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1、第十章 初级代谢产物本章主要内容本章主要内容第一节、氨基酸生产工艺第二节、有机酸生产工艺第三节、有机溶剂生产工艺第四节、核苷类物质生产工艺第五节、维生素生产工艺第六节、再生能源第一第一节 氨基酸生氨基酸生产工工艺一、氨基酸简介二、发酵法生产氨基酸三、谷氨酸发酵机制及工艺一、氨基酸简介 氨基酸发酵氨基酸发酵 氨基酸：合成法、抽提法 氨基酸工业起源于日本 1909年面筋酸水解生产谷氨酸 1956年由发酵法生产谷氨酸 我国氨基酸发酵工业1964年上海投产 赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等12种氨基酸 一. 氨基酸的用途 （一）食品工业 甜味剂：甘氨酸、丙氨酸 酸味剂：天门冬氨酸、谷氨酸等
2、鲜味剂：天门冬氨酸钠、谷氨酸钠等 甘氨酸：可用于清凉饮料 赖氨酸：加强食品、饲料 天冬甜肽（Aspartom）： L-Asp和L-phe合成 美国Searle公司30年前低热量营养性甜味剂 口感近似蔗糖，甜度为蔗糖的2530倍，热量仅为蔗糖的1/160，全球总销量已1.5万吨阿丽泰(Alitame)：由天冬氨酸与丙氨酸合成 甜味更纯正，耐热性更好，最适用于面包、饼干、蛋糕等焙烤食品聚赖氨酸：食品保鲜剂、肉类、家禽、海产、面包饼干和各种谷物食品的防腐保鲜；高级吸水性聚合物：婴儿尿片等产品日本年产已达1千多吨聚谷氨酸：绿色塑料食品包装到一次性餐具和其它各种工业用途它在自然界中可迅速降解不环境污染日
3、本已开发成功并有产品上市 （二） 医药工业 1. 氨基酸混合液：高营养液 2. 治疗用： 1）肝脏治疗：精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸用以降低血氨 异亮氨酸、亮氨酸等纠正血浆氨基酸失衡 蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝 2）消化道疾病治疗：谷氨酰胺、苏氨酸治疗消化道溃疡, 亮氨酸、 谷氨酸调节胃液酸度 3）脑病治疗： L-谷氨酸与L-谷氨酰胺改善脑出血后遗症的记忆障碍 -氨基酸治疗癫痫等 左旋多巴用于震颤性麻痹等 4）心血管治疗 天冬氨酸用于心率失常（三）化妆品 胱氨酸用于护发 丝氨酸用于雪花膏 谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂有洗净、抗菌作用 谷氨酸碱盐、精氨酸碱盐：化
4、妆品对皮肤无刺激性 （四）其他 甘氨酸为除草剂成分 聚谷氨酸是合成皮革原料和表面活性剂原料 四大饲料氨基酸：蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸 色氨酸：提高猪的瘦肉率，减少脂肪使猪肉味道更鲜美聚精氨酸： 农用地膜 作为洗涤剂、废水处理剂等工业用途氨基酸的生产方法：1.抽提法半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸的生产由于没有其他适当方法，目前还是用抽提法。2.直接发酵法按照菌株的特性，直接发酵法可分为四类.使用野生型菌株或野生菌株的诱变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸谷氨酸丙氨酸缬氨酸.使用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸亮氨酸缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸脯氨酸缺失限制限制E的浓度，解
5、除反馈抑制的浓度，解除反馈抑制.由氨基酸结构类似物抗性突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸脯氨酸蛋氨酸.使用营养缺陷型兼抗性突变株生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸异亮氨酸亮氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸高丝氨酸3. 添加中间产物的发酵以氨基酸的中间产物为原料，用微生物转化相应的氨基酸，这样可以避免氨基酸生物合成途径中的反馈抑制作用。丝氨酸色氨酸蛋氨酸异亮氨酸4. 酶法 应用完整菌体或自微生物细胞抽提出酶类制造氨基酸丙氨酸天冬氨酸酪氨酸多巴（二羟基苯丙氨酸）色氨酸5-羟基色氨酸赖氨酸5. 合成法丙氨酸天冬酰胺甘氨酸蛋氨酸丝氨酸
6、色氨酸苯丙氨酸二、发酵法生产氨基酸由于发酵法生产氨基酸，其原料廉价易得，生产条件温和，并且随着微生物代谢调节理论研究的发展，目前大部分氨基酸都以发酵法进行生产。 典型的代谢控制发酵典型的代谢控制发酵 发酵产物氨基酸：中间代谢产物发酵产物氨基酸：中间代谢产物 积累：要求微生物正常代谢的抑制积累：要求微生物正常代谢的抑制 关键：控制机制被解除，打破微生物关键：控制机制被解除，打破微生物正常代谢调节正常代谢调节氨基酸发酵氨基酸发酵的代谢控制氨基酸发酵工艺控制和选育氨基酸高产菌株的依据有以下几个方面：1.控制发酵环境条件2. 控制细胞渗透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素 细胞内生物素水平高，谷氨酸不能通
7、过细胞膜表面活性剂增加细胞膜通透性青霉素影响细胞壁合成表面活性剂引引起起细细胞胞膜膜的的脂脂肪肪酸酸成成分分的的改改变变，改改变变其其通通透透性性抑制合成3. 控制旁路代谢4. 降低反馈作用物浓度目的产物缺失酶5. 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用目的产物6.促进ATP积累，以利于氨基酸的生成-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸- -谷氨酰磷酸谷氨酰磷酸谷氨酸半缩醛谷氨酸半缩醛1-1-吡咯啉吡咯啉-5-5-羧酸羧酸脯氨酸脯氨酸草酰乙酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半缩醛天冬氨酸半缩醛高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸-酮基丁酸酮基丁酸异亮氨酸异亮氨酸赖氨酸赖氨酸蛋氨酸蛋氨酸ATPA
8、DP苏氨酸脱水酶苏氨酸脱水酶反馈抑制缺失天冬氨酸激酶高丝氨酸激酶高丝氨酸激酶黄色短杆菌（异亮氨酸缺陷型）的脯氨酸发酵机制黄色短杆菌（异亮氨酸缺陷型）的脯氨酸发酵机制氨基酸发酵的代谢控制1.1.控制发酵环境条件控制发酵环境条件2. 2. 控制细胞渗透性控制细胞渗透性3. 3. 控制旁路代谢控制旁路代谢4. 4. 降低反馈作用物浓度降低反馈作用物浓度5. 5. 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用消除终产物的反馈抑制与阻遏作用6. 6. 促进促进ATPATP积累，以利于氨基酸的生成积累，以利于氨基酸的生成三、谷氨酸发酵（一）、谷 氨 酸 发 酵 机 制.谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径途径HMP
9、途径途径TCA循环循环乙醛酸循环乙醛酸循环CO2固定反应固定反应总反应途径 糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA循环，由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。CO2总反应式和理论转化率总反应式总反应式 C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4N +CO2+3H2O理论转化率：理论转化率： （147/180） 100%=81.7%EMP途径和HMP途径1.EMP途径途径葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 生成不同产物生成不同产物2. HMP途径途径6-磷酸
10、葡萄糖 -磷酸葡萄糖酸 5-磷酸戊糖 2C化合物5-磷酸戊糖 3C化合物 TCA循环6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶戊糖代谢分解戊糖代谢分解生物素充足：生物素充足：HMP途径所占比例为途径所占比例为38%生物素亚适量：生物素亚适量：HMP途径所占比例为途径所占比例为26%TCA、DCA循环和CO2固定1.TCA循环丙酮酸乙酰CoA丙糖-3-磷酸草酰乙酸柠檬酸TCA氧化CO2固定CO2氧化-酮戊二酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生物合成中非常重要谷氨酸高产菌应丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力-酮戊二酸琥珀酰CoA琥珀酸-酮戊二酸脱氢酶若-酮戊二酸脱氢酶活力很弱，就使糖代
11、谢流进入TCA循环后受阻在-酮戊二酸处-酮戊二酸NH4+、谷氨酸脱氢酶谷氨酸2.DCA循环乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸异柠檬酸琥珀酸乙醛酸乙酰CoA苹果酸异柠檬酸裂解酶苹果酸合成酶苹果酸脱氢酶柠檬酸合成酶CO2DCA循环的生理意义作为作为TCA循环有缺陷时循环有缺陷时C4二羧酸的补充，二羧酸的补充，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是它是C4二羧酸的唯一补充来源二羧酸的唯一补充来源作为能量供给来源的末端氧化系作为能量供给来源的末端氧化系TCA循环和DCA循环以醋酸为唯一碳源的菌体实验表明：菌体以醋酸为唯一碳源的菌体实验表明：菌体内有机酸浓度低到需要内有机
12、酸浓度低到需要DCA循环运转时，循环运转时，由异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细由异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶；胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶；由于由于DCA循环运转，循环运转，TCA循环有机酸过剩，循环有机酸过剩，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环循环运转运转有机酸浓度低有机酸浓度低乙醛酸、草酰乙酸乙醛酸、草酰乙酸异柠檬酸脱氢酶抑制异柠檬酸脱氢酶抑制DCA循环运转循环运转DCADCA循环运转循环运转TCATCA循环有机酸过剩循环有机酸过剩
13、异柠檬酸裂解酶抑制异柠檬酸裂解酶抑制乙醛酸浓度降低乙醛酸浓度降低异柠檬酸脱氢酶抑制解除异柠檬酸脱氢酶抑制解除 TCATCA循环运转循环运转在糖质原料的谷氨酸发酵中，在谷氨酸生成期，如果葡萄糖先转化为醋酸，再由DCA循环提供C4二羧酸合成谷氨酸，谷氨酸对糖的转化率就大为减少。3C6H12O6 6丙酮酸丙酮酸 6醋酸醋酸6醋酸醋酸 +2NH3+3O2 2C5H9O4N+2CO2+6H2O转化率：转化率：2 147/（3180）100%=54.4%在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨酸生成期酸生成期DCA循环应该关闭循环应该关闭3.CO2固定在谷氨酸产
14、生菌中已检出两种在谷氨酸产生菌中已检出两种CO2固定酶：固定酶：磷酸烯醇丙酮酸（磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶和苹果酸酶）羧化酶和苹果酸酶PEP+CO2+GDP 草酰乙酸草酰乙酸+GTPPEP羧化酶羧化酶丙酮酸丙酮酸 苹果酸苹果酸 草酰乙酸草酰乙酸苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶苹果酸酶苹果酸酶CO2 NAD+ NADH+H+CO2CO2PEP+PEP羧化酶羧化酶丙酮酸激酶1，6-二磷酸果糖PEP羧化酶对PEP的表现亲和力约是丙酮酸激酶的1/10与与二二磷磷酸酸果果糖糖共共同同激激活活PEP羧羧化化酶酶PEP浓度低浓度低PEP易进易进入分解途入分解途径径乙酰乙酰- -CoA浓度增加浓度增加转向转向CO
15、2固定固定草酰乙酸草酰乙酸TCA循环中循环中间产物浓度间产物浓度增加增加抑制抑制PEP羧羧化酶化酶防止防止过剩过剩乙酰乙酰- -CoA氧化氧化ATP水平提高水平提高抑制丙酮抑制丙酮酸激酶酸激酶所以在谷氨酸发酵所以在谷氨酸发酵中，糖的分解代谢中，糖的分解代谢途径与途径与COCO2 2固定的固定的适当比例是提高谷适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关氨酸对糖收率的关键问题。键问题。生物合成和需能反应生物合成和需能反应ATP浓度浓度降低降低解除解除抑制抑制丙酮丙酮酸激酸激酶酶氨的导入氨的导入方式：糖代谢中间体糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸谷氨酸天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移
16、作用将氨天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给基转给-酮戊二酸而生成酮戊二酸而生成谷氨酸合成酶途径谷氨酸合成酶途径柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸谷谷氨氨酸酸NADPH+H+NADPNH4+糖代谢中间体糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶：需：需NADP为辅酶，催化为辅酶，催化-酮戊二酸酮戊二酸的生成（谷氨酸的前体），的生成（谷氨酸的前体），并为谷氨酸脱氢酶提供辅酶并为谷氨酸脱氢酶提供辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶：需：需NADPH +H+为辅酶为辅酶活细胞中，异柠檬酸脱氢活细胞中，异柠檬酸脱氢酶活性小于谷氨酸脱氢酶
17、酶活性小于谷氨酸脱氢酶活性，所以活性，所以NADP浓度是浓度是实际上的限速因子实际上的限速因子异柠檬酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对黄色短杆菌中，谷氨酸脱氢酶对-酮戊二酸和酮戊二酸和谷氨酸表现出同促相互作用谷氨酸表现出同促相互作用，低浓度的，低浓度的-酮戊二酸和谷酮戊二酸和谷氨酸对此酶有显著的激活作用。氨酸对此酶有显著的激活作用。 当谷氨酸浓度为当谷氨酸浓度为100mmol/L100mmol/L时，抑制酶活时，抑制酶活6565，浓度为，浓度为400mmol/L400mmol/L时抑制时抑制9090，这比其他的反馈抑制要明显的弱，这比其他的反馈抑制要明显的弱，因而在谷氨酸发酵中
18、菌体内游离出来的谷氨酸浓度就要高，因而在谷氨酸发酵中菌体内游离出来的谷氨酸浓度就要高，可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的调节作可以认为这个调节机制对谷氨酸生产发挥着很好的调节作用。用。调节机制 调节机制生物素 细胞膜通透性葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰-CoA草酰乙酸柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸天冬氨酸反馈抑制增强反馈抑制逆转反馈抑制反馈抑制优先合成生物素亚适量使得最后一代细菌生物素亚适量使得最后一代细菌细胞变形、拉长，改变了细胞膜的细胞变形、拉长，改变了细胞膜的通透性，引起代谢失调，使谷氨酸通透性，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累得以积累调节机制谷氨酸发酵中，糖代谢除受到生物素控制外，也
19、受到NH4+的影响。使用生物素缺乏菌，在NH4+存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。当NH4+不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。（二）、谷氨酸生产的工艺流程微生物生长动力学模型的建立微生物生长动力学模型的建立培养基的配制与灭菌菌种的扩大培养菌体浓度限制性基质浓度建立微生物生长动力学模型发酵过程中主要参数的检测生化反应器重要参数生化反应器重要参数KLa的检测的检测亚硫酸钠氧化法动态法(溶氧电极法)发酵酵动力学力学实验 上罐实消培养基的配制三角瓶培养冷却接种固体斜面培养发 酵发 酵 液发酵过程参数的控制OD值pH温度搅拌速度、 DO值发酵过程参数测定还原糖的测定谷氨酸的测定菌体形态观察菌体浓度测定 谷氨酸生产工艺流程pH7.0，流加尿素调节（0.40.6）测定菌体密度，OD值不再上升时，菌体分裂完成，约12h前期(012h) 3335;中后期(35h)3638通气比：1: (0.080.1) 100吨罐32 ,pH7.0,OD=1.032 ,pH7.0,1824h
