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1、病理学常用技术在科研中的应用广西医科大学第一附属医院病理科广西医科大学第一附属医院病理科吕自力吕自力尸体剖检尸体剖检 autopsy,gold standard 活体组织检查活体组织检查 biopsy,frozen sections.细胞学检查细胞学检查 cytology（一）人体病理学的诊断和研究方法（一）人体病理学的诊断和研究方法:ABC（二）实验病理学的研究方法（二）实验病理学的研究方法动物实验动物实验 animal experiment组织和细胞培养组织和细胞培养 tissue & cell culture病理学的研究方法病理学的研究方法 病理学的形态观察方法和新技术病理学的形态观察方
2、法和新技术大体观察大体观察组织学和细胞学观察组织学和细胞学观察组织化学和细胞化学组织化学和细胞化学免疫组织化学免疫组织化学超微结构超微结构分子生物学技术分子生物学技术流式细胞术流式细胞术计算机图象分析技术计算机图象分析技术qualitativequantitative病理学的应用范围病理学的应用范围 病因学研究病因学研究发病学的研究发病学的研究基本病理变化基本病理变化揭示疾病的本质、进行揭示疾病的本质、进行病变诊断、分类、分期以及预后判断病变诊断、分类、分期以及预后判断药物选择与疗效观察药物选择与疗效观察新药开发新药开发内内 容容免疫病理学技术免疫病理学技术常规常规HE染色及特殊染色染色及特殊
3、染色分子病理学技术分子病理学技术一、一、HEHE染色在科研中的运用染色在科研中的运用1 1、HEHE染色的用途染色的用途1）组织结构特点2）细胞形态特点2、HE染色流程染色流程固定取材 脱水包埋 切片 染色 观察 3 3、HEHE染色注意事项染色注意事项1 1）标本采集）标本采集组织尽可能多组织尽可能多尽量获取未坏死组织尽量获取未坏死组织 尽量避免挤压组织尽量避免挤压组织 标记标本的方位标记标本的方位3 3、HEHE染色注意事项染色注意事项2 2）固定）固定A.及时固定（离体30分钟内）B.固定液：10%的中性福尔马林固定；C.骨髓活检、睾丸活检标本也可用Bouin液固定 D.电镜标本用2.5
4、%戊二醛固定 E.固定液与标本体积比应大于10：1 F.固定时间：2-4小时（小），12-24小时（大）二、特殊染色在科研中的应用1、目的1）识别病原体：HP, 抗酸，PAS特殊染色的用途2）识别组织：Masson, VG, PAS三、免疫组织化学三、免疫组织化学Immunohistochemistry, IHC原原 理理使用范围使用范围试剂配置试剂配置操作步骤操作步骤免疫组织化学的原理免疫组织化学的原理抗抗原原 + 抗抗体体 - 显显色色原位原位半定量半定量蛋白蛋白用途用途临床病理诊断：肿瘤分类诊断临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：上皮来源：CK，EMA 间叶来源：间叶来源：Viment
5、in 淋巴组织淋巴组织: LCA科研：组织抗原表达情况科研：组织抗原表达情况试剂准备试剂准备切片切片(防脱片防脱片)多聚赖氨酸多聚赖氨酸, APES一抗一抗多抗多抗or单抗单抗,兔兔or鼠鼠, 注意种属特异性，针对检注意种属特异性，针对检测组织种属测组织种属检测试剂盒检测试剂盒EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法）检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）试剂盒（三步法）SABC试剂盒（三步法）试剂盒（三步法）显色试剂盒显色试剂盒DAB试剂盒试剂盒其他其他H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动酸缓冲液），抗
6、原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清物非免疫血清操作步骤操作步骤组织切片脱蜡，水化组织切片脱蜡，水化PBS洗洗3次次 X 3分钟分钟抗原修复抗原修复一抗一抗 （37度度1h，4度过夜）度过夜）封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶PBS洗洗3次次 X 3分钟分钟二抗二抗 （37度度30分钟）分钟）PBS洗洗3次次 X 3分钟分钟苏木素染核苏木素染核自来水洗自来水洗DAB显色显色脱水脱水封片封片PBS洗洗3次次 X 3分钟分钟结果分析和判断结果分析和判断阴性阴性CK胞浆阳性细胞核阳性细胞核阳性-PCNA胞膜阳性胞膜阳性注意事项注意事项（1）判断原则（2）对照设计（3）非特异染色（4）失败的原因
7、及其处置方法（1）判断原则）判断原则必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达对免疫组化标记结果的意义不能绝对化（2）对照设计）对照设计阳性对照：已知阳性表达的组织阳性对照：已知阳性表达的组织自身对照：同一标本中不同组织对照自身对照：同一标本中不同组织对照阴性对照：阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照、阴性试剂对照：空白对照（3）非特异性染色）非特异性染色原因原因组织内源性成分的干扰：组织内源性成分的干扰：内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶-
8、白细胞，红细胞白细胞，红细胞内源性生物素内源性生物素-肝、胰、肾组织肝、胰、肾组织组织处理不当：组织处理不当：内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞白细胞，红细胞内源性生物素内源性生物素-肝、胰、肾组织肝、胰、肾组织（3）非特异性染色）非特异性染色处理方法处理方法抗体：纯化，浓度，时间，温度抗体：纯化，浓度，时间，温度封闭：封闭：H2O2， 非免疫动物血清非免疫动物血清清洗：充分清洗：充分显色：时间显色：时间其他：脱蜡充分，无干片其他：脱蜡充分，无干片（4 4）染色失败的原因及处理方法）染色失败的原因及处理方法试验片：-阳性对照片：-阴性对照片：-空白对照片：-结果：假阴性原因：操作
9、步骤？试剂？试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：+结果：假阳性原因：切片干涸抗体浓度过高缓冲液配制不对冲洗不彻底显色液配制不对显色时间过长载玻片的粘合剂过厚试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：+结果：假阳性原因：非特异染色，与二抗交叉反应。试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：-结果：可疑阳性原因：阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：-结果：阳性原因：方法可靠，实验片含靶抗原。阴性对照切片阴性对照切片-，阳性对照标本和待检，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性测切片呈弱阳性原因：原因：标本固定不当标本固定不当抗
10、体试剂问题：浓度、效价低抗体试剂问题：浓度、效价低抗原修复不当抗原修复不当显色时间短显色时间短切片染色深或整张切片出现染色切片染色深或整张切片出现染色抗体浓度过高切片显色时间过长组织没有正确封闭冲洗不够充分切片出现非特异性背景染色切片出现非特异性背景染色内源性过氧化物酶、内源性生物素过多血清封闭时间过短抗体不纯组织片内出血或坏死成分冲洗不彻底四、免疫荧光技术四、免疫荧光技术将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对 抗原进行细胞定位免疫荧光技术五、分子生物学技术五、分子生物学技术原位杂交原位杂交分子生物学技术分子生物学技术原位杂交和原位原位杂交和原位PCRHPV DNA & CK组织芯片组织芯片HE组织组织芯片芯片免疫学免疫学特染特染病理学病理学技术技术杂交杂交
