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1、动物基因组动物基因组DNA/RNA提取及含量测定提取及含量测定指导教师指导教师:谢承志谢承志目的要求目的要求n学习和掌握从动物组织中提取核酸的原学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术理和操作技术n了解提取了解提取DNA/RNA的几种方法，原理的几种方法，原理和优缺点和优缺点n学习测定学习测定DNA/RNA含量的基本原理及含量的基本原理及具体方法具体方法实验原理实验原理n核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分；核酸是生命的最基本物质。核酸按其化学组成可以分成两大类，一类含D-2-脱氧核糖的称为脱氧核糖核酸DNA），主要存在于细胞核中；另一类含D-核糖的称为核糖核酸RNA),主要存在于细胞
2、质内；在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。由于核酸极不稳定，在较剧烈的化学，物理因素和酶的作用下很易降解，因此在制备时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素作用。n在提取中为防止组织中广泛存在的核酸酶降在提取中为防止组织中广泛存在的核酸酶降解的作用，应在低温下进行，必要时加入抑解的作用，应在低温下进行，必要时加入抑制剂，如柠檬酸盐、氟化钠、砷酸盐等，皂制剂，如柠檬酸盐、氟化钠、砷酸盐等，皂土也可抑制土也可抑制DNA酶的活性，如果采用酶的活性，如果采用SDS)或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸，它或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸，它们同时也可以使核酸降解酶破坏，因此常获们同时也可以使核酸降解酶破坏
3、，因此常获得较好的效果得较好的效果一RNA的提取与测定n由于由于RNA的种类来源很多，因而提取制备的种类来源很多，因而提取制备方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸方法各异，一般有苯酚法，去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆胍法，其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心，后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被酚即溶于上层被酚饱和的水相中，向水相加冷乙醇后，饱和的水相中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的和蛋白质，且获得生物活性的RNAn工业上常用稀碱和浓盐法提工业上常用稀碱和浓盐法提
4、RNA，用这两，用这两种方法提取的核酸均为变性种方法提取的核酸均为变性RNA。主要用。主要用于制备核苷酸的原料，其工艺较简单。于制备核苷酸的原料，其工艺较简单。n浓盐法浓盐法:使用使用10氯化钠的溶液，在氯化钠的溶液，在90摄摄氏度提取氏度提取34小时，经冷却，离心后上清小时，经冷却，离心后上清液由乙醇沉淀液由乙醇沉淀RNA。n稀碱法稀碱法:使用使用0.2氢氧化钠裂解酵母，然氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除蛋白和菌体，上清液由乙后用酸中和，除蛋白和菌体，上清液由乙醇沉淀醇沉淀RNA,或调核酸等电点或调核酸等电点PI2.5沉淀。沉淀。工业提取工业提取nRNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵广
5、泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。母和各种动物组织中。n本实验用动物肝脏经组织捣碎，制成组织匀本实验用动物肝脏经组织捣碎，制成组织匀浆，用浆，用0.14mol/L氯化钠溶液提取。把细胞氯化钠溶液提取。把细胞之中的核糖核蛋白提取出来，留下含有之中的核糖核蛋白提取出来，留下含有DNA的细胞核物质，用酚将的细胞核物质，用酚将RNA和蛋白质分开。和蛋白质分开。因为在因为在0.14mol/L氯化钠溶液中，氯化钠溶液中，RNA蛋蛋白白(RNP)溶解度大；而溶解度大；而DNA蛋白蛋白(DNP)溶溶解度低，其在解度低，其在1mol/L氯化钠溶液中溶解度氯化钠溶液中溶解度最大。最大。RNA含量
6、测定含量测定nRNA含量的测定方法很多：紫外吸收法、定磷法、含量的测定方法很多：紫外吸收法、定磷法、地衣酚地衣酚n本实验用地衣酚测定，其原理是：当本实验用地衣酚测定，其原理是：当RNA与浓盐酸与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与后者与3.5二羟基甲苯地衣酚反响，在铁或二羟基甲苯地衣酚反响，在铁或铜离子催化下，生成鲜绿色复合物，反应在铜离子催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，处有最大吸收峰，RNA浓度在浓度在10-100g/ml范围内，光吸收与范围内，光吸收与RNA浓度成正比，浓度成正比，地衣酚特异性差，
7、凡戊糖均有些反应。地衣酚特异性差，凡戊糖均有些反应。试剂和器材试剂和器材n资料：动物肝脏资料：动物肝脏n试剂：试剂：n0.14mol/L氯化钠氯化钠n标准标准RNA溶液：溶液：100g/mln地衣酚试剂地衣酚试剂(现用现配现用现配)n80苯酚溶液苯酚溶液n95乙醇乙醇n器材：匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、器材：匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等量筒等RNA提取提取n匀浆：称取匀浆：称取3克牛肝剪碎，加克牛肝剪碎，加20ml0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液10000r/min左右匀浆左右匀浆1分钟左右分钟左右n离心：匀浆后溶液离心离心：匀浆后溶液离心8000r/min离心离心7分
8、钟，量取上清分钟，量取上清液毫升数，沉淀物留做提取液毫升数，沉淀物留做提取DNA用用n除杂质：加等体积除杂质：加等体积80酚溶液于上清液中，搅拌充分混合酚溶液于上清液中，搅拌充分混合1020分钟，置冰箱冷却静止分钟，置冰箱冷却静止30-40分钟，离心取上层水分钟，离心取上层水相含有相含有RNA，弃下层酚相含蛋白质和，弃下层酚相含蛋白质和DNA等杂质等杂质n沉淀沉淀RNA:取上层水相含取上层水相含RNA溶液，加入溶液，加入2倍体积倍体积95冷乙冷乙醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却，至出现白色絮状物醇，搅拌，充分混合，置冰箱中冷却，至出现白色絮状物RNA，离心，离心8000rn/min离心离心7分
9、钟，取沉淀物分钟，取沉淀物n溶解：用少量去离子水约溶解：用少量去离子水约4毫升溶解沉淀物，用以测定毫升溶解沉淀物，用以测定其含量其含量RNA含量测定取8支试管,6支试管按上表所添加各种试剂绘制标准曲线。另2管各加入0.4ml、0.6ml待测液，再加1.6ml和1.4ml水和2.0ml地衣酚试剂，加毕，摇匀，8支试管统一沸水加热25分钟，取出后冷水冷却，测定各管OD670为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，并计算提出的RNA 的量和收率。(控制RNA浓度在10-100g/ml之内）n思考题思考题nRNA提取方法有几种？有什么优缺提取方法有几种？有什么优缺点？点？nRNA提取过程中应注意什么？提取过
10、程中应注意什么？DNA的提取及含量测定的提取及含量测定nDNA提取n 小牛胸腺，鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液，如1mol/l氯化钠，但在0.14mol/l氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白则在0.14mol/l氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开，分离得到DNA蛋白。n本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠SDS)溶液，使其DNA与蛋白质分离开来，蛋白变性，冷却，离心除蛋白，加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/l，则DNA溶解，加氯仿去除蛋白质，也可进一步重复操作得较纯DNA，最后用95%乙醇沉淀DNA。
11、经常采用三种方法去除蛋白经常采用三种方法去除蛋白n变性剂法: 用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNAn苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品n氯仿法: 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来DNA含量的测定含量的测定n二苯胺法：n 强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在5
12、95nm处有最大吸收。DNA在40-400g范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。n目的基因含量的测定：凝胶电泳，定量PCR试剂和器材试剂和器材n试剂：n生理盐水n10SDSn氯化钠n95乙醇n氯仿-异戊醇混合液nDNA标准溶液：用0.01mol/lNaOH配成200g/ml溶液n二苯胺试剂现用现配）n器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等DNA的提取的提取n溶解：将离心后除去溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用的沉淀，用30m
13、l生理盐水溶解，生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升毫升10SDS溶液，使溶溶液，使溶液的液的SDS浓度达到浓度达到1左右，边加边搅拌，放置左右，边加边搅拌，放置60水水浴保温浴保温10分钟不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使分钟不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到溶液氯化钠浓度达到1mol/l，充分搅拌，充分搅拌10分钟。分钟。n除杂质：加等体积氯仿除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡异戊醇混合液，充分震荡10分钟分钟静置分层，取上，中两层离心，静置分层，取上，中两层离心，8000rn/min离心离心7分分钟，取上清液量好体积，倒与烧杯中
14、，加同体积的氯仿钟，取上清液量好体积，倒与烧杯中，加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止。胶为止。n沉淀：准确量取上清液体积，加沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积倍体积95冷乙醇，冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约30-50分钟，离心分钟，离心8000rn/min离心离心7分钟，得白色沉淀分钟，得白色沉淀n溶解：将沉淀物用溶解：将沉淀物用0.1mol/lNaOH约约4毫升溶解毫升溶解DNA含量测定l1.DNA标准曲线的制定标准曲线的制定6支试管，依
15、次加入支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.2、1.6和和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。然后。然后各加入各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温恒温水浴中保温1h，冷却后于冷却后于595nm处进行比色测定。以处进行比色测定。以DNA浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。l2.制品的测定制品的测定取取2支试管，各加支试管，各加2ml待测液内含待测液内含DNA应在标准曲线的应在标准曲线的可范围之内和可范围之内和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线二苯
16、胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。的制作。l3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值收值DNA的含量，计算出的含量，计算出DNA中的量及收率中的量及收率.思考题思考题n二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什么？n除杂质常用那些方法？3g肝脏肝脏 + 20mL0.14mol/ L氯化钠氯化钠 匀浆匀浆, 1min 离心离心8000rn/min, 7min 等体积等体积80酚酚搅拌搅拌10-20min, 冰箱静置冰箱静置30min8000rn/min,7min上清液上清液RNA、多糖、多糖下层下层DNA、蛋白、蛋白加加95乙醇乙醇2倍倍冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀离心离心/RNA沉淀沉淀离心离心/DNA冰箱至出现白色沉淀冰箱至出现白色沉淀加加95乙醇，乙醇， 2倍倍等体积氯仿，震荡等体积氯仿，震荡10min/离心离心加氯化钠加氯化钠, 至至1mol/L, 搅拌搅拌10min4ml 10SDS,60,10min30ml生理盐水溶解生理盐水溶解工工 艺艺 图图 上清液上清液
