纤纤维维素素酶酶、溶溶菌菌酶酶、磷磷酸酸二二酯酯酶酶、天天门门冬冬酰酰氨氨酶酶等等胞胞外外酶酶以以及及辅辅酶酶A A，NADNAD，NADPNADP、ATPATP等辅酶等辅酶 (5) (5) 抗抗生生素素：固固定定化化微微生生物物在在生生产产青青霉霉素素，四四环环素素，头头孢孢霉

89、霉素素、杆杆菌菌肽肽、氨氨苄苄青青霉霉素素等等抗抗生生素素方方面面的的研研究，成果显著。究，成果显著。 (6(6）固固定定化化微微生生物物细细胞胞还还可可以以用用于于甾甾体体转转化化及及有有机机溶剂、维生素、化工产品等的生产。溶剂、维生素、化工产品等的生产。郴蘑蚜屠梧阂律坑摄谭昆艺桐苞浪彦聘谭师兑喷时柞婉茸棱娱榨龙荤疥跃第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、固定化微生物细胞制造微生物传感器、固定化微生物细胞制造微生物传感器： 微微生生物物传传感感器器是是由由固固定定化化微微生生物物细细胞胞与与各各种种能能量量转转换换器器( (电电极极，燃燃料料电电池池，场场效效应管等应管等) )密切

90、结合而成的传感装置。密切结合而成的传感装置。 微微生生物物传传感感器器分分为为呼呼吸吸活活性性测测定定型型和和电极活性测定性电极活性测定性两种。两种。 蜒壮摊易瞥踢苦顷警斤杯谊监绣锨疯崖教忠邓田滇埠淑拘勘哩汇食婴疆挟第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化呼吸活性测定型：呼吸活性测定型： 利利利利用用用用固固固固定定定定在在在在高高高高分分分分子子子子膜膜膜膜上上上上的的的的微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞的的的的呼呼呼呼吸吸吸吸作作作作用用用用，测测测测定定定定氧氧氧氧气气气气的的的的消消消消耗耗耗耗和和和和二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳的的的的生生生生成成成成，从从从从而而而而确

91、确确确定定定定被被被被测测测测定定定定物物物物质质质质的的的的量量量量。这这这这种种种种呼呼呼呼吸吸吸吸活活活活性性性性测测测测定定定定型型型型传传传传感感感感器器器器由由由由固固固固定定定定化化化化微微微微生生生生物物物物膜膜膜膜和和和和氧氧氧氧电电电电极极极极或或或或二二二二氧氧氧氧化化化化碳电极结合而成。碳电极结合而成。碳电极结合而成。碳电极结合而成。谤孝将蓄棒闯庄踏爪竞阿艰驰祥瑟醋薄尸罗拦酥对吱绦民被弦叠骚珍激拂第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 电极活性测定型：电极活性测定型： 利用固定的微生物细胞的新陈代谢作用，测定利用固定的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变

92、化从而确定样品中欲测物质电极活性物质的量的变化从而确定样品中欲测物质的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成。电池、离子选择电极和气体电极等组成。 微生物传感器已成功地用于测定可发酵性糖，葡萄微生物传感器已成功地用于测定可发酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸盐，生化需氧量氨、硝酸盐，生化需氧量(BOD)(BOD)、细胞数量等。、细胞数量等。 显洱米橇湿撬诣稀约魂诧闲余门提辙径锨藻镑恒柔锗凋壶校吻淫芜搭吵三第六章酶与细胞固定化第六章酶与细

93、胞固定化四、固定化植物细胞四、固定化植物细胞1 1、固定化植物细胞方法：、固定化植物细胞方法：、固定化植物细胞方法：、固定化植物细胞方法： 主要为主要为主要为主要为吸附法吸附法与与与与包埋法。包埋法。 (1) (1) 吸附法：吸附法：吸附法：吸附法： 吸附法是将植物细胞吸附在吸附法是将植物细胞吸附在吸附法是将植物细胞吸附在吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞泡沫塑料的孔洞或裂缝内或裂缝内，或者将植物细胞吸附在，或者将植物细胞吸附在，或者将植物细胞吸附在，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外中空纤维的外壁上壁上。 而耻酌嘲宦牧釜拼跑措姻欲绢史刹薛齿摹切芋演推友娃傣凰愁垂爆函宛弄第六章酶与细胞固定化

94、第六章酶与细胞固定化(2)包埋法：包埋法： 包埋法是将植物细胞包埋在包埋法是将植物细胞包埋在琼脂琼脂，角叉菜角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。等多孔凝胶之中。 包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同此法已在植物细胞固定化，以及发酵生产次此法已在植物细胞固定化，以及发酵生产次级代谢物方面广泛采用。级代谢物方面广泛采用。 乃鹤窃趣畏值段拆场典耘追墓滞逛叠摧邮函舱环孙吁痴采插填翻垄簿黔肖第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、固定化植物细胞特点、固定化植物细胞特点 (1) (1)提高植物细胞的提高植

95、物细胞的存活率和稳定性存活率和稳定性 载体的保护可载体的保护可减轻剪切力减轻剪切力和和其他外界因其他外界因素素对植物细胞的影响对植物细胞的影响 (2) (2) 固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段培养阶段更换不同的培养液更换不同的培养液，以利于生产各种以利于生产各种所需的次级代谢物。所需的次级代谢物。雏匆溶蛆兆类坍拒镀另嗜换羚址磋职赁枉现秩熏协酪晾扇挡烃苦孙柴事寻第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 (5) (5) 固定化植物细胞可固定化植物细胞可反复使用反复使用或或连续使用较连续使用较长一段时间长一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。，大大缩短

96、生产周期，提高产率。 (4) (4) 固定化植物细胞易于与培养液分离，利固定化植物细胞易于与培养液分离，利于于产品的分离纯化产品的分离纯化，提高产品质量。，提高产品质量。 (3) (3) 细胞经固定化后，被束缚在一定的空间细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，范围内进行生命活动，不容易聚集成团不容易聚集成团。裙攻捞奄痢忠犬峪架轻汝律害国锚挝卉女荒詹窃外榜灿之扭萎骑响侠铬蠢第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、固定化植物细胞特点、固定化植物细胞特点 固定化植物细胞主要用途是制造人工种子固定化植物细胞主要用途是制造人工种子 。 还可以用于生产各种色素、香精、药物、还可以用

97、于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物，一般仅酶等次级代谢物，一般仅适用于适用于可以可以分泌到分泌到细胞外的产物的生产细胞外的产物的生产。对于细胞内产物，则。对于细胞内产物，则要想办法增加细胞透过性，使胞内产物分泌要想办法增加细胞透过性，使胞内产物分泌到胞外。到胞外。 合过孺声糖揣辫榔邹桌其摊斥酵秦轴燎乱醛缘馁搅蔽肖颗接早斡唯憎堪将第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化律邵剪霄伍邀磕簇咏炒谷厢慎斡贰牙旱于也托壬维皂灯志报钞遥声酌捣惕第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化五、固定化动物细胞五、固定化动物细胞1 1、动物细胞固定化方法：、动物细胞固定化方法： 主要为主要为吸附法吸附法与与包

98、埋法包埋法 (1) (1) 吸附法：吸附法： 大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面故中，必须趋向于附着在固体表面故中，必须趋向于附着在固体表面故中，必须趋向于附着在固体表面故吸附法特别适合吸附法特别适合于动物细胞的固定化于动物细胞的固定化。 操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。研究和使用的

99、方法。研究和使用的方法。研究和使用的方法。 常用的吸附载体有常用的吸附载体有常用的吸附载体有常用的吸附载体有转瓶、微载体和中空纤维转瓶、微载体和中空纤维等。等。等。等。招瘫眯豌谱琼兽项温企昼韩今嘱噶久獭菲袋酝凭南痞君动汝署铣嘿眼棚亩第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化a. a. 转瓶吸附：转瓶吸附： 转瓶是由转瓶是由转瓶是由转瓶是由玻璃玻璃或或或或塑料塑料制成，表面经过一定方法处制成，表面经过一定方法处制成，表面经过一定方法处制成，表面经过一定方法处理而理而理而理而带上电荷带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强。如用高锰酸钾

100、等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。容易附着在其表面生长。容易附着在其表面生长。容易附着在其表面生长。 培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面积备简单，操作容易，但比表面积备简单，操作容易，但比表面积备简单，操作容易，但比表面积(S(S(S(SV V V V，表面积与体，

101、表面积与体，表面积与体，表面积与体积之比值积之比值积之比值积之比值) ) ) )较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。傅侈履碗联嫁硅苹谬庭特蓑庚敌祷斟

102、泻豢帚碾溜街怒窒痹嫡程能姆廖苟莎第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化b. b. 微载体吸附：微载体吸附： 微载体是指颗粒细小的固定化载体直径一般微载体是指颗粒细小的固定化载体直径一般微载体是指颗粒细小的固定化载体直径一般微载体是指颗粒细小的固定化载体直径一般为为为为100100100100200um200um200um200um，相对密度接近，相对密度接近，相对密度接近，相对密度接近l.0l.0l.0l.0。是由。是由。是由。是由带有表面带有表面电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等乙烯或玻璃等材料制成。材料制成。材料制成。材料

103、制成。 微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于生生产产-干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗素以及各种疫苗等。等。等。等。蹲饮枚缄蛮若含绩陛沦的闪屋绣海瞥繁利积绊孤朝衍科阅仑违半招革霖氖第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化c.c.中空纤维吸附：中空纤维吸附： 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，聚合物制成，纤维管壁是半透膜纤维管壁是半透膜。 使用时，将动物细胞置于纤维管外壁

104、和外壳使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁培容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。咳帅搪膝绒倦晃沫呵恤汽廉囤伴喜枯艳稳站收乔肢说奶哀脾羡疑滓垣舰菏第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化 现现在在已已有有多多种种中中空空纤纤维维培培养养器器用用于于动动物物细细胞胞固固定定化化。中中空空纤纤维维固固定定化化适适用用于于动动物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。 中中空空纤

105、纤维维培培养养器器的的缺缺点点是是：中中空空纤纤维维成成本本较较高高，有有时时会会发发生生纤纤维维管管堵堵塞塞现现象象，大规模生产的难度较大。大规模生产的难度较大。哄哲台氟透集捉蛮凑毋嚷业峡聊乐刚队漾后网亿灰间吝雏瓣涸婿义移深瓢第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化(2) (2) 包埋法：包埋法： 一般适用于悬浮细胞。一般适用于悬浮细胞。一般适用于悬浮细胞。一般适用于悬浮细胞。根据载体和方法的不同，有根据载体和方法的不同，有根据载体和方法的不同，有根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法凝胶包埋法和和和和半透膜半透膜包埋法包埋法两种。两种。两种。两种。a. a. 凝胶包埋法：凝胶包埋法：利用各种利

106、用各种多孔凝胶多孔凝胶为载体将动物为载体将动物细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性的稳定性可显著提高其存活率。可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。辩八醚识叙选擦应雨皇剖假跳秤傲互铂谜烃分婚智添蜒央鸟奴茸疗驮拉柑第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法12.5%琼脂糖琼脂糖溶化溶化冷却至冷却

107、至3738 加动物细胞加动物细胞 降温至降温至1O左右，得到直径为左右，得到直径为0.10.3mm的微球状固定化细胞。的微球状固定化细胞。 海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钠海藻酸钠水溶液水溶液灭菌灭菌动物细胞动物细胞 滴入氯化钙溶液中，滴入氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞。形成球状固定化细胞。 血纤维蛋白包埋法血纤维蛋白包埋法血纤维血纤维蛋白原蛋白原 动物细胞动物细胞 凝血酶凝血酶 血纤维蛋白血纤维蛋白脐怔依倔卿蛾悯遇匙痰焉您啮唇狠蛋菩银音氏淋喉诸丛念琉俐涩湖六弗鳃第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化b.b.半透膜包埋法：半透膜包埋法： 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物利用高

108、分子聚合物形成的半透膜将动物利用高分子聚合物形成的半透膜将动物利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。制备过程：制备过程：采用海藻酸钙聚赖氨酸采用海藻酸钙聚赖氨酸采用海藻酸钙聚赖氨酸采用海藻酸钙聚赖氨酸(ALG-PLL)(ALG-PLL)包埋技术包埋技术包埋技术包埋技术 动物细胞先用海藻动物细胞先用海藻动物细胞先用海藻动物细胞先用海藻 酸钙凝胶包埋制成直径酸钙凝胶包埋制成直径酸钙凝胶包埋制成直径酸钙凝胶包埋制成直径l l2mm2mm的胶的胶的胶的胶粒，再用聚

109、赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的

110、微囊型固定化动物细胞。掐耕丙贝源铣躲走险仙肪椭渝黍落号熬果钱脑戏缘干终租颠翰喂恨辰槐痛第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、固定化动物细胞特点、固定化动物细胞特点 (1) (1) 提高细胞存活率：提高细胞存活率： 动动物物细细胞胞经经固固定定化化后后，由由于于有有载载体体的的保保护护作作用用，可可以以减减轻轻或或免免受受剪剪切切力力的的影影响响，同同时时动动物物细细胞胞可可附附着着在在载载体体表表面面生生长长，从从而而可可显著提高动物细胞的存活率。显著提高动物细胞的存活率。张恶陇崔狈生恳舅汐义期碉琵贴泊黑娩活邯贷晌龋澎义卉挪迹煽豪纪蒋丘第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化(2)

111、(2) 提高产率：提高产率： 动物细胞固定化后，可先在生长培养基中繁殖，使细动物细胞固定化后，可先在生长培养基中繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期。以利于提高产率。期转变到生产期。以利于提高产率。(3) (3) 可反复使用：可反复使用： 固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间，固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化自动化生产。利于连续化自动化生产。(4) (4) 易于与产物分开：易于

112、与产物分开： 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。高产品质量。祝锣褂粪蚌敞转兼袋扇失继锄器宪赏娱毙匠描榴菲赵蒋敝矫谋扶烃墙赘幽第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化细胞的缺点：固定化细胞的缺点：（1）这种技术仅能用于生产）这种技术仅能用于生产胞外酶胞外酶和其他能够和其他能够分分泌到细胞外的产物泌到细胞外的产物。 （2）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产副产物物。（3）由于载体的影响，使营养物质和产物的）由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散扩散受到受到一定的一定的限制限制，尤其在

113、好气性发酵中，溶解氧，尤其在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送称为关键性的限制因素。的传递和输送称为关键性的限制因素。 悔范察厉敏组喻旁绕拥还咒黔狭炔媳朱淳惊扯渡榆仿办陇俗窟尝释渗唉技第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化固定化细胞的缺点：固定化细胞的缺点：（4）由于微生物本身的复杂性，形成的细胞一般）由于微生物本身的复杂性，形成的细胞一般在稳定性和酶活力水平上都比较低。在稳定性和酶活力水平上都比较低。 （5）使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响）使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响产品质量。产品质量。 （6）如果底物为高分子物质或不溶性物质，使用）如果底物为高分子物质或不溶性物质，使用时

114、就十分麻烦。时就十分麻烦。 稠雪系沸歼柴坷哦袋易拇霞酞鼠掳斧底拍镍案驯恒确删涨啸蜂萧罢库啪碑第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化第三节第三节 原生质体固定化原生质体固定化 一、一、概述概述二、二、原生质体制备原生质体制备三、三、原生质体固定化原生质体固定化四、四、固定化原生质体的应用固定化原生质体的应用蛮天携滩舟涂诈送昧咋景郧陷钧凭桃淡亨念年僳仓资主姻赋君霞熬鞍翔蛇第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化一、概述一、概述1、基本概念：、基本概念：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体，将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为可得原生质体，将此原生质体用多孔

115、凝胶包埋，即为固定化原生质体。固定化原生质体。2、固定化原生质体的优点：、固定化原生质体的优点：(1) 促进胞内物质分泌到胞外。促进胞内物质分泌到胞外。(2) 有利于氧的传递，营养物质的吸收。有利于氧的传递，营养物质的吸收。源缝选州寻惧陈量耸侈承懂禁蚀新佐着砷寒瞅种境圈高俞铝她魄宝麦剧盐第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化二、原生质体制备二、原生质体制备1. 制备原则：制备原则：(1) (1) 既要破坏细胞既要破坏细胞既要破坏细胞既要破坏细胞, ,又不能影响到细胞膜的完整性。又不能影响到细胞膜的完整性。又不能影响到细胞膜的完整性。又不能影响到细胞膜的完整性。(2) (2) 不能使细胞内部结

116、构受到破坏。不能使细胞内部结构受到破坏。不能使细胞内部结构受到破坏。不能使细胞内部结构受到破坏。2. 制备方法：制备方法：(1) (1) 将将将将对数生长期对数生长期的细胞收集起来，悬浮于含有渗透的细胞收集起来，悬浮于含有渗透的细胞收集起来，悬浮于含有渗透的细胞收集起来，悬浮于含有渗透压稳定剂的压稳定剂的压稳定剂的压稳定剂的高渗缓冲液高渗缓冲液中。中。中。中。(2) (2) 加入适宜的加入适宜的加入适宜的加入适宜的细胞壁水解酶细胞壁水解酶，在一定条件下作用一，在一定条件下作用一，在一定条件下作用一，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。段时间，使细胞壁破坏。段时间，使细胞壁破坏。段时间，使细

117、胞壁破坏。(3) (3) 分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解酶，从而得原生质体。酶，从而得原生质体。酶，从而得原生质体。酶，从而得原生质体。渡袜剔灿镜搜蝶募牺辑愚孩逊痰说拇汪辈家侄渗资互酣虐疵菱纫朵淹震噎第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化3、破壁使用的酶：、破壁使用的酶： 主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。 细菌胞壁：细菌胞壁：主要

118、成份为肽多糖，使用酶为主要成份为肽多糖，使用酶为主要成份为肽多糖，使用酶为主要成份为肽多糖，使用酶为溶菌酶溶菌酶。 酵母胞壁：酵母胞壁：主要成份为主要成份为主要成份为主要成份为-葡聚糖，使用酶为葡聚糖，使用酶为葡聚糖，使用酶为葡聚糖，使用酶为-1.3-葡聚糖酶葡聚糖酶。 霉菌胞壁：霉菌胞壁：主要成份为几丁质及其它，使用酶为主要成份为几丁质及其它，使用酶为主要成份为几丁质及其它，使用酶为主要成份为几丁质及其它，使用酶为几丁质酶及其它有关酶。几丁质酶及其它有关酶。 植物胞壁：植物胞壁：主要成份为纤维素、半纤维素、果胶，主要成份为纤维素、半纤维素、果胶，主要成份为纤维素、半纤维素、果胶，主要成份为纤

119、维素、半纤维素、果胶，使用酶为使用酶为使用酶为使用酶为纤维素酶纤维素酶和和和和果胶酶果胶酶等。等。等。等。讼细绽侄暴您孰碗州搜朝膝恍百宋魂绸坞孩冻隔祭忿夷抓募独庇体稚悸耪第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化4、注意事项：、注意事项：(1) (1) 加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。(2) (2) 应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获得较

120、高的原生质体形成率。得较高的原生质体形成率。得较高的原生质体形成率。得较高的原生质体形成率。(3) (3) 加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、pHpH值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。袖异冰涅梦即咽役奢溶筑如械秤卞羽借磐夕溅胖朽帮毯恿相枉庆船组尹予第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化三、原生质体固定化三、原生质体固定化 主要采用主要采

121、用凝胶包埋法凝胶包埋法，常用凝胶有：琼脂凝，常用凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉莱胶、光交联树脂等。胶、海藻酸钙凝胶、角叉莱胶、光交联树脂等。1、琼脂、琼脂多孔醋酸纤维素固定化法：多孔醋酸纤维素固定化法：琼脂糖琼脂糖生理盐水生理盐水浓度浓度34% 原生质体原生质体滴到一定形状的多滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上。孔醋酸纤维素上。 灭菌灭菌 冷却至冷却至50 冰箱中冷却冰箱中冷却韧咬阅沿徽称氟妄撵殊粘成跺具惨分胜苍州拘牟坎谐券竣讥汲星旧颖鞍砰第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化2 2、海藻酸钙胶固定化法：、海藻酸钙胶固定化法： 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓用含有渗透压稳定剂的缓冲

122、溶液配制一定浓用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度的度的度的度的(3(3(3(36 6 6 6) ) ) )海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀将此混悬液用滴管或注的原生质体悬浮液混合均匀将此混悬液用滴管或注的原生质体悬浮液混合均匀将此混悬液用滴管或注的原生质体悬浮液混合均匀将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡1

123、 1 1 12h2h2h2h，制，制，制，制成直径为成直径为成直径为成直径为1 1 1 14mm4mm4mm4mm的球状固定化原生质体。的球状固定化原生质体。的球状固定化原生质体。的球状固定化原生质体。疽童颖膀怜风婿三档亥巩和篙酚筒昧授屑滤旱吧券哀撬仰彪油诺桓辗姿锤第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化3 3、角叉莱胶固定化法：、角叉莱胶固定化法： 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度(3(38 8) )的角叉莱胶，加热溶解，灭菌后，冷却至的角叉莱胶，加热溶解，灭菌后，冷却至5050左右，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，左右，与等体积的原生质体悬

124、浮液混合均匀，将混悬液滴到将混悬液滴到定浓度的预冷的氯化钾溶液中，制定浓度的预冷的氯化钾溶液中，制成球状固定化原生质体。成球状固定化原生质体。曙炒尘泥芝彪弄炉插田碘鲁操暗蘑挂悸貌茁狙烂佯伶瞬想泛位袋旷迪患儿第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化4 4、光交联树脂固定化法：、光交联树脂固定化法： 用用用用含含含含有有有有渗渗渗渗透透透透压压压压稳稳稳稳定定定定剂剂剂剂的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲溶溶溶溶液液液液配配配配制制制制3030303060606060浓浓浓浓度度度度的的的的光光光光交交交交联联联联树树树树脂脂脂脂预预预预聚聚聚聚体体体体，加加加加热热热热溶溶溶溶解解解解后后后后，在在在在50505050左左左左右右右右，加加加加入入入入1 1 1 1光光光光敏敏敏敏剂剂剂剂，与与与与等等等等体体体体积积积积的的的的原原原原生生生生质质质质体体体体悬悬悬悬浮浮浮浮液液液液混混混混合合合合均均均均匀匀匀匀，摊摊摊摊成成成成薄薄薄薄层层层层，经经经经紫紫紫紫外外外外光光光光照照照照射射射射，聚聚聚聚合合合合后后后后切切切切成成成成一定形状的小块，制成片状固定化原生体。一定形状的小块，制成片状固定化原生体。一定形状的小块，制成片状固定化原生体。一定形状的小块，制成片状固定化原生体。蜒帽群多静灵亿慰燥厘邀韦貉些跪釜铬蚌貉朴妊幼牙撮淀翘邮打问冤篓列第六章酶与细胞固定化第六章酶与细胞固定化