第二章蛋白质的检测和分离

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1、第三章第三章 蛋白质的分离蛋白质的分离提纯及检测提纯及检测第一节第一节 引言引言第二节第二节 前处理前处理第三节第三节 蛋白质的粗分离蛋白质的粗分离第四节第四节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离第五节第五节 蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离第六节第六节 蛋白质的结晶蛋白质的结晶第七节第七节 蛋白质的检测蛋白质的检测 第一节第一节 引言引言一、蛋白质的存在一、蛋白质的存在蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。生物体最基本的结构物质和功能物质。一般蛋白质，酶、抗体、激素蛋白、毒素一般蛋白质，酶、抗体、激素蛋白、毒素蛋白等蛋白等存在

2、部位存在部位器官、组织、体液器官、组织、体液胞内、胞外胞内、胞外一、蛋白质的存在一、蛋白质的存在存在形式存在形式游离状态游离状态 消化液中的蛋白消化液中的蛋白结合状态结合状态 蛋白与蛋白蛋白与蛋白 蛋白与非蛋白蛋白与非蛋白二、为什么要分离提纯蛋白质二、为什么要分离提纯蛋白质? ?1 1、农业生产的需要、农业生产的需要(1)(1)对农副产品的综合利用需要高活性的酶制对农副产品的综合利用需要高活性的酶制剂。剂。(2)(2)用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中某用酶分析法测定家畜家禽以及农作物中某种物质的含量，需要用高纯度的酶制剂。种物质的含量，需要用高纯度的酶制剂。 二、为什么要分离提纯蛋白质二、为

3、什么要分离提纯蛋白质? ?2 2、工业生产的需要、工业生产的需要食品、发酵、纺织、制革等工业，需要食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂大量的高活性的酶制剂。淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶酶、溶菌酶、葡萄糖异构酶二、为什么要分离提纯蛋白质二、为什么要分离提纯蛋白质? ?3 3、医疗上的需要、医疗上的需要人尿激酶治疗脑血栓人尿激酶治疗脑血栓用猪心细胞色素用猪心细胞色素C C治疗脑震荡心力衰竭治疗脑震荡心力衰竭用猪胰岛素治疗糖尿病用猪胰岛素治疗糖尿病二、为什么要分离提纯蛋白质二、为什么要分离提纯蛋白质? ?4 4、蛋白质

4、结构与功能研究及基因工程研究、蛋白质结构与功能研究及基因工程研究的需要的需要均一的蛋白制剂均一的蛋白制剂工具酶工具酶高纯度的标准蛋白高纯度的标准蛋白三、对蛋白质分离提纯的要求三、对蛋白质分离提纯的要求1 1、纯度、纯度决定于研究的目的和应用上的要求决定于研究的目的和应用上的要求2 2、活性、活性要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物活性活性3 3、收率、收率收率越高越好收率越高越好提纯步骤愈多，则损失愈大提纯步骤愈多，则损失愈大作为均一制剂，一般收率在作为均一制剂，一般收率在5-205-20，最高可以，最高可以达到达到5050左右。左右。四、蛋白质分离

5、提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序 准备工作：准备工作： 1 1、选材，处理；、选材，处理；2 2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法；、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法；3 3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法；、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法；4 4、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率；离提纯步骤的提纯倍数和收率；5 5、建立鉴定纯度的方法、建立鉴定纯度的方法( (如：如：SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等电泳、等电聚焦等) )，以鉴定蛋白质制剂的纯度，以鉴定蛋白质制剂的纯度。四、蛋

6、白质分离提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序蛋白质分离提纯的四个阶段：蛋白质分离提纯的四个阶段：第一阶段第一阶段( (前处理前处理) )：选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。胞胞外蛋白不须细胞破碎。外蛋白不须细胞破碎。第二阶段第二阶段( (粗分级粗分级) )：根据不同蛋白质的溶解度差异，采用适当的沉淀法，根据不同蛋白质的溶解度差异，采用适当的沉淀法，对所需蛋白质进行初步的分离提纯。对所需蛋白质进行初步的分离提纯。如：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变如：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、选择性变性法，以及选择性沉淀法等。性法，以

7、及选择性沉淀法等。适合于处理大量的样品溶液。适合于处理大量的样品溶液。四、蛋白质分离提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序第三阶段第三阶段( (细分级细分级) )：经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的经过粗分离得到的蛋白质制剂是不纯的细分级可以采用适当的细分级可以采用适当的柱层析法柱层析法。如：离子交换柱层析如：离子交换柱层析(DEAE-(DEAE-纤维素、纤维素、CM-CM-纤维素纤维素) )、分子筛层析、分子筛层析( (SephadexSephadex) )、吸附层析、吸附层析( (羟基磷灰石羟基磷灰石) )、疏水吸附层析、亲和层、疏水吸附层析、亲和层析、抗原抗体法等。析、抗原抗体法等。

8、柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好，但不能处理大量的样柱层析法对蛋白质的分离提纯效果很好，但不能处理大量的样品溶液品溶液制备性聚丙烯酰胺制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳，或，或蔗糖密度梯度等电聚蔗糖密度梯度等电聚焦法焦法进一步提纯。进一步提纯。此二法只能处理少量样品，所以在提纯的后期使用，比较合适。此二法只能处理少量样品，所以在提纯的后期使用，比较合适。采用采用结晶法结晶法对蛋白质进一步提纯。对蛋白质进一步提纯。蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以，结晶法是蛋白质制剂必须达到较高纯度才能进行结晶。所以，结晶法是在提纯的后期使用的。在提纯的后期使用的。四、蛋白质分离提纯的一般程序四、蛋白

9、质分离提纯的一般程序第四阶段第四阶段( (质量鉴定质量鉴定) )：纯度、浓度：纯度、浓度SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法、蛋白质化学结构分析法等。化学结构分析法等。一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂一般需要用两种或更多的方法鉴定蛋白质制剂的纯度。的纯度。经常使用经常使用FolinFolin- -酚法，双缩脲法、紫外吸收法酚法，双缩脲法、紫外吸收法考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。测定蛋白质浓度。酶需要测定比活力及酶溶液的蛋白质浓度。酶需要测定比活力及酶

10、溶液的蛋白质浓度。四、蛋白质分离提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序防止蛋白质变性的措施：防止蛋白质变性的措施：1 1、低温、低温(0(0一一4)4)操作，防止热变性和蛋操作，防止热变性和蛋白水解酶水解。白水解酶水解。2 2、严格控制、严格控制pHpH值，防止过酸过碱对蛋白质值，防止过酸过碱对蛋白质的变性作用。的变性作用。3 3、搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋、搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。白质变性。四、蛋白质分离提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序防止蛋白质变性的措施：防止蛋白质变性的措施： 4 4、防止蛋白质自发变性，可以采取下列措施：、防止蛋白质自发变性，可

11、以采取下列措施：(1)(1)加入低分子量物质加入低分子量物质( (如蔗糖和甘油等如蔗糖和甘油等) )或加入纯化的或加入纯化的蛋白质蛋白质( (如牛血清白蛋白、明胶等如牛血清白蛋白、明胶等) )，以提高蛋白质浓，以提高蛋白质浓度，减少水的伤害。度，减少水的伤害。(2)(2)少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性，可以加持活性，可以加KCIKCI，或，或NaClNaCl，(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4。(3)(3)有的蛋白质需要加入二价金属离子有的蛋白质需要加入二价金属离子( (如如MgMg2+2+、CaCa2+2+等等) )才

12、能保持稳定性。才能保持稳定性。(4)(4)某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。四、蛋白质分离提纯的一般程序四、蛋白质分离提纯的一般程序需要额外注意的两个问题：需要额外注意的两个问题：天然构象的保持天然构象的保持多亚基多功能寡聚酶多亚基多功能寡聚酶第二节第二节 前处理前处理 一、材料的选择一、材料的选择二、细胞破碎二、细胞破碎三、抽提三、抽提第二节第二节 前处理前处理 一、材料的选择一、材料的选择选材的原则是：选材的原则是：(1)(1)材料中所需蛋白质的含量要高；材料中所需蛋白质的含量要高；(2)(2)材料易得。材料易得。一、材料的选择一、材料

13、的选择材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关：材料中蛋白质含量的多少与下列因素有关：种属差异种属差异，如人与牛的同一种蛋白质，其，如人与牛的同一种蛋白质，其含量常常相差十倍之多；含量常常相差十倍之多；个体差异个体差异，在不同个体中，蛋白质含量也，在不同个体中，蛋白质含量也有明显的不同；有明显的不同；由于由于性别、年龄、季节、饲料条件性别、年龄、季节、饲料条件的不同，的不同，蛋白质的含量也会发生变化。蛋白质的含量也会发生变化。一、材料的选择一、材料的选择从实验动物体内取材时，要注意三点：从实验动物体内取材时，要注意三点：(1)(1)要注意动物本身的生理特征；要注意动物本身的生理特征；(2)(2)要

14、尽可能在接近正常状态下取出器官或要尽可能在接近正常状态下取出器官或组织；组织；(3)(3)死后的变化要限制在最小限度内，为此死后的变化要限制在最小限度内，为此必须迅速取出器官或组织，充分脱血，立必须迅速取出器官或组织，充分脱血，立即使用，或放在即使用，或放在-10-10-50-50的冷库中冻的冷库中冻存。存。 二、细胞破碎二、细胞破碎根据实验材料的性质，选择破碎方法根据实验材料的性质，选择破碎方法肝、脑、肾、脾等软组织，容易破碎，可以用匀肝、脑、肾、脾等软组织，容易破碎，可以用匀浆器研磨；浆器研磨；肌肉不易破碎，可以先用绞肉机绞碎，然后用组肌肉不易破碎，可以先用绞肉机绞碎，然后用组织捣碎机粉碎

15、；织捣碎机粉碎；红血球，其细胞膜脆弱，可以用低渗透压法破碎。红血球，其细胞膜脆弱，可以用低渗透压法破碎。植物细胞，韦林氏捣切器、压榨机、石英砂研磨。植物细胞，韦林氏捣切器、压榨机、石英砂研磨。 酵母和细菌细胞，可用法兰西压榨机酵母和细菌细胞，可用法兰西压榨机( (FrenchpressFrenchpress) )、MantonMantonGaulinGaulin匀浆器、振动研匀浆器、振动研磨机、超声波破碎、反复冻融法。磨机、超声波破碎、反复冻融法。化学法（去垢剂）、生物学方法（溶菌酶）。化学法（去垢剂）、生物学方法（溶菌酶）。 二、细胞破碎二、细胞破碎检查细胞的破碎程度的方法：检查细胞的破碎程

16、度的方法：(1)(1)显微镜观察；显微镜观察；(2)(2)用分度管检查用分度管检查将破碎细胞的悬浮液装于分度管中，离心将破碎细胞的悬浮液装于分度管中，离心3 3分分钟，未碎的完整细胞首先沉降，在它上面是细钟，未碎的完整细胞首先沉降，在它上面是细胞碎片，再上面是细胞质部分。每一层的相对胞碎片，再上面是细胞质部分。每一层的相对含量即表示细胞破碎程度。含量即表示细胞破碎程度。三、抽提三、抽提 抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中。在适当的溶剂中。 根据所需蛋白质溶解性，采用适当的根据所需蛋白质溶解性，采用适当的溶剂抽提。溶剂抽提。 水溶性的水溶性的清蛋白清蛋

17、白( (如：血清白蛋白、卵清蛋白等如：血清白蛋白、卵清蛋白等) )可以用水抽提；可以用水抽提；不溶于水的盐溶性不溶于水的盐溶性球蛋白球蛋白( (如：血红蛋白、肌红如：血红蛋白、肌红蛋白等蛋白等) )可以用稀中性盐溶液可以用稀中性盐溶液( (如如0.1MNaCl0.1MNaCl) )抽提；抽提；三、抽提三、抽提不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的米谷蛋白米谷蛋白和麦谷蛋白和麦谷蛋白，可以用稀碱溶液抽提；，可以用稀碱溶液抽提；不溶于水和中性盐溶液，但能溶于不溶于水和中性盐溶液，但能溶于70708080乙醇乙醇溶液中的溶液中的醇溶蛋白醇溶蛋白( (如醇溶谷蛋白如醇溶谷

18、蛋白) )，可以用，可以用70708080乙醇溶液抽提；乙醇溶液抽提；脂蛋白脂蛋白要用表面活性剂要用表面活性剂( (即洗涤剂即洗涤剂) )才能抽提出来，才能抽提出来，膜蛋白膜蛋白往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。不溶性蛋白不溶性蛋白，如角蛋白、胶原、丝心蛋白，可以，如角蛋白、胶原、丝心蛋白，可以用适当的溶剂洗去可溶物。用适当的溶剂洗去可溶物。 三、抽提三、抽提使用类似于生理条件下的缓冲液使用类似于生理条件下的缓冲液202050mmol/L50mmol/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH7.0(pH7.07.5)7.5)0.1mol/L Tris-HCI(

19、pH7.5)0.1mol/L Tris-HCI(pH7.5)含少量缓冲液的含少量缓冲液的0.1mol/LKCl0.1mol/LKCl必要时，可加入必要时，可加入EDTA(1EDTA(15mmol/L)5mmol/L)，巯基乙醇，巯基乙醇(3-20mmol/L)(3-20mmol/L)或蛋白质稳定剂等。或蛋白质稳定剂等。三、抽提三、抽提抽提的原则是：抽提的原则是：少量多次少量多次。 三、抽提三、抽提抽提过程中需要注意：抽提过程中需要注意：低温低温(0-4)(0-4)抽提抽提；抽提蛋白水解酶时，须抽提蛋白水解酶时，须加入抑制剂加入抑制剂；如：以如：以SerSer为活性中心的酶，加二异丙基氟磷酸为活

20、性中心的酶，加二异丙基氟磷酸(DFP)(DFP)，以巯基为活性中心的酶，加对氯汞苯甲酸，以巯基为活性中心的酶，加对氯汞苯甲酸(PCMB)(PCMB)。抽提含有活性巯基的蛋白质时，要抽提含有活性巯基的蛋白质时，要保护巯基保护巯基不要带入金属离子，可加入金属螯合剂，如不要带入金属离子，可加入金属螯合剂，如EDTAEDTA；不要带进氧化剂，可加入还原剂，如抗坏血酸等；不要带进氧化剂，可加入还原剂，如抗坏血酸等；三、抽提三、抽提抽提过程中需要注意：抽提过程中需要注意： 抽提带非共价键结合的配基的蛋白质时，要抽提带非共价键结合的配基的蛋白质时，要保保护配基护配基，不要使其丢失；，不要使其丢失；选择抽提条

21、件时应考虑，尽量选择抽提条件时应考虑，尽量减少减少非蛋白质非蛋白质杂杂质质被同时抽提出来；被同时抽提出来；如实验材料含有大量的脂肪，为了避免它干扰如实验材料含有大量的脂肪，为了避免它干扰以后的分离提纯操作，须用有机溶剂以后的分离提纯操作，须用有机溶剂( (如：丙酮、如：丙酮、石油醚石油醚) )萃取，以萃取，以去除脂肪去除脂肪。三、抽提三、抽提抽提过程中需要注意：抽提过程中需要注意： 防止防止植物组织中的植物组织中的多酚物质，氧化褐变多酚物质，氧化褐变，干扰，干扰蛋白质的分离提纯。蛋白质的分离提纯。对植物组织使用较高浓度的缓冲液作为抽提液，对植物组织使用较高浓度的缓冲液作为抽提液，防止防止植物细

22、胞的植物细胞的内含物改变抽提液的内含物改变抽提液的pHpH值值。抽提外周膜蛋白时，必须用含有抽提外周膜蛋白时，必须用含有EDTAEDTA的适当缓的适当缓冲液；抽提内嵌膜蛋白时，必须用去污剂作增溶冲液；抽提内嵌膜蛋白时，必须用去污剂作增溶剂。剂。可用高速离心法和过滤法可用高速离心法和过滤法( (添加适当的助滤剂添加适当的助滤剂) )使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸，可用核使粗提液澄清。粗提液中如有大量核酸，可用核酸酶或用鱼精蛋白去除。酸酶或用鱼精蛋白去除。第三节第三节 蛋白质的粗分离蛋白质的粗分离根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质的溶解度差异分离根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质分子大小

23、的差异分离1.盐析法盐析法 原理原理：是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。 优点优点：沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。一、一、根据蛋白质溶解性的差异分离根据蛋白质溶解性的差异分离2.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法选择原则：选择原则：与水完全混溶与水完全混溶 不与蛋白质反应不与蛋白质反应 有较好的沉淀效应有较好的沉淀效应 溶剂蒸气无毒、不易燃溶剂蒸气无毒、不易燃原理原理：是将有机溶剂（丙酮、乙醇是将有机溶剂（丙酮、乙醇) )加入蛋白质溶液加入蛋白质溶液中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电

24、荷之间中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电荷之间的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。集和沉淀。 有有机机溶溶剂剂优点：优点：比盐析法分辨率高，提纯效果好，比盐析法分辨率高，提纯效果好，生产中应用多。生产中应用多。注意事项：注意事项：使用丙酮沉淀时，必须在使用丙酮沉淀时，必须在0 044下进行。下进行。丙酮用量一般丙酮用量一般1010倍于蛋白质溶液倍于蛋白质溶液体积。体积。蛋白质被蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分丙酮沉淀后，应立即分离，防止变性。离，

25、防止变性。3.有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法水溶性中性高聚物水溶性中性高聚物聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）聚丙烯酸聚丙烯酸碱性蛋白质碱性蛋白质4.选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法极端条件极端条件热、热、pHpH、有机溶剂、有机溶剂等电点沉淀等电点沉淀氯仿氯仿血红蛋白血红蛋白免疫沉淀免疫沉淀抗原抗体特异结合形成不溶性复合物抗原抗体特异结合形成不溶性复合物1.透析透析透析透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂只用于除盐类和小分子杂质质二、二、根据蛋白质分子大小的差异分离根据蛋白质分子

26、大小的差异分离2.2.超过滤：超过滤：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加加压压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜超滤液超滤液支持膜的栅板支持膜的栅板滴加样品滴加样品4%8%12%16%20%塑料离心管塑料离心管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度（介质还可用：氯化铯、甘油等）（介质还可用：氯化铯、甘油等）蔗糖浓度蔗糖浓度%分分子子量量由由小小 大大3.3.密度梯度离心密度梯度离心：蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的蛋白质

27、颗粒沉降不仅决定于它的大小，也决定于它的密度。若它在具有密度梯度的介大小，也决定于它的密度。若它在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的较快，每种质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的较快，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时，即蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时，即停止不前。停止不前。第四节第四节 蛋白质的层析分离蛋白质的层析分离层析技术也称色谱法层析技术也称色谱法(chromatography)(chromatography)，是，是19061906年俄年俄国植物学家国植物学家Michael Michael TswettTswett发现并命名的。他将植发现并命

28、名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为此得名为“色谱法色谱法”。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。19411941年，英国生物学家年，英国生物学家MartinMartin和和SyngeSynge首先提出了色谱首先提出了色谱塔板理论。塔板理论。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、纸层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析、纸层析、薄层层析、

29、亲和层析、凝胶层析等。一、一、层析概述层析概述二、离子交换层析二、离子交换层析三、凝胶过滤层析三、凝胶过滤层析四、疏水层析四、疏水层析五、亲和层析五、亲和层析六、吸附层析六、吸附层析七、聚焦层析七、聚焦层析八、高效液相层析八、高效液相层析（一）层析的原理（一）层析的原理 层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异理化性质存在差异，与两相发生相互作用（与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合吸附、溶解、结合等）的能力不同，等）的能力不同，在在两相中的分配（含量

30、对比）不同两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。的目的。一、层析概述一、层析概述 层析分离蛋白质的原理层析分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离

31、蛋白质的目的以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 （二）层析的分类（二）层析的分类 按固定相固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析 根据流动相的形式：根据流动相的形式： 液相层析、气相层析液相层析、气相层析 凝胶过滤凝胶过滤原理原理吸附层析吸附层析疏水层析疏水层析分配层析分配层析亲和层析亲和层析离子交换离子交换（三）层析前蛋白质处理（三）层析前蛋白质处理 主要是利用主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理

32、量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。分辨率低。（四）层析基本操作过程（四）层析基本操作过程 装置选择装置选择上样和洗脱上样和洗脱结果检测结果检测 上样均一性上样均一性 洗脱装置洗脱装置目的不同目的不同 检测方法不同检测方法不同活性检测活性检测基质均匀性基质均匀性柱层析的柱层析的L/d比值比值1、柱层析的、柱层析的L/d比值比值 2、洗脱装置、洗脱装置v 不改变溶剂体系不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵蠕动泵或恒流泵维持流速恒定

33、的简易装置维持流速恒定的简易装置 改变溶剂系统改变溶剂系统 分级洗脱分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析 改变溶剂系统 梯度洗脱梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接

34、近的蛋白质。线性梯度洗脱装置性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱3、结果检测、结果检测活性检测 比活没有提高没有提高 目的蛋白与杂蛋白并并没有分开没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低活性回收很低 目的蛋白有损失损失或有失活失活现象测定蛋白质一级结构一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性结果保存薄层层析&纸层析 照相保存 扫描仪转为图形 积分仪变成数据柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理4、层析装置的仪器化、层析装置的仪器化HPLCv与微机、质谱等连用二、离子交换层析二、离子交换层析 (ion exchange chromatography，IEX) （一）原理（一

35、）原理离离子子交交换换层层析析(ion exchange chromatography，IEX) 技技术术是是以以离离子子交交换换纤纤维维素素或或以以离离子子交交换换葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶为为固固定定相相，以以蛋蛋白白质质等等样样品品为为移移动动相相，分分离离和和提提纯纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。原原理理：利利用用蛋蛋白白质质的的电电荷荷和和层层析析载载体体的的电电荷荷间间的的相相互互作用，进而达到分离纯化的目的。作用，进而达到分离纯化的目的。惰性支持物惰性支持物( (高分子聚合物基质高分子聚合物基质) )解离基团解离基团( (配基配基)

36、 )共价结合u平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。u阳离子交换剂阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用u阴离子交换剂：阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用 pH值的影响值的影响 NH3RCOOH +NH3RCOO+-RNH2COO -Low pHPositive chargeHigh pHNegative chargeHydrogen gainedHydrogen lost离子溶度影响离子溶度影响 离子浓度增加 +离子取代顺序离子取代顺序（二）离子交换剂的基本类型（二）离子交换剂

37、的基本类型根据可供交换的离子性质：n阳离子交换剂n阴离子交换剂按解离基团的解离pH值：n强酸型交换剂n强碱型交换剂n弱酸型交换剂n弱碱型交换剂 配基结构pK分类简称硫酸基(sulphate)-OSO3H2强酸S磺酸基(sulphonate)-(CH2)nSO3H2强酸SM(n=1)，SE(n=2)，SP(n=3)，SB(n=4)磷酸基(phosphate)-OPO3H29强碱Q，QAE离子交换剂的基质离子交换剂的基质 琼脂糖琼脂糖离子交换剂离子交换剂 离子交换离子交换交联葡聚糖交联葡聚糖聚苯乙烯聚苯乙烯离子交换离子交换纤维素纤维素 1 1、离子交换纤维素、离子交换纤维素交换剂名称（纤维素）作

38、用 基 团特 点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)3氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在pH4以上磷酸P-O-PO2 用于低pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基SE-O-C2H4-SO3强酸性用于极低pH常用：常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）纤维素（羧甲基纤维素）优点：优点：u开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，吸附容量大，通透性好，大分

39、子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。实际交换容量要比离子交换树脂大的多。u亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。不致引起生物大分子物质的变性和失活。 u回收率高回收率高 缺点：缺点：u交换剂膨胀交换剂膨胀 2 2、交联葡聚糖、交联葡聚糖类型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl3.00.4QAE-sephad

40、exA-50CM-sephadexC-25弱碱性、阳离子交换剂CMNa+4.50.5CM-sephadexC-50SP-sephadexC-25强碱性、阳离子交换剂SPNa+2.30.3SP-sephadexC-50 优点：优点：u不会引起被分离物质的变性或失活u非特异性吸附u交换容量大 u同时具有分子筛效应离子交换葡聚糖的选用：离子交换葡聚糖的选用： 一般根据蛋白质的分子量而定u中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50u低分子量（30000）和高分子量（200000） 均宜选用A25和C25。3 3、琼脂糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂 交换剂名称特点阴离子交换剂DEAE-S

41、epharouseCL-6B弱碱性pH:2-14DEAE-SepharouseFastFLow阳离子交换剂CM-SepharouseCL-6B弱酸性pH:2-14优点：优点：对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大交换剂坚硬，颗粒呈微球型，分辨率高流速快，吸附量大特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离 4、聚苯乙烯、聚苯乙烯阴离子交换剂 AmberliteIRA&Dowexeg.Dowex4-100阳离子交换剂 AmberliteIRC&Dowex强阴离子交换剂交联度为4%颗粒度为50-100目5、其他、其他聚乙烯醇DEA

42、E-Toyopearl&CM-Toyopearl富羟基富羟基 高亲水性高亲水性兼性离子交换剂基质上连有-丙氨酸丙氨酸、对氨基苯磺酸氨基苯磺酸、精氨酸精氨酸等偶极离子 （三）基本操作（三）基本操作 缓冲液的选择 层析柱的选择 洗脱流速加样 洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定 离子交换剂的清洗、再生和保存 离子交换剂的处理 离子交换剂的选择 1、离子交换剂的选择、离子交换剂的选择配基的选择配基的选择 取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型常用弱酸型或弱碱型离子交换剂或弱碱型离子交换剂。u 基质的

43、选择基质的选择价格分辨率和稳定性特点纤维素离子交换剂较低较低适于初步分离和大量制备葡聚糖离子交换剂适中适中受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率琼脂糖离子交换剂较贵较高稳定、分辨率高、吸附量大 颗粒大小颗粒大小 分辨率平衡时间流速应用小颗粒高长慢需要高分辨率的分析或分离大颗粒低短快分辨率要求不高的大规模制备性分离2、离子交换剂的处理、离子交换剂的处理酸碱浸泡酸碱浸泡 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。u 膨化膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基

44、充分暴露出来。u水悬浮水悬浮去除杂质和细小颗粒3、缓冲液的选择、缓冲液的选择离子强度和pH 保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定； 注意注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。 缓冲液不能干扰洗脱液的测定。4、层析柱的选择、层析柱的选择亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结洗脱后再结合于交换剂上的概率增加合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液

45、的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动速率从柱上向下移动，如果柱细长柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为1520cm。5、上样、上样样品应与起始缓冲液有相同的相同的pH和离子强度和离子强度 离子强度应低离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的上样量为交换剂交换总量的1-5。 6、洗脱、洗

46、脱洗脱液洗脱液p改变溶液的改变溶液的pH或改变离子强度或改变离子强度 当使用阴离子交换剂阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，则降低pH值。当使用阳离子交换剂阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高pH值p亲和洗脱亲和洗脱目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用特异性相互作用而被置换置换p添加置换剂添加置换剂能置换置换基质上所有蛋白质所有蛋白质洗脱方法洗脱方法 阶段洗脱和梯度洗脱 洗脱速度洗脱速度 洗脱速度通常要保持恒定恒定 洗脱速度慢：分辨率高，但洗脱峰宽 洗脱速度快：洗脱峰窄，但分辨率下降7、洗脱液的监测收集及组分鉴定、洗脱液的监测收集及组分鉴定监测监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光

47、吸收收集收集 用分步收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等8、离子交换剂的清洗、再生和保存、离子交换剂的清洗、再生和保存 清洗清洗p可溶于碱的污染物 0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。p对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤 可以除去脂类和其他的疏水性物质。清洗清洗p金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCl（即pH=2）处理柱子p沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲

48、液洗涤。 再生再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡：阳离子型交换剂最后用NaOH处理，阴离子型交换剂最后用HCl处理。保存保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮钠，4C下保存。（四）应用实例（四）应用实例阴离子交换层析 从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG) 25mmolL的乙酸钠缓冲液充分透析血浆 用乙酸将血浆的pH调至5.2 ，除去沉淀 上阴离子交换柱 pH5.2的乙酸缓冲液洗脱等电点较高的IgGpH为4.5的同样浓度的同一缓冲液，以阶段洗脱的方式得到HSA 降低pH至4.0，同时升高缓冲液的浓度

49、至150mmol/L，洗脱得到其他的糖蛋白 用DEAE-SepharoseCL-6B柱大量分级人血浆蛋白 阳离子交换层析阳离子交换层析 用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份 表鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析级分中的蛋白质pI洗脱缓冲液的pH洗脱峰pH产量（mg）活性回收（%）A拟卵粘蛋白3.9-4.34.34.342.287B拟卵粘蛋白3.9-4.34.44.40.9C卵蛋白A14.584.554.5173.889D卵蛋白A24.654.754.6537.2E卵蛋白A34.755.04.8511.0F“球蛋白”5.55.23.6G卵转铁蛋白6.5-6.86.05.842.587H

50、卵转铁蛋白6.5-6.86.76.116.1I“球蛋白”8.58.07.5J“球蛋白”9.59.32.4K“球蛋白”10.09.41.1L抗生物素蛋白1010.09.50.939M“球蛋白”10.09.91.2N溶菌酶10.010.02.192三、凝胶过滤层析三、凝胶过滤层析(exclusion chromatography) 凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多多孔的载体对不同孔的载体对不同体积和不同形状体积和不同形状分子的排阻能力分子的排阻能力的不同的不同，从而对混合物进行分离。优点：优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果

51、好缺点：缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差（一）原理（一）原理 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可小分子可以进入凝胶网孔以进入凝胶网孔，而而大分子则排阻大分子则排阻于颗粒之外于颗粒之外。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱 1、体积参数、体积参数 分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd(Ve-Vo)

52、ViVeVe 洗脱体积洗脱体积Vo Vo 外水体积外水体积Vi Vi 内水体积内水体积Ve=Vo该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。VeVi+Vo该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低。一般物质的Kd值是0Kdl。 洗脱行为可以有三种可能的情况洗脱行为可以有三种可能的情况: : 凝胶凝胶Kd0Kd=l0Kd9810(100)SephadexG-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)SephadexG-25粗中粗细超

53、细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40

54、-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)2、琼脂糖系列、琼脂糖系列 较常用的是较常用的是Pharmacia和和BioRad两家的产品，前者生两家的产品，前者生产的称为产的称为Sepharose，后者的产品为，后者的产品为BioGel A。BioGel A 系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和细三档，它们的颗粒度分别为细三档，它们的颗粒度分别为l50m300

55、m，80m150m和和40m80m 。 3、聚丙烯酰胺系列、聚丙烯酰胺系列 由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物质。 先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N-甲叉双丙烯酰胺交联，得到商品化的凝胶，产物也是固体粉末，用前先溶涨。 较常用的是较常用的是Pharmacia和和BioRad两家的产品，两家的产品，前者生产的称为前者生产的称为Sephacryl ，后者的产品为，后者的产品为BioGel P。4、多孔硅胶、多孔硅胶v优点：优点： 物理化学稳定性高稳定性高，耐热耐压耐热耐压，使用，使用寿命长寿命长v缺点：缺点： 柱效较低柱效较低 、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性吸附性、不能在强

56、碱性环境中使用 刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒（三）基本操作（三）基本操作 凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存 1、凝胶的选择、凝胶的选择 分组分离 根据样品中的大分子和小分子分配系数分配系数上的显著差异上的显著差异，将其分开。 可选用SephadexG-25和G-50小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。分级分离 将样品中一些分子量比较近似分子量比较近似的物质进行分离。 选用分级范围较窄分级范围较窄的凝胶，且中间值 接近于目的蛋白的分子量 凝胶颗粒大小的选择凝胶颗粒大小

57、的选择优点缺点小颗粒分离效果好流速慢 分离时间长大颗粒流速快区带扩散 洗脱峰平而宽2、凝胶柱的制备、凝胶柱的制备 用于分组分离 短而粗 L/D值10 用于分级分离 L/D值比较大对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内，小于1cm产生管壁效应管壁效应，大于5cm则稀稀释现象释现象严重。 v柱L/D值的选择装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液充分溶胀。充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质有色的物质，如如蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白、血红蛋白等上柱，以检等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。测

58、凝胶柱的均匀程度。 3、上样、上样分组分离加样体积约为凝胶柱床体积的1025分级分离 加样体积约为凝胶柱床体积的154、洗脱、洗脱水 分离不带电荷不带电荷的中性物质电解质溶液（酸、碱、盐的溶液 ） 分离带电基团带电基团的样品水与有机溶剂的混合液（水-甲醇、水-乙醇、 水-丙酮） 用于吸附较强吸附较强的组分v洗脱液洗脱液5、凝胶柱的重复使用与保存、凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可以加入新的当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可以加入新的样品，继续使用。样品，继续使用。保存液相中保存：于凝胶悬液中加入液相中保存：于凝胶悬液中加入防腐剂防腐剂或或高压灭菌高压灭菌后后 4保存。

59、保存。在半收缩状态下保存：在半收缩状态下保存：60%-70%酒精酒精液洗冲，凝胶液洗冲，凝胶体体积缩小后冷藏或常温保存。积缩小后冷藏或常温保存。干燥状态保存：长期不用，水洗净后，用含乙醇的水洗，干燥状态保存：长期不用，水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇的乙醇 洗，干燥后常洗，干燥后常温保存。温保存。（四）凝胶层析的应用（四）凝胶层析的应用 脱盐脱盐分离提纯分离提纯测定高分子物质的分子量测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩蛋白质复性研究蛋白质复性研究1、脱盐、脱盐将高分子溶液中的低分子量杂质除去，这一操作称为将高分子溶液中的低

60、分子量杂质除去，这一操作称为脱盐。可以用凝胶层析法。脱盐。可以用凝胶层析法。优点：优点： 操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性适用的凝胶：适用的凝胶： SephadexG-10、15、25或或Bio-Gel-p-2、4、6 用用醋酸铵等挥发性盐类醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡缓冲液使层析柱平衡上样上样用同样缓冲液洗脱用同样缓冲液洗脱收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类对于盐浓度低时易沉淀的蛋白质：对于盐浓度低时易沉淀的蛋白质：2、分离提纯、分离提纯凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。凝胶过滤

61、的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。每种规格都有其特定的分级的范围，每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组范围一旦超出分组范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但载体载体的排阻情况基本相同的排阻情况基本相同，就，就不能分离不能分离。在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用的凝胶过滤的基质的凝胶过滤的基质。 天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-50柱柱(1.8cm100 cm)用用50m mol/LTris-HC

62、l, pH 7.8缓冲液平衡缓冲液平衡天花粉硫酸铵糊天花粉硫酸铵糊(90饱和度的沉淀饱和度的沉淀)溶于溶于2m1平衡缓冲液中平衡缓冲液中上样上样洗脱天花粉毒蛋白洗脱天花粉毒蛋白除去不溶物除去不溶物 3、测定高分子物质的分子量、测定高分子物质的分子量测测大于大于所用载体所用载体上上限限分子的洗脱体积分子的洗脱体积测测小于下限小于下限的分子的的分子的洗脱体积洗脱体积标定凝胶过标定凝胶过滤柱的滤柱的Vo标定凝胶过滤柱标定凝胶过滤柱的的Vi测定一系列测定一系列已知分已知分子量的标淮样品子量的标淮样品在在柱上的洗脱体积柱上的洗脱体积Ve以以(Ve-Vi)(Vo-Vi)和和1ogMw 作图作图测得了测得了

63、待测分子量的样品的待测分子量的样品的Ve从从标准曲线上标准曲线上可以可以求得求得未知样品的分子量未知样品的分子量蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类氨基酸、有色盐类 以标准样品的分子量以标准样品的分子量的的1ogMw对对Ve作图作图 or 洗洗脱脱液液中中蛋蛋白白质质浓浓度度4、高分子溶液的浓缩、高分子溶液的浓缩将将SephadexG-25或或50干胶干胶投入投入到到稀的高分子溶液稀的高分子溶液中中水分和低分子量的物质就水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外在凝胶颗粒之外离心或过滤离心或过滤，去除溶胀的凝胶，去除溶胀的凝胶浓缩浓

64、缩的高分子溶液的高分子溶液5、蛋白质复性研究、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂高浓度变性剂存在，蛋白呈存在，蛋白呈无规则卷曲无规则卷曲变性蛋白变性蛋白体积大，只体积大，只能能进入颗粒间隙进入颗粒间隙，迁，迁移速度快移速度快变性剂变性剂分子量小，分子量小，进入颗粒内部进入颗粒内部，迁，迁移速度慢移速度慢缓冲液洗脱蛋白缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，变性剂浓度降低，转成复性缓冲液转成复性缓冲液变性蛋白变性蛋白复性复性，以，以天然形态洗脱出柱天然形态洗脱出柱四、疏水层析四、疏水层析 (hydrophobic chromatography，HIC)（一）原理（一）原理 疏水

65、作用层析疏水作用层析（HIC）是根据是根据分子表面疏水分子表面疏水性差别性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种层来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种层析方法。析方法。 疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。后被洗脱下来。 影响疏水作用的因素：影响疏水作用的因素： 蛋白质的疏水性、蛋白质的环境蛋白质的疏水性、蛋白质的环境 Water moleculesSoluteSurface exposedhydrophobicgroupsLigandWate

66、r moleculesin bulk（二）疏水基质（二）疏水基质人工合成聚人工合成聚合物类合物类琼脂糖琼脂糖纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯聚丙烯酸聚丙烯酸甲酯类甲酯类多糖类多糖类壳聚糖壳聚糖 应用最广泛应用最广泛 良好的生物相容性和化学稳定性良好的生物相容性和化学稳定性 （三）疏水配基（三）疏水配基 烷烷基基链链配基配基芳基配基芳基配基 高分子配基高分子配基 柱：柱： HiPrep 16/10 样品样品: : 细胞色素细胞色素C(1)，溶菌酶（，溶菌酶（2），核糖核酸酶（），核糖核酸酶（3），）， 靡蛋白酶原（靡蛋白酶原（4）（四）基本操作（四）基本操作 v平衡Equilibrationv上样S

67、ampleapplicationv洗杂Washingv洗脱ElutionEquilibration1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionWater moleculesHydrophobic ligandGel matrixSample application1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups Washing out unbound material1. Equilibr

68、ation2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteins1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionElutionTarget elutesConc. saltAbsElution1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsMore strongly bound proteins1、层析柱的选择、层析柱的选择柱床高度通常为柱床高度通常

69、为515cm对一个优化好的分离方案进行对一个优化好的分离方案进行规模放大规模放大时，可保持柱时，可保持柱高不变，高不变，增加柱的直径增加柱的直径粗柱子（内径为粗柱子（内径为1.6 5.0cm）适合进行）适合进行HIC层析。层析。2、缓冲液的选择、缓冲液的选择往平衡的缓冲液和样品中加入一种往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐盐析盐，有利于固，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。定化配基与蛋白质的相互作用。随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高也相应提高 。洗脱时，洗脱液离子强度逐渐降低。洗脱时，洗脱液离子强度逐渐降低。v最常用的盐：

70、最常用的盐： (NH4)2SO4 、Na2SO4 和和NaCl2、缓冲液的选择、缓冲液的选择随着随着pH的升高，疏水作用相应下降的升高，疏水作用相应下降由于由于pH升高时，带点基团增加，从而导致蛋白质的升高时，带点基团增加，从而导致蛋白质的亲水性增加亲水性增加在中性在中性pH条件下与疏水相互作用介质不结合的蛋白条件下与疏水相互作用介质不结合的蛋白质，在酸性质，在酸性pH条件下则能够结合条件下则能够结合 洗脱时，洗脱液洗脱时，洗脱液pHpH逐渐升高。逐渐升高。3、蛋白质的洗脱、蛋白质的洗脱 低浓度的低浓度的水溶性乙醇水溶性乙醇、去污剂去污剂和具有和具有盐溶作盐溶作用的盐用的盐破坏水的结构、降低表

71、面张力，从破坏水的结构、降低表面张力，从而削弱疏水相互作用。而削弱疏水相互作用。乙醇或去污剂的非极性区与结合的蛋白质乙醇或去污剂的非极性区与结合的蛋白质竞竞争疏水性配基争疏水性配基，从而将蛋白质替代下来。，从而将蛋白质替代下来。 4、HIC柱的再生、清洁和贮存柱的再生、清洁和贮存 轻度轻度污染时污染时 蒸馏水蒸馏水洗涤洗涤污染物污染物紧密结合紧密结合时时 6 mol/L尿素尿素或或6 mol/L盐酸胍盐酸胍洗涤洗涤起始缓冲液或贮存缓冲液洗涤起始缓冲液或贮存缓冲液洗涤NaOH可用于溶解变性和沉淀的蛋白质及脂类可用于溶解变性和沉淀的蛋白质及脂类 未使用的介质储存在未使用的介质储存在封闭的容器封闭的

72、容器中，在中，在4-25的条件的条件下保存下保存 用过的介质应贮存在含有适当用过的介质应贮存在含有适当抑菌剂抑菌剂的溶液中，在的溶液中，在4 8的条件下保存，的条件下保存，不得冷冻不得冷冻 五、亲和层析五、亲和层析 (affinity chromatography) （一）原理（一）原理亲和层析亲和层析 利用生物大分子与其配体之间具有专一性亲和力而设计利用生物大分子与其配体之间具有专一性亲和力而设计的层析技术。的层析技术。亲和力亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原- -抗体、抗体、酶酶- -底物或抑制剂、激素底物或抑制剂、激素- -受体等

73、，它们之间都能够受体等，它们之间都能够专一而可专一而可逆逆的结合。的结合。分离原理分离原理 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。个分子进行分离纯化。优点优点提纯效率高提纯效率高分离快速分离快速（二）亲和层析用基质（二）亲和层析用基质具有具有较好较好的物理化学的物理化学稳定性稳定性能够和能够和配体稳定的结合配体稳定的结合结构为结构为均匀均匀的的多孔网状多孔网状结构结构与样品中的各个组分均与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附没

74、有明显的非特异性吸附 1 1、各类基质优缺点、各类基质优缺点优点优点缺点缺点纤维素纤维素价格低、活性基团较多价格低、活性基团较多非特异性吸附强、稳定非特异性吸附强、稳定性和均一性较差性和均一性较差交联葡聚糖交联葡聚糖稳定性较好稳定性较好孔径较小、稳定性不好孔径较小、稳定性不好聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺同上同上同上同上琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖非特异性吸附低、稳定性好、非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化孔径均匀适当、宜于活化多孔玻璃多孔玻璃机械强度好，化学稳定性好机械强度好，化学稳定性好活性基团较少、对蛋白活性基团较少、对蛋白质有较强的吸附作用质有较强的吸附作用 2、基质的活化基质的活化溴

75、化氰活化溴化氰活化环氧乙烷基活化环氧乙烷基活化 指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些上的一些化学基团化学基团转变为转变为易于和特定配体结合易于和特定配体结合的的活活性基团性基团。多种商品化的活化基质多种商品化的活化基质 （三）配体（三）配体与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性性与基质稳定的共价结合与基质稳定的共价结合自身应具有较好的稳定性自身应具有较好的稳定性 配体的分类配体的分类特异性配体特异性配体 只与只与单一单一或或很少种类很少种类

76、的蛋白质等生物大分子结的蛋白质等生物大分子结合的配体合的配体 egeg. . 抗原和抗体、酶和它的抑制剂抗原和抗体、酶和它的抑制剂 通用性配体通用性配体 特异性不是很强，能和特异性不是很强，能和某一类某一类的蛋白质等生物的蛋白质等生物大分子结合的配体大分子结合的配体 egeg. . 凝集素可以结合各种糖蛋白凝集素可以结合各种糖蛋白 配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质抗原抗原特定单克隆抗体或多特定单克隆抗体或多克隆抗体克隆抗体肝素肝素凝聚因子、脂酶、结缔凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、组织蛋白酶、DNA聚聚合酶合酶单克隆抗体单克隆抗体特定抗原特定抗原胆固醇胆

77、固醇胆固醇受体、胆固醇结胆固醇受体、胆固醇结合蛋白合蛋白蛋白质蛋白质A/蛋白蛋白质质G免疫球蛋白免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋脂肪酸结合蛋白、白蛋白白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、需核核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶苷酸的酶磷酸磷酸磷酸酶磷酸酶苯基硼酸苯基硼酸盐盐糖蛋白糖蛋白三嗪染料三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素酶、限制酶、干扰素凝集素凝集素糖蛋白糖蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶含生物素的酶糖糖凝集素、糖苷酶凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体蛋白质亲和层析中的合适配体（四）基本操作（四）基本操作选择适当的

78、配体选择适当的配体将配体固定化到基质上将配体固定化到基质上将目的蛋白混合液加样到基质上将目的蛋白混合液加样到基质上除去非特异性结合的蛋白质除去非特异性结合的蛋白质洗脱纯的目的蛋白洗脱纯的目的蛋白1、上样、上样层析柱较短，通常层析柱较短，通常10cm 左右左右样品液的浓度不宜过高样品液的浓度不宜过高上样时流速比较慢上样时流速比较慢样品缓冲液中有一定的的离子强度样品缓冲液中有一定的的离子强度上样时选择适当较低的温度上样时选择适当较低的温度 2、洗脱、洗脱特异性洗脱特异性洗脱 指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱

79、下来。亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。 非特异性洗脱非特异性洗脱 指通过改变洗脱缓冲液指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。洗脱下来。 特异性洗脱特异性洗脱 优点：优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。附的影响，从而得到较高的分辨率。 可避免蛋白质变性可避免蛋白质变性缺点：缺点： 较长的时间、较大的洗脱条件。较长的时间、较大的洗脱条件。改善方法：改善方法： 选择亲和力强的物质洗脱、加大

80、洗脱液选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度浓度 特异性洗脱特异性洗脱非特异性洗脱非特异性洗脱与配体亲和力较小与配体亲和力较小 连续连续大体积平衡缓冲液冲洗大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时配体结合较强时 适当的适当的pH、离子强度洗脱、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物，注意尽量不影响待分离物质的活性质的活性与配体结合非常牢固时与配体结合非常牢固时 使用较强的使用较强的酸、碱酸、碱或在洗脱液中加入或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性使蛋白质等待

81、分离物质变性，洗脱后再复性 3、吸附剂的再生和保存、吸附剂的再生和保存 再生再生 用用大量大量的洗脱液或的洗脱液或较高浓度较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡重新平衡 严重的不可逆吸附时，使用严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变高浓度的盐溶液、尿素等变性剂性剂或加入适当的或加入适当的非专一性蛋白酶非专一性蛋白酶保存保存 加入加入0.01%的叠氮化钠，的叠氮化钠，4C 下保存下保存 五、亲和层析用于蛋白质分离的实例五、亲和层析用于蛋白质分离的实例 免疫亲和层析免疫亲和层析凝集素和糖蛋白亲和层析凝集素和糖蛋白亲和层析含有辅酶的酶类的亲和层析含有辅酶的酶类的亲

82、和层析酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析肝素为配体的亲和层析肝素为配体的亲和层析染料配体亲和层析染料配体亲和层析金属螯合层析金属螯合层析六、吸附层析六、吸附层析 (absorption chromatography)（一）原理（一）原理蛋白质分子通过各种次级键的作用能吸附在某些吸附蛋白质分子通过各种次级键的作用能吸附在某些吸附剂上，根据不同蛋白质对固定相剂上，根据不同蛋白质对固定相(吸附剂吸附剂) 的的吸附程吸附程度不同度不同，以及其在相应的流动相，以及其在相应的流动相(溶剂溶剂)中溶解度的中溶解度的差异来实现，经反复的差异来实现，经反复的吸附吸附解吸解吸再吸附再吸附再解

83、再解吸吸的过程，达到分离目的。的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的无化学键引入，只存在相对较弱的氢键氢键、范德华力范德华力和和疏水作用力疏水作用力相互作用。相互作用。（二）吸附剂（二）吸附剂水合磷酸钙水合磷酸钙羟基磷灰石羟基磷灰石（三）优点（三）优点操作方便操作方便吸附剂易得、价格低廉吸附剂易得、价格低廉能分离离子交换层析和凝胶过滤不能分能分离离子交换层析和凝胶过滤不能分离的蛋白质离的蛋白质八、高效液相层析八、高效液相层析（ High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）（一）原理（一）原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒

84、极高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。足。目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而，而80%则需用高效液相色谱来分析。则需用高效液相色谱来分析。特点：特点： 高压、高效、高速，高沸点、热不高压、高效、高速，高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方稳定有机及生化试样的高效分离

85、分析方法。法。（二）流程及主要部件（二）流程及主要部件1.1.流程流程2.主要部件主要部件(1) (1) 高压输液泵高压输液泵l 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环环己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) )。4.流动相的

86、要求 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。择性。（2）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。别的溶剂作流动相，以达到最高

87、灵敏度。（3）高纯度）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。（4）化学稳定性好）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等。甲醇和乙腈等。第五节第五节 蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离一、概述一、概述二、二、PAGEPAGE凝胶电泳凝胶电泳三、三、SDS-PAGESDS-PAGE凝

88、胶电泳凝胶电泳四、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳四、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳五、双向电泳五、双向电泳六、毛细管电泳六、毛细管电泳电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国年俄国物理学家物理学家ReRessss进行了世界上第一次电泳实验进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在。但电泳技术的广泛应用，则是在19371937年用滤年用滤纸作为支持介质成功地进行纸

89、电泳以后，特别纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。免疫学等领域得到了广泛应用。一、概述一、概述（一）概念（一）概念原则上按电泳的原理来分，可分为二类：原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。价格昂贵，费时费力，不

90、便于推广应用。区带电泳：区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。可分为不同的类型。一、概述一、概述（二）分类（二）分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于

91、核纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 v以上二种类型的电泳，由于介质的孔径以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。物的电荷多少进行分离。淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）

92、。天然淀粉经可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分聚丙烯酰

93、胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。离、纯化及检测。其分辨率较高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质持介质（三）基本原理（三）基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。动速度不同进而达到分离目的。 电泳受电泳受粒子本身大小、形状、所带电量粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、溶

94、液粘度、温度、pHpH、电渗及离子强度、电渗及离子强度多种因多种因素的影响。素的影响。一、概述一、概述二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对有弹性，透明，化学性质稳定，对pHpH和温度变化小，没有和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。吸附和电渗作用小的特点，是

95、一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称简称Acr）和交联剂和交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称简称Bis）在催化剂作用下合成的。在催化剂作用下合成的。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2

96、-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m1. 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种： 1）化学聚合化学聚合 化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用过硫酸铵过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），），此外还需要加速剂此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量存在。微量TEMED的加入，可促使过硫酸铵形成自由基：的

97、加入，可促使过硫酸铵形成自由基： S2O82- 2SO4- 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。2 2）光聚合光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。应。TEMEDTEMED的存在，可以加速聚合。的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响： （1 1）大气

98、氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。隔绝空气，可加速聚合。 （2 2）低温、低低温、低pHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。 （3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。可抑制聚合反应。2. 2. 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶

99、的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（T T）和）和AcrAcr与与BisBis两者之比。凝胶总两者之比。凝胶总浓度（浓度（T T）和交联度（和交联度（C C）的计算公式分别为：的计算公式分别为：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T =凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，凝胶浓度越大，孔径越小孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶

100、稀软，不易操作，也易断裂。凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交当凝胶浓度确定后，交联度为联度为5%5%时，凝胶具有最小孔径，时，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶时凝胶孔径都要增大。孔径都要增大。 在浓度为在浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大多数生物的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为因此，把浓度为7.5%7.5% 凝胶称为凝胶称为标准胶标准胶。 对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准的标准胶或胶或4%-10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选的凝胶梯度来

101、测试，而后选出适宜的凝胶浓度。出适宜的凝胶浓度。3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面： 1）凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶（上层为大孔径的浓缩胶（23），下层为小孔径的分），下层为小孔径的分离胶（离胶（ 515 ）。）。 2）缓冲液离子组成的不连续性。主要是阴离子不同缓冲液离子组成的不连续性。主要是阴离子不同（Gly-, Cl-）。）。 3）凝胶的凝胶的pH不同。电极缓冲液为不同。电极缓冲液为pH8.3的的Tris-甘氨酸甘氨酸缓

102、冲液，浓缩胶为缓冲液，浓缩胶为pH6.8的的Tris-HCl缓冲液，而分离胶缓冲液，而分离胶为为pH8.9 的的Tris-HCl缓冲液。缓冲液。 4）在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH

103、=8.9T=7.5%4、其他注意事项、其他注意事项不能随便倾倒不能随便倾倒单体溶液单体溶液，应加入过量的催化剂使其完，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外催化能力，另外TEMED的氧化产物的氧化产物呈黄色呈黄色，以此，以此可以鉴定可以鉴定TEMED的质量。的质量。过硫酸铵过硫酸铵溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过

104、硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。激活剂的用量激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。温度的影响：温度的影响：聚胶的最佳温度为聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前，需要注意灌胶前单体溶液单体溶液(通常置于通常置于4冰箱冰箱)及玻璃板或管及玻璃板或管(有时从烘箱取有时从烘箱取出出)也要平衡至此温度。也要平衡至此温度。凝胶添加剂：凝胶添加剂：凝胶中常常加入凝胶中常常加入SDS、尿素、尿素、Triton X-100等添等添加剂。加

105、剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。肽。聚胶时间：聚胶时间：虽然应用过硫酸铵虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。SDS与蛋白质的结合按质量成比例与蛋白质的结合按质量成比例（即：（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质），蛋白质含量不可

106、以超标，否则蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。结合量不足。用用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。须同时作标准曲线。三、三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。主要与其所带净电荷以及

107、分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDSSDS）时，则得时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。子量。 SDSSDS的作用原理的作用原理 lSDSSDS能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键与其它物质分子之间的非共价键, ,使蛋白质变性而改变原有使蛋白质变性而改变原有的空间构象。的空间构象。 l当当SDSSDS的总

108、量为蛋白量的的总量为蛋白量的3 31010倍且倍且SDSSDS单位浓度大于单位浓度大于1 1mol./Lmol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.41.4克克SDSSDS。 l蛋白质分子一经结合了一定量的蛋白质分子一经结合了一定量的SDSSDS阴离子，所带负电荷的阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的SDSSDS越越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质多

109、，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质- -SDSSDS复合物的复合物的电荷电荷密度趋于一致密度趋于一致。l不同蛋白质的不同蛋白质的SDSSDS复合物形状也相似，均是长复合物形状也相似，均是长椭球状椭球状。 l在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质- -SDSSDS复合物的大小，复合物的大小，也可以说是也可以说是取决于蛋白质分子量的大小取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所，而与蛋白质原来所带电荷量无关。带电荷量无关。 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量p当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,00017,000165,000165,000之间之间时，时，蛋白质蛋

110、白质- -SDSSDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：量的对数呈线性关系：lgMWlgMW= =lgKlgKbmbm p将已知分子量的标准蛋白质在将已知分子量的标准蛋白质在SDS -SDS -聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。据标准曲线求得其分子量。四、四、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦

111、电泳( (IsoelectricIsoelectric Focusing-PAGE Focusing-PAGE，IEF-PAGE)IEF-PAGE) 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中加加入入一一种种合合成成的的两两性性电电解解质质载载体体，在在电电场场的的作作用用下下会会自自发发形形成成一一个个连连续续的的pHpH梯梯度度。蛋蛋白白质质样样品品在在电电泳泳中中被被分分离离，运运动动到到等等电电点点胶胶层层时时就就失失去去所所带带电电荷荷而而稳稳定定停停留留在在该该处处，样样品品中中不不同同蛋蛋白白质质组组分分等等电电点点不不同同，因因而而在在等等电电聚聚焦焦电电泳泳中中得得到到有有效效分分离离

112、。在在等等电电聚聚焦焦电电泳泳中中，利利用用各各蛋蛋白白质质组组分分等等电电点点的的差差异异，并并不不利利用用凝凝胶胶的的分分子子筛筛作作用用。它它的的分分辨辨力力高高，可分离等电点相差可分离等电点相差0.01-0.02pH0.01-0.02pH单位的蛋白质。单位的蛋白质。pHpH梯度形成的机制梯度形成的机制 在溶液中的两性电解质一方面受溶液在溶液中的两性电解质一方面受溶液pHpH值的影响，决定其值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其其pHpH值有所改变。值有所改变。 在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳

113、时凝胶板在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠。 正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于p pI I的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时，向负极泳动的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同。的速度也就因此不同。 负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。以不同速度向正极泳动。 在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的在泳动过程中又不

114、断地与溶液交换质子，改变了溶液的pHpH。当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的达等电点并各处于自己的p pI I区域，不在移动。区域，不在移动。 所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的pHpH，随载体两性电解质的随载体两性电解质的p pI I梯度而形成梯度而形成pHpH梯度。梯度。 等电聚焦的优缺点等电聚焦的优缺点优点：优点： 分辨率高分辨率高 很稀的样品都可分离，且重现性好很稀的样品都可分离，且重现性好 可用于测定蛋白质或多肽的等电点可用于测定蛋白质或多肽的等电点缺点：缺点： 要求使用无盐

115、溶液，而某些蛋白质在要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，可能产生沉淀无盐溶液中溶解度低，可能产生沉淀 对一些在等电点不溶解或发生变性的对一些在等电点不溶解或发生变性的蛋白质不适用。蛋白质不适用。五、双向五、双向电泳电泳（two-dimensional electrophoresistwo-dimensional electrophoresis）l如果将等电聚焦电泳与如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGESDS-PAGE结合起来，就结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳。是分辨率更高的一种双向电泳。l双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图

116、，水平方向反映出蛋白在水平方向反映出蛋白在pIpI上的差异，而垂直方上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。l单向单向SDSSDSPAGEPAGE电泳分辨力差，仅能分开电泳分辨力差，仅能分开5050种种左右的蛋白；左右的蛋白；IEF-PAGEIEF-PAGE分辨力稍高，也只能分分辨力稍高，也只能分开开100100多种蛋白质；双向电泳可分辨多种蛋白质；双向电泳可分辨10001000种以

117、种以上的蛋白质，一般为上的蛋白质，一般为200020001500015000种。种。六、毛细管电泳六、毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳(Capillary (Capillary electrophoreelectrophore s s is,is,简称简称CE)CE)也常称也常称高效毛细管电泳高效毛细管电泳（high high performance capillary electrophoresis,performance capillary electrophoresis,简称简称HPCEHPCE），是以内径），是以内径20-200 20-200 m m的柔性毛细管柱作的柔性毛细管柱作为分离

118、通道，以高压直流电场为驱动力，对各种为分离通道，以高压直流电场为驱动力，对各种小分子，大分子以致细胞等进行高效分离，检测小分子，大分子以致细胞等进行高效分离，检测或微量制备等的有关技术的总称。或微量制备等的有关技术的总称。毛细管电泳仪基本结构图毛细管电泳仪基本结构图毛细管：毛细管：长：长：47cm, 57cm, 67cm;47cm, 57cm, 67cm;直径：直径：5-200 5-200 mm进样系统：进样系统：气气压进样、电压压进样、电压进样。进样。冷却系统冷却系统: :液冷、风冷。液冷、风冷。高压系统高压系统: :1-30kV1-30kV。毛细管电泳的检测器：紫外毛细管电泳的检测器：紫外

119、检测器、二极管阵列检测器、检测器、二极管阵列检测器、激光诱发荧光检测器、电化激光诱发荧光检测器、电化学检测器、质量（质谱）检学检测器、质量（质谱）检测器等。测器等。PRINCE700毛细管电泳仪毛细管电泳仪CEC-加压毛细管电色谱加压毛细管电色谱毛细管电泳的分类毛细管电泳的分类1、毛细管区带电泳（、毛细管区带电泳（CZE）2、分子体积排除（筛滤）电泳或分子体积排除（筛滤）电泳或 凝胶电泳（凝胶电泳（CGE）3、等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEF）4、胶束电动力学电泳（胶束电动力学电泳（MECC）5、等速聚焦电泳（等速聚焦电泳（ITP）毛细管电泳的主要优点毛细管电泳的主要优点1 1、高灵敏度、高

120、灵敏度2 2、高分辨、高分辨3 3、速度快、速度快4 4、进样少、进样少5 5、成本低、成本低高灵敏度：紫外检测器的检高灵敏度：紫外检测器的检测极限在测极限在1010-13-131010-15-15molmol之间，之间，荧光检测可达荧光检测可达1010-19-191010-21-21molmol高分辨：峰分离效率超过高分辨：峰分离效率超过1 1百万理论百万理论塔板数，一般可达几十万塔板数，一般可达几十万。速度快：许多分析在速度快：许多分析在1010分分钟内完成。钟内完成。进样少：一般需要毫微升的进样少：一般需要毫微升的进样量。进样量。成成本本低低：一一般般只只需需要要可可长长期期使使用用的的

121、毛毛细细管管和和极极微微量量的的可可自己配制的缓冲液。自己配制的缓冲液。毛细管电泳的应用领域毛细管电泳的应用领域 小型离子小型离子 小分子小分子 肽类肽类 蛋白质蛋白质 低聚核苷酸低聚核苷酸 DNA第六节第六节 蛋白质的结晶蛋白质的结晶p结晶法是提纯蛋白质的一种手段。结晶法是提纯蛋白质的一种手段。p当蛋白质提纯到一定纯度当蛋白质提纯到一定纯度( (大约是大约是5050) )时，时，就可以进行蛋白质结晶。就可以进行蛋白质结晶。p常用的方法有：盐析法；有机溶剂法；复常用的方法有：盐析法；有机溶剂法；复合结晶法；平衡透析法；气相扩散法；合结晶法；平衡透析法；气相扩散法；pHpH诱导法；温度诱导法等。

122、诱导法；温度诱导法等。p现在，蛋白质结晶，主要应用在制备适合现在，蛋白质结晶，主要应用在制备适合X-X-射线衍射研究、中子衍射研究的单晶样品。射线衍射研究、中子衍射研究的单晶样品。p适用于这种研究的最小晶体，其线性大小至适用于这种研究的最小晶体，其线性大小至少要在少要在0.2mm0.2mm以上。要让晶体长成这样的大小，以上。要让晶体长成这样的大小，必须寻找适宜的结晶条件。必须寻找适宜的结晶条件。 结晶条件结晶条件1 1、纯度、纯度(purity)(purity) p样品纯度越高，结晶越容易。样品纯度越高，结晶越容易。p混杂蛋白的存在，有时是影响单晶长大的混杂蛋白的存在，有时是影响单晶长大的主要

123、障碍，甚至于影响微晶形成。主要障碍，甚至于影响微晶形成。p但多大纯度才能出结晶，没有统一的标准，但多大纯度才能出结晶，没有统一的标准，通常不应低于通常不应低于5050。结晶条件结晶条件2 2、蛋白浓度、蛋白浓度p结晶母液通常应保持尽可能高的蛋白质浓度。浓结晶母液通常应保持尽可能高的蛋白质浓度。浓度越高，结晶机会越大。度越高，结晶机会越大。p这是因为蛋白质分子的扩散速度慢，浓度越高，这是因为蛋白质分子的扩散速度慢，浓度越高，分子间相互碰撞聚合的机会增多。在稀溶液中不分子间相互碰撞聚合的机会增多。在稀溶液中不易形成晶核。易形成晶核。p对大多数蛋白质来说，浓度在对大多数蛋白质来说，浓度在5-50mg

124、/mL5-50mg/mL为好。为好。p在过饱和状态下结晶，杂质含量多，而且晶形也在过饱和状态下结晶，杂质含量多，而且晶形也不好。不好。结晶条件结晶条件3 3、温度、温度p温度可在温度可在0-400-40之间选择。之间选择。p一般在低温下进行。一般在低温下进行。p低温，不仅使蛋白质的溶解度降低，而且低温，不仅使蛋白质的溶解度降低，而且也不易使蛋白质变性。也不易使蛋白质变性。结晶条件结晶条件4 4、结晶时间、结晶时间p视各种蛋白质的具体情况而定。视各种蛋白质的具体情况而定。p从浓盐溶液中结晶，形成结晶中心的时间短从浓盐溶液中结晶，形成结晶中心的时间短( (几几个小时个小时) )，但晶体生长较慢，但

125、晶体生长较慢( (需数周、数月需数周、数月) )。也。也有例外，如；牛肝过氧化氢酶从盐溶液中形成大有例外，如；牛肝过氧化氢酶从盐溶液中形成大的单晶只需的单晶只需12241224小时。小时。p晶体大小与结晶时间、结晶条件有关。大晶体通晶体大小与结晶时间、结晶条件有关。大晶体通常是生长较慢的情况下得到的。常是生长较慢的情况下得到的。结晶条件结晶条件5 5、pHpH值值p调节溶液的调节溶液的pHpH，通常可以使晶体长到最适，通常可以使晶体长到最适大小，也可以改变晶形，但要注意蛋白质大小，也可以改变晶形，但要注意蛋白质的稳定性。的稳定性。p结晶溶液的结晶溶液的pHpH，一般应选在被结晶蛋白质，一般应选

126、在被结晶蛋白质的等电点附近，这样，有利于晶体的析出。的等电点附近，这样，有利于晶体的析出。结晶条件结晶条件6 6、金属离子、金属离子p金属离子能引起或有助于蛋白质结晶。金属离子能引起或有助于蛋白质结晶。p特别是二价的金属离子，能促进晶体长大，特别是二价的金属离子，能促进晶体长大，例如：在硫酸铵溶液中的铁蛋白，加人少例如：在硫酸铵溶液中的铁蛋白，加人少量的镉离子之后，能形成菱形晶体。量的镉离子之后，能形成菱形晶体。结晶条件结晶条件7 7、沉淀剂、沉淀剂p沉淀剂可以改变蛋白质的溶解度。沉淀剂可以改变蛋白质的溶解度。p盐类和各种有机溶剂都可以用作沉淀剂。盐类和各种有机溶剂都可以用作沉淀剂。p大多数盐

127、类影响蛋白质的溶解度是通过盐大多数盐类影响蛋白质的溶解度是通过盐析或盐溶作用。析或盐溶作用。p理想结晶物质：聚乙二醇（理想结晶物质：聚乙二醇（PEGPEG），），2-2-甲甲基基-2,4-2,4-戊二醇（戊二醇（MPDMPD）。）。结晶条件结晶条件8 8、其它、其它p有的蛋白质不易结晶，如糜蛋白酶，但如果加入有的蛋白质不易结晶，如糜蛋白酶，但如果加入微量的糜蛋白酶晶体，常常可以导致大量结晶的微量的糜蛋白酶晶体，常常可以导致大量结晶的出现。出现。p有时，用玻璃棒轻轻摩擦器壁，也能促进结晶。有时，用玻璃棒轻轻摩擦器壁，也能促进结晶。p需要晶种才能结晶的蛋白质，一般结晶收率都不需要晶种才能结晶的蛋白

128、质，一般结晶收率都不高。高。结晶条件结晶条件结晶能否作为蛋白质制剂纯度的指标结晶能否作为蛋白质制剂纯度的指标? ?p结晶标志着蛋白质制剂达到了较高的纯度。结晶标志着蛋白质制剂达到了较高的纯度。p均一的蛋白质制剂不一定就能够做到结晶。均一的蛋白质制剂不一定就能够做到结晶。p有有时时，蛋蛋白白质质的的第第一一次次结结晶晶纯纯度度低低于于5050，其其中中可可能能含含有有其其它它杂杂质质。当当重重结结晶晶时时，若若比比活活力力有有所所增增加加，则则要要反反复复结结晶晶几几次次，直直到到比比活活力力提提高高到到一一个最大的恒定值。个最大的恒定值。p所所以以，重重结结晶晶法法实实际际上上是是提提纯纯后后

129、期期的的一一个个分分级级法法。用用结结晶晶法法纯纯化化只只能能达达到到一一定定的的纯纯度度；过过分分多多次次的的重结晶，不一定就能达到完全纯化的目的。重结晶，不一定就能达到完全纯化的目的。第七节第七节 蛋白质的检测蛋白质的检测蛋白质的浓度测定蛋白质的浓度测定蛋白质的纯度检测蛋白质的纯度检测一、蛋白质的浓度测定一、蛋白质的浓度测定 蛋白质含量可根据其物理化学性质来测定。蛋白质含量可根据其物理化学性质来测定。l双缩脲法双缩脲法l福林福林-酚法酚法l紫外吸收法紫外吸收法l考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 这些方法都是利用蛋白质特有的吸收光谱来测定这些方法都是利用蛋白质特有的吸收光谱来测定蛋白质含量的

130、，操作简单，不需昂贵仪器。蛋白质含量的，操作简单，不需昂贵仪器。( (一一) )双缩脲法双缩脲法此法的原理：此法的原理：CuCu2+2+可与含有两个以上肽键的可与含有两个以上肽键的化合物络合，形成紫红色络合物；此产化合物络合，形成紫红色络合物；此产物在物在540nm540nm波长处有最大吸收，可以比色波长处有最大吸收，可以比色测定；其颜色的深浅与蛋白质浓度成正测定；其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。比。蛋白质含有多个肽键，因此，有双缩脲反蛋白质含有多个肽键，因此，有双缩脲反应。应。( (一一) )双缩脲法双缩脲法在复杂的生物体系中，需要快速测定其中的蛋白质含在复杂的生物体系中，需要快速测定其中的

131、蛋白质含量时，常用此法。量时，常用此法。因为核酸等其它非蛋白质成分，包括硫酸铵不干扰显因为核酸等其它非蛋白质成分，包括硫酸铵不干扰显色。这对早期提纯阶段的测定非常有用。色。这对早期提纯阶段的测定非常有用。该法常用于该法常用于0.5-10mg/mL0.5-10mg/mL蛋白质溶液的测定。蛋白质溶液的测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质的缓冲液，如干扰物有硫醇，以及具有肽性质的缓冲液，如TrisTris缓缓冲液等。冲液等。可用沉淀法除去干扰物。即用等体积冷的可用沉淀法除去干扰物。即用等体积冷的1010三氯醋三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的

132、1 1 mol/mol/LNaOHLNaOH溶解蛋白质。溶解蛋白质。( (一一) )双缩脲法双缩脲法上面介绍的是常量双缩脲法。为提高测定灵敏度，又上面介绍的是常量双缩脲法。为提高测定灵敏度，又发展了微量双缩脲法。发展了微量双缩脲法。此法显色原理与双缩脲法相同。由于铜与蛋白质络合此法显色原理与双缩脲法相同。由于铜与蛋白质络合物的吸收峰在物的吸收峰在260260280nm280nm，在此区域，干扰因素及，在此区域，干扰因素及空白的吸收都很大，而在空白的吸收都很大，而在310310330nm330nm测定，干扰因测定，干扰因素少一些，比素少一些，比540nm540nm测定灵敏测定灵敏1010倍以上。

133、倍以上。因此，可以选用因此，可以选用310nm310nm进行比色测定，测定蛋白质浓度进行比色测定，测定蛋白质浓度的范围为的范围为0.10.11.0mg/mL1.0mg/mL；用；用330nm330nm测定，测定范围测定，测定范围为为0.20.22.0mg/mL2.0mg/mL。干扰物有干扰物有TrisTris、HisHis、SerSer、ThrThr、乙醇胺、葡萄糖、多、乙醇胺、葡萄糖、多肽、硫锌、尿素、去垢剂等。肽、硫锌、尿素、去垢剂等。( (二二) )福林福林- -酚试剂法酚试剂法此法是双缩脲法的进一步发展。它的第一步是此法是双缩脲法的进一步发展。它的第一步是双缩脲反应。反应生成的络合物以

134、及酪氨酸、双缩脲反应。反应生成的络合物以及酪氨酸、色氨酸残基，还原磷钼酸色氨酸残基，还原磷钼酸- -磷钨酸试剂磷钨酸试剂( (即福即福林林- -酚试剂酚试剂) )，生成深蓝色产物。，生成深蓝色产物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20-20-400g/mL400g/mL的蛋白质溶液。此法也适用于酪氨的蛋白质溶液。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。酸和色氨酸的定量测定。对那些含有这两种残基、并与标准蛋白质差异对那些含有这两种残基、并与标准蛋白质差异较大的蛋白质有误差。较大的蛋白质有误差。( (二二) )福林福林- -酚试剂法酚试剂法该法可用该法可用750n

135、m750nm波长比色测定，测定范围为波长比色测定，测定范围为0.030.030.3mg/ 0.3mg/ mLmL；或用；或用550nm550nm波长比色测定，测定范围为波长比色测定，测定范围为0.050.050.5mg/mL0.5mg/mL。该法标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。该法标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。此法应用广泛，所以，对其干扰因素了解得最多。已知的干此法应用广泛，所以，对其干扰因素了解得最多。已知的干扰因素有：各种缓冲液，如扰因素有：各种缓冲液，如TrisTris、HEPESHEPES、柠檬酸、甘氨酸、柠檬酸、甘氨酸等缓冲液；螯合剂，如等缓冲液；螯合剂，如

136、EDTAEDTA、EGTAEGTA；各种糖，如蔗糖、甘；各种糖，如蔗糖、甘油、山梨醇等糖类；各种还原剂，如：酚、二硫苏糖醇，油、山梨醇等糖类；各种还原剂，如：酚、二硫苏糖醇，巯基乙醇、谷胱甘肽等；二价金属离子，如汞、锰、钴；巯基乙醇、谷胱甘肽等；二价金属离子，如汞、锰、钴；去污剂，如去污剂，如TritonTriton、TweenTween等；乙二醇、载体两性电解质等。等；乙二醇、载体两性电解质等。高浓度的脲、胍、硫铵、乙醇、脂类等化合物也对测定有高浓度的脲、胍、硫铵、乙醇、脂类等化合物也对测定有影响。影响。核酸、核苷酸和碱基在此条件下有很大吸收。因此，该法不核酸、核苷酸和碱基在此条件下有很大吸

137、收。因此，该法不宜用于蛋白质粗提液的测定，而最适用于较纯的蛋白质样宜用于蛋白质粗提液的测定，而最适用于较纯的蛋白质样品。品。( (三三) )紫外吸收法紫外吸收法1 1、280nm280nm光吸收法光吸收法 大多数蛋白质在大多数蛋白质在275275280nm280nm波长处有一个吸收峰。波长处有一个吸收峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm280nm波长的光吸收波长的光吸收值值(A(A280280) )与其浓度成正比。与其浓度成正比。这一规律可以用来测定蛋白质浓度。该法测定蛋白质这一规律可以用来测定蛋白质浓度。该法测定蛋白质浓度的范围为浓度的范围为0.10.1

138、1.0mg/mL1.0mg/mL。该法简单、灵敏、快速、不消耗样品、低浓度的盐类该法简单、灵敏、快速、不消耗样品、低浓度的盐类不干扰测定，因此，在蛋白质和酶的分离提纯过程不干扰测定，因此，在蛋白质和酶的分离提纯过程中，应用广泛。特别是在柱层析分离过程中，常利中，应用广泛。特别是在柱层析分离过程中，常利用用A A280280进行紫外检测，以判断蛋白质洗脱的情况。进行紫外检测，以判断蛋白质洗脱的情况。( (三三) )紫外吸收法紫外吸收法由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，因此，不同蛋白质溶所处的微环境也不同，因此，不同蛋白质溶液在

139、液在280nm280nm的光吸收值也有不同。的光吸收值也有不同。另外，由于蛋白质的紫外吸收峰常因另外，由于蛋白质的紫外吸收峰常因pHpH值的改值的改变而有变化，所以用紫外吸收法时，要注意变而有变化，所以用紫外吸收法时，要注意溶液的溶液的pHpH值。值。此法适用于纯蛋白质的定量测定。且需知道其此法适用于纯蛋白质的定量测定。且需知道其消光系数，才能算出其蛋白质浓度。粗的样消光系数，才能算出其蛋白质浓度。粗的样品不宜用此法，尤其在含核酸的情况下。品不宜用此法，尤其在含核酸的情况下。( (三三) )紫外吸收法紫外吸收法2 2、280nm280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 部分纯化的

140、蛋白质常含有核酸。核酸能吸收紫部分纯化的蛋白质常含有核酸。核酸能吸收紫外光。所以，在用外光。所以，在用A A280280测定蛋白质浓度时，会测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在有较大的干扰。由于核酸在260nm260nm波长有最大波长有最大吸收，因此可以利用吸收，因此可以利用280nm280nm及及260nm260nm吸收差，吸收差，来计算蛋白质的浓度。采用此法，虽然简便，来计算蛋白质的浓度。采用此法，虽然简便，但不精确。但不精确。蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mg/mLmL）=1.45A=1.45A280280-0.74A-0.74A260260( (三三) )紫外吸收法紫外吸收法3

141、 3、215nm215nm和和225nm225nm的吸收差法的吸收差法 蛋白质的肽键在蛋白质的肽键在230nm230nm波长以下有强吸收。其光波长以下有强吸收。其光吸收强度在一定范围内与蛋白质浓度成正比。吸收强度在一定范围内与蛋白质浓度成正比。若选取若选取215nm215nm波长，可减少干扰及光散射。用波长，可减少干扰及光散射。用215nm215nm和和225nm225nm光吸收差值，与单一波长测定光吸收差值，与单一波长测定相比，可以减少非蛋白质成分引起的误差。相比，可以减少非蛋白质成分引起的误差。对稀溶液中蛋白质浓度的测定，可以用对稀溶液中蛋白质浓度的测定，可以用215nm215nm和和22

142、5nm225nm光吸收差法。常用下列经验公式：光吸收差法。常用下列经验公式： 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg(mgmLmL) )0.144(A0.144(A215nm215nm-A-A225nm225nm) )( (三三) )紫外吸收法紫外吸收法该法测定蛋白质浓度的范围为该法测定蛋白质浓度的范围为2020100g/ 100g/ mLmL。虽然。虽然方法的灵敏度较高，但是，蛋白质之间的分子量差方法的灵敏度较高，但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，也就是肽键数目不同，因此，在比较几异比较大，也就是肽键数目不同，因此，在比较几个蛋白质含量时，必须作适当校正。个蛋白质含量时，必须作适当校正。高浓度的缓冲液

143、干扰测定，某些无机化合物也可能干高浓度的缓冲液干扰测定，某些无机化合物也可能干扰测定。如扰测定。如0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH、醋酸、柠檬酸、琥珀、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液在酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液在215nm215nm的光吸的光吸收较大，必须降至收较大，必须降至5mmol/L5mmol/L才无明显干扰。因此，才无明显干扰。因此，采用此法必须谨慎，以防干扰。采用此法必须谨慎，以防干扰。( (四四) )考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染色法染色法考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250在酸性溶液中为棕红色。当它与蛋白质通过在酸性溶液中

144、为棕红色。当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色。测定方法非常简单。只要将蛋疏水作用结合后，变为蓝色。测定方法非常简单。只要将蛋白质样品加到染料试剂中，即可在白质样品加到染料试剂中，即可在595nm595nm波长进行比色测定。波长进行比色测定。测定蛋白质浓度范围为测定蛋白质浓度范围为0.010.011.0mg1.0mgmLmL。目前，此法的应用很普及。因为它非常灵敏、快速，准确度至目前，此法的应用很普及。因为它非常灵敏、快速，准确度至少与福林少与福林- -酚法相同。酚法相同。主要问题是：染料可吸附到比色杯上；不同蛋白质之间差异较主要问题是：染料可吸附到比色杯上；不同蛋白质之间差异较大；标准曲

145、线线性较差。大；标准曲线线性较差。高浓度的高浓度的TrisTris、EDTAEDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去污剂，对测定有干扰。缓冲液浓度过高，改变了测定液的污剂，对测定有干扰。缓冲液浓度过高，改变了测定液的pHpH，都会影响显色。该染料染色能力很强，吸附到杯子上的染，都会影响显色。该染料染色能力很强，吸附到杯子上的染料可用料可用SDSSDS稀溶液洗去。稀溶液洗去。注意，不可使用石英比色杯注意，不可使用石英比色杯。 二、蛋白质的纯度检测二、蛋白质的纯度检测鉴定蛋白质样品是否均一，远非易事。鉴定蛋白质样品是否均一，远非易事。只用一种方法作为纯度试验

146、的指标，是很不可靠的。只用一种方法作为纯度试验的指标，是很不可靠的。蛋白质纯度最终取决于所用方法的类型和分辨率。蛋白质纯度最终取决于所用方法的类型和分辨率。用低分辨率方法证明是纯的样品，改用高分辨率方法时，就可用低分辨率方法证明是纯的样品，改用高分辨率方法时，就可能证明它是不纯的。而且，每一种方法只能描述样品在某一能证明它是不纯的。而且，每一种方法只能描述样品在某一方面的性质。方面的性质。例如用例如用SDS电泳法进行测定，得到一条均一带。这只能说明电泳法进行测定，得到一条均一带。这只能说明样品在分子量方面是均一的；如果用酶分析法检测污染物，样品在分子量方面是均一的；如果用酶分析法检测污染物，分

147、辨率还能进一步提高，但污染物必须有特异的酶反应性质。分辨率还能进一步提高，但污染物必须有特异的酶反应性质。因此，最好的纯度标准是：建立多种分析方法，从不同的角因此，最好的纯度标准是：建立多种分析方法，从不同的角度去测定蛋白质样品的均一性。下面介绍几种检验纯度的方度去测定蛋白质样品的均一性。下面介绍几种检验纯度的方法法。( (一一) )电泳法电泳法此法最常用于蛋白质纯度鉴定。此法最常用于蛋白质纯度鉴定。样品经凝胶电泳后显示出一条区带，可作为纯度的一个指标，样品经凝胶电泳后显示出一条区带，可作为纯度的一个指标，但这时只能说明，样品在荷质比方面是均一的。如果在不但这时只能说明，样品在荷质比方面是均一

148、的。如果在不同同pHpH下电泳，都得一条区带，这结果就更可靠。下电泳，都得一条区带，这结果就更可靠。SDSPAGSDSPAG电泳后出现一条带，只能说明样品在分子量方面是电泳后出现一条带，只能说明样品在分子量方面是均一的，而且只适用于含有相同亚基的蛋白质。均一的，而且只适用于含有相同亚基的蛋白质。等电聚焦是根据不同蛋白质的等电点不同来分离的。它有很等电聚焦是根据不同蛋白质的等电点不同来分离的。它有很高的灵敏度。使用等电聚焦法的一个问题是，蛋白质有时高的灵敏度。使用等电聚焦法的一个问题是，蛋白质有时能和载体两性电解质结合，因而改变其等电点。由于载体能和载体两性电解质结合，因而改变其等电点。由于载体

149、两性电解质是多种不连接组分构成的，因而在凝胶上可能两性电解质是多种不连接组分构成的，因而在凝胶上可能会出现多条微小的带。所以，当等电聚焦凝胶上只出现一会出现多条微小的带。所以，当等电聚焦凝胶上只出现一个带时，这当然是均一性的很好证明，但出现多条微小带个带时，这当然是均一性的很好证明，但出现多条微小带时，也不能说该样品是不均一的。时，也不能说该样品是不均一的。含脲的凝胶电泳，对检测在低离子强度下不溶的蛋白质的纯含脲的凝胶电泳，对检测在低离子强度下不溶的蛋白质的纯度，非常有用。样品先溶解在脲中、完全变性，然后按电度，非常有用。样品先溶解在脲中、完全变性，然后按电荷和亚基大小来分离。荷和亚基大小来分

150、离。( (二二) )层析性质的考查层析性质的考查当用线性梯度离子交换法或分子筛层析检验样当用线性梯度离子交换法或分子筛层析检验样品时，如果制剂是纯的，则各个分级部分的品时，如果制剂是纯的，则各个分级部分的比活力应当恒定。如果所有部分的比活力都比活力应当恒定。如果所有部分的比活力都相同，则可认为，该样品在层析性质上是均相同，则可认为，该样品在层析性质上是均一的。分析型一的。分析型HPLCHPLC在证明蛋白质均一性上的在证明蛋白质均一性上的分辨率，接近于电泳法。分辨率，接近于电泳法。( (三三) )免疫化学法免疫化学法免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫分析免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、

151、放射免疫分析等，都是鉴定蛋白质纯度的有用方法。特别是放射等，都是鉴定蛋白质纯度的有用方法。特别是放射免疫分析法发展迅速、应用广泛，几乎普及于生物免疫分析法发展迅速、应用广泛，几乎普及于生物体内各种微量成分的测定、灵敏度很高。但缺点是：体内各种微量成分的测定、灵敏度很高。但缺点是：需要一定的设备，操作人员需经特殊训练，长期使需要一定的设备，操作人员需经特殊训练，长期使用时，操作人员的保健与可能造成公害的废弃物的用时，操作人员的保健与可能造成公害的废弃物的处理均存在问题。为克服此缺点，近年发展了以无处理均存在问题。为克服此缺点，近年发展了以无害标记物取代放射性同位素的免疫法，如酶标免疫害标记物取代

152、放射性同位素的免疫法，如酶标免疫分析、发光免疫分析和分析、发光免疫分析和WesternblottingWesternblotting等。等。( (四四) )蛋白质化学结构分析法蛋白质化学结构分析法随着蛋白质分析技术的进步，末端残基的测定方法等，也逐随着蛋白质分析技术的进步，末端残基的测定方法等，也逐渐用于蛋白质纯度的鉴定。对于一个纯蛋白质来说，通过渐用于蛋白质纯度的鉴定。对于一个纯蛋白质来说，通过N-N-末端的定量分析可以发现，每摩尔蛋白质应当有整数摩末端的定量分析可以发现，每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的尔的N N末端氨基酸。少量其它末端基的存在，常常表示制剂末端氨基酸。少量其它末端基的存在，常

153、常表示制剂中存在着杂蛋白。如果只是定性地测定中存在着杂蛋白。如果只是定性地测定N N末端，那么，此法末端，那么，此法就只适用于仅有一条肽链的蛋白质。就只适用于仅有一条肽链的蛋白质。对样品进行总的氨基酸分析，也是检验纯度的一个方法。对对样品进行总的氨基酸分析，也是检验纯度的一个方法。对一个纯蛋白质而言，应当发现，所有的氨基酸都成整数比。一个纯蛋白质而言，应当发现，所有的氨基酸都成整数比。如果含有辅因子的话，辅因子也应计算在内。若有精确、如果含有辅因子的话，辅因子也应计算在内。若有精确、灵敏、快速的氨基酸定量分析仪可供利用的话，此法常被灵敏、快速的氨基酸定量分析仪可供利用的话，此法常被用来鉴定蛋白

154、质的纯度。最终的纯度标准，当然是唯一的用来鉴定蛋白质的纯度。最终的纯度标准，当然是唯一的氨基酸序列，但很少用它来鉴定纯度。氨基酸序列，但很少用它来鉴定纯度。( (五五) )超速离心沉降分析法超速离心沉降分析法 对蛋白质溶液超速离心，在离心管中若出现对蛋白质溶液超速离心，在离心管中若出现明显的分界线，或者分部取出离心管中的明显的分界线，或者分部取出离心管中的样样 品，管号对样品浓度作图后，组分品，管号对样品浓度作图后，组分的分布是对称的，则表明样品是均一的。的分布是对称的，则表明样品是均一的。此法的优点是：时间短，用量少；此法的优点是：时间短，用量少；缺点是：灵敏度较差，微量杂质难以检出。缺点是

155、：灵敏度较差，微量杂质难以检出。 ( (六六) )其它方法其它方法纯蛋白质的纯蛋白质的A280nmA280nmA260nmA260nm应为应为1.751.75，因此，可用分光光度，因此，可用分光光度法检查蛋白质制剂中有无核酸存在。法检查蛋白质制剂中有无核酸存在。对酶来说，对酶来说，酶活力酶活力可作为一个很好的纯度鉴定指标。因为随可作为一个很好的纯度鉴定指标。因为随着杂质的除去，比活增加，当样品不能进一步纯化时，着杂质的除去，比活增加，当样品不能进一步纯化时，比活达到一个恒定的最大值。比活达到一个恒定的最大值。此外，污染蛋白质生物活力的消失也是一个间接的纯度评价此外，污染蛋白质生物活力的消失也是

156、一个间接的纯度评价标准。如果蛋白质含有容易测到的金属，或紧密结合的标准。如果蛋白质含有容易测到的金属，或紧密结合的辅助因子，那么，其含量在纯化过程中将增加。当样品辅助因子，那么，其含量在纯化过程中将增加。当样品达到均一状态时，其含量也就恒定了。达到均一状态时，其含量也就恒定了。利用蛋白质的利用蛋白质的特殊功能特性特殊功能特性( (如激素、酶、氧载体等如激素、酶、氧载体等) )检验纯检验纯度，有很高的灵敏度，有时能检出浓度低到度，有很高的灵敏度，有时能检出浓度低到ppmppm的杂质，的杂质，比许多物化方法的灵敏度要高得多。比许多物化方法的灵敏度要高得多。总而言之；检验蛋白质制剂纯度的最常用的方总而言之；检验蛋白质制剂纯度的最常用的方法是电泳法，然后才是其它方法。如果对样法是电泳法，然后才是其它方法。如果对样品纯度的要求越高，则用来检验纯度的方法品纯度的要求越高，则用来检验纯度的方法应当越多，而且，对所得到的数据的解释，应当越多，而且，对所得到的数据的解释，越应当小心谨慎。越应当小心谨慎。