项目九血清学试验

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1、项目九血清学试验 一、抗原一、抗原( (Antigen，Ag) ) 能刺激机体产生特异性免疫应答，且能刺激机体产生特异性免疫应答，且能与其免疫应答产物能与其免疫应答产物( (抗体或致敏淋巴细抗体或致敏淋巴细胞胞) )在体内或者体外结合，并发生一系列生物在体内或者体外结合，并发生一系列生物学效应的物质。学效应的物质。T细细胞胞胞胞B细胞胞AgT TB BT T浆细胞胞致敏致敏T细胞胞抗体抗体 （一）抗原的两种基本特性（一）抗原的两种基本特性 1.1.免疫原性免疫原性 指抗原分子能指抗原分子能够刺激机体刺激机体产生免疫生免疫应答答( (产生特异性抗体及免疫效生特异性抗体及免疫效应细胞胞) )的性的

2、性质。 AgT TB BT T浆细胞胞致敏致敏T细胞胞抗体抗体 2.2.抗原性抗原性( (又称免疫反又称免疫反应性性) ) 指抗原分子与免疫指抗原分子与免疫应答答产物物( (抗体或免疫效抗体或免疫效应细胞胞) )发生特异性生特异性结合的性合的性质。AgT TB BT T浆细胞胞致敏致敏T细胞胞抗体抗体1 1. .抗原本身的理化性抗原本身的理化性质2.2.抗原与机体的相互作用（免疫方式）抗原与机体的相互作用（免疫方式） （1 1）异物性）异物性: :非己的异物非己的异物 异种物异种物质质: : 病原微生物、异种蛋白、病原微生物、异种蛋白、药药物物 种系关系相差越种系关系相差越远远，免疫原性越，免

3、疫原性越强强 同种异体同种异体: : 血型抗原、血清蛋白血型抗原、血清蛋白 自身物自身物质质: : 精子、晶状体蛋白等精子、晶状体蛋白等（2 2）表面具有复）表面具有复杂化学化学结构的大分子构的大分子 在一定范在一定范围内，分子量越大，内，分子量越大，结构越复构越复杂，其表，其表面抗原决定簇越多，免疫原性越面抗原决定簇越多，免疫原性越强（二）（二） 构成抗原的基本条件构成抗原的基本条件（三）（三） 抗原的特异性抗原的特异性物物质基基础：抗原决定簇：抗原决定簇 特异抗原只能刺激机体特异抗原只能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋生特异性抗体或致敏淋巴巴细胞，且胞，且仅能与能与该特异性抗体或淋巴特异性抗

4、体或淋巴细胞胞结合并合并相互作用相互作用抗原决定簇（抗原决定簇（ADAD） 概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基学基团团，又称，又称为为表位表位 ADAD的数目、性的数目、性质质和空和空间间构象决定抗原特异性构象决定抗原特异性 抗原以抗原以ADAD与相与相应应抗原受体及抗体特异性抗原受体及抗体特异性结结合合 二二、抗体、抗体( (A Antibody，Ab) ) 机体免疫细胞被抗原激活后，由机体免疫细胞被抗原激活后，由B B细胞细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球相应抗原特异

5、性结合的具有免疫功能的球蛋白。蛋白。 免疫球蛋白免疫球蛋白( (immunoglobulin, Ig) )(1)(1)定定义义：抗体和化学：抗体和化学结结构与抗体相似的球蛋白的构与抗体相似的球蛋白的统统称。称。 (2)(2)存在形式：存在形式： 膜型膜型 B B细细胞膜上的抗原受体胞膜上的抗原受体 分泌型分泌型分泌分泌进进入入血清等血清等体液体液中中, , 介介导导体液免疫体液免疫应应答答1 1、免疫球蛋白的分子、免疫球蛋白的分子结结构构1 1）重）重链（H H链）和）和轻链（L L链）2 2）可）可变区（区（V V区）和恒定区（区）和恒定区（C C区）区）3 3）铰链区区4 4）水解片段）水

6、解片段1 1、免疫球蛋白的分子、免疫球蛋白的分子结结构构2 2、免疫球蛋白的生物学特征、免疫球蛋白的生物学特征主要功能：以主要功能：以lgGlgG为为例例V VH H和和V VL L区：特异性区：特异性识别识别、结结合合AgAgC CH H1 1和和C CL L区：区：遗传标记遗传标记C CH H2:2:补补体的体的结结合点合点C CH H3:3:细细胞表面胞表面F FC C受体的受体的结结合点合点三、三、补体系体系统补体：活化后具有体：活化后具有酶活性的蛋白活性的蛋白质，可，可辅助抗助抗体介体介导的溶菌作用，是抗体的溶菌作用，是抗体发挥溶溶细胞作用的胞作用的必要必要补充充补体系体系统是由存在

7、于人或脊椎是由存在于人或脊椎动物血清与物血清与组织液液中的一中的一组可溶性蛋白及存在于血可溶性蛋白及存在于血细胞与其它胞与其它细胞胞表面的一表面的一组膜膜结合蛋白和合蛋白和补体受体所体受体所组成。成。1 1、组成成2 2、激活途径、激活途径3 3、补体的生物学作用体的生物学作用细胞毒及溶菌胞毒及溶菌/ /溶病毒作用：溶病毒作用：补体激活体激活产生生MACMAC，形，形 成穿膜的通道，成穿膜的通道，导致致细胞崩解。胞崩解。调理作用：通理作用：通过与吞噬与吞噬C C表面表面结构构结合而促合而促进其吞噬作其吞噬作用用( (抵抗全身性抵抗全身性细菌和真菌感染的主要机制之一菌和真菌感染的主要机制之一)

8、)。免疫粘附作用：抗原免疫粘附作用：抗原-抗体复合物抗体复合物活化活化补体体与与补体受体受体体阳性阳性细胞粘附胞粘附 将抗原将抗原-抗体复合物抗体复合物转移至肝、脾移至肝、脾巨噬巨噬C清除。清除。炎症介炎症介质作用作用- - C3a/C5a与肥大与肥大C/嗜碱粒嗜碱粒C表面受体表面受体结合合触触发靶靶C脱脱颗粒粒/释放放组胺等介胺等介质介介导局部炎症反局部炎症反应。补体功能及生物学意体功能及生物学意义：抗体抗体产生的一般生的一般规律律抗体抗体产生生规律可分律可分为初次初次应答和再次答和再次应答答初次初次应答：潜伏期答：潜伏期长，效价低，持，效价低，持续时间短，短，免疫作用不免疫作用不强再次再次

9、应答：潜伏期短，抗体答：潜伏期短，抗体产生量大，生量大，维持持时间长抗体产生的一般规律血清学血清学试验定定义：是指相：是指相应的抗原和抗体在体的抗原和抗体在体外外进行的行的结合反合反应试验材料：含有抗体的血清；抗原材料：含有抗体的血清；抗原物物质原理：抗原和抗体具有高度特异性原理：抗原和抗体具有高度特异性血清学血清学试验的一般特点的一般特点特异性特异性可逆性可逆性比例性比例性阶段性段性稳定性定性特异性特异性&特异性是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体发生反应。因因为抗体抗体CDR与抗原决定簇在化学与抗原决定簇在化学结构和空构和空间构型上呈互构型上呈互补关系。关系。这种高度的特异性在

10、种高度的特异性在传染病的染病的诊断、防治等断、防治等医学和生物学医学和生物学领域都已得到了广泛的域都已得到了广泛的应用。用。&大多数天然抗原物质的构成复杂，常含有多种抗原决定簇。如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应（cross reaction）。可逆性可逆性&可逆性是指在一定条件（如低pH、高浓度盐等）下，抗原抗体复合物分子间作用力减弱而导致解离，回复到抗原与抗体的游离状态。抗原抗体反抗原抗体反应遵循生物大分子遵循生物大分子热动力学反力学反应原原则，其反，其反应式式为：&抗原抗体反应平衡取决于两个因素，一是抗原抗体亲合力大小；二是环境因

11、素对复合物的影响。比例性比例性&比例性是指多价抗原与抗体反应，只有当二者浓度比例适当时，才形成大的抗原抗体结合物，产生凝集、沉淀等可见反应。把最迅速出把最迅速出现可可见反反应时的抗原抗体的的抗原抗体的浓度度比或量比，称比或量比，称为抗原抗体反抗原抗体反应的等价点的等价点（equivalence point），抗原与抗体比例最），抗原与抗体比例最合适的范合适的范围围称称等价等价带带（equivalencezone）。&Marrack提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制。网格学网格学说说&当多价抗原与多价抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。&

12、当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成较小复合物，不能出现可见反应。血清学血清学试验的影响因素的影响因素 影影响响抗抗原原抗抗体体反反应的的因因素素较多多，主主要要有有两两方方面面: :一一方方面面是是受受到到抗抗原原、抗抗体体的的自自身身因因素素的的影影响响; ;另另一一方方面面是是受受到到电解解质、酸酸碱碱度度、温温度度及及时间等等实验环境因素的影响。境因素的影响。一、反一、反应物自身因素物自身因素抗原抗原: :理化性状、表位种理化性状、表位种类和数目和数目抗体抗体: :来源、特异性、来源、特异性、亲和性、效价和性、效价抗原的理化性状、抗原决定簇的数抗原的理化性状、抗原

13、决定簇的数目和种目和种类均可影响血清学反均可影响血清学反应结果果 例如，可溶性抗原与相例如，可溶性抗原与相应抗体反抗体反应出出现沉淀，而沉淀，而颗粒性抗原与相粒性抗原与相应抗抗体反体反应则出出现凝集凝集 1、抗原、抗原 抗抗体体是是血血清清学学反反应应中中的的关关键键因因素素，对对反反应应的的影影响表现在以下三个方面响表现在以下三个方面: :(1)(1)来源来源: :来自不同动物的免疫血清，其反应性来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合

14、物可溶性免疫复合物; ;马等大动物和人的免疫血马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物可形成可溶性免疫复合物2 2、抗体、抗体(2)(2)特异性与亲和力特异性与亲和力: :特特异异性性和和亲和和力力是是影影响响血血清清学学反反应的的两两个个关关键因因素素，它它们共共同同影影响响试验结果果的的准准确确程程度度。用用于于诊断断的的试剂必必须尽尽量量选用用特特异异性性高高、亲和和力力强的的抗抗体体，才才能能保保证和提高和提高试验结果的可靠性。果的可靠性。 （3 3）浓浓度度: :抗体的抗体的浓浓度往往是与抗原相度往往是与

15、抗原相对对而言。合而言。合适的适的浓浓度才出度才出现现明明显显的反的反应现应现象。因此象。因此许许多多试验应进试验应进行抗体行抗体预预滴定，找出最适反滴定，找出最适反应浓应浓度。度。 电电解解质质: : 生理生理盐盐水或水或缓缓冲液冲液酸碱度酸碱度: pH6: pH6pH9pH9温温 度度: 15: 154040，3737最适最适二、二、环境因素境因素l.电电解解质质抗抗原原抗抗体体结结合合后后由由亲亲水水性性变变为为疏疏水水性性，此此时时易易受受电电解解质质影影响响，如如有有适适当当浓浓度度电电解解质质存存在在，就就会会使使抗抗原原抗抗体体失失去去一一部部分分电电荷荷而而相相互互凝凝集集或或

16、沉沉淀淀，出出现现可可见见反反应应; ;若若无无电电解解质质存存在在，则则不出不出现现可可见见反反应应。 通常在血清学试验中，以通常在血清学试验中，以8 8. .5g/LNaCl5g/LNaCl溶液作溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中为抗原抗体的稀释液及反应液，其中NaNa+ +和和ClCl- -可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果电解质浓度过高，则会出现集物。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。非特异性蛋白质沉淀，即盐析。 2.2.酸碱度酸碱度 合适的

17、合适的pHpH是抗原抗体反是抗原抗体反应应的必要条的必要条件之一。血清学件之一。血清学试验试验一般以一般以pH6-9pH6-9为为宜，超宜，超出此范出此范围围可影响抗原和抗体的理化性可影响抗原和抗体的理化性质质，导导致假阳性或假阴性致假阳性或假阴性结结果。当果。当pHpH为为3 3左右左右时时，接，接近近细细菌抗原的等菌抗原的等电电点，可出点，可出现现非特异性酸凝非特异性酸凝集，造成假象。集，造成假象。 3.3.温温度度 抗抗原原抗抗体体反反应应一一般般在在1515一一4040范范围围内内均均可可进进行行，最最适适温温度度为为3737。在在此此范范围围内内温温度度越越高高，分分子子运运动动速速

18、度度加加快快，增增加加抗抗原原抗抗体体接接触触机机会会，反反应应速速度度越越快快，但但亦亦容容易易引引起起复复合合物物解解离离; ;温温度度越越低低，反反应应速速度度缓缓慢慢，但但抗抗原原抗抗体体结结合合牢牢固固，易易于于观观察察。某某些些特特殊殊的的抗抗原原抗抗体体反反应应需需要要特特定定的的温温度度，如如冷冷凝凝集集素素在在44时时与与红红细细胞胞结结合，合，2020以上反而解离。以上反而解离。4、作用、作用时间时间抗原抗体反抗原抗体反应应应应有足有足够够的的时间时间，不同反，不同反应时间应时间不同。不同。此外，抗原抗体反此外，抗原抗体反应应在液相中反在液相中反应时应时，适当振，适当振荡荡

19、与与搅搅拌，也可促拌，也可促进进抗原抗体分子的接触，加速反抗原抗体分子的接触，加速反应应。 主要的抗原抗体反主要的抗原抗体反应1 1、凝集反应（、凝集反应（Agglutination)Agglutination)2 2、沉淀反应、沉淀反应(Precipitation)(Precipitation)3 3、补体结合试验、补体结合试验(Complement(Complement fixation test fixation test ,CFT),CFT)4 4、中和试验、中和试验(Neutralization test)(Neutralization test)1、凝集反、凝集反应应（Agglut

20、ination)颗颗粒性抗原（完整的粒性抗原（完整的细细菌菌细细胞或胞或红细红细胞等）与其相胞等）与其相应应的的抗体在合适条件下反抗体在合适条件下反应应并出并出现现凝集凝集团团的的现现象。象。用于凝集反用于凝集反应应中的抗原称凝集原中的抗原称凝集原(agglutinogen)(agglutinogen)。用于凝集反用于凝集反应应中的抗体称凝集素（中的抗体称凝集素（agglutinin)agglutinin)。2、沉淀反、沉淀反应应(Precipitation)可溶性抗原（蛋白可溶性抗原（蛋白质质、多糖或、多糖或类类脂溶液、血清、脂溶液、血清、细细菌抽菌抽提液、提液、组织组织浸出液等）与其相浸出

21、液等）与其相应应的抗体在合适条件下反的抗体在合适条件下反应应并出并出现现沉淀物的沉淀物的现现象。象。用于沉淀反用于沉淀反应应中的抗原称沉淀原中的抗原称沉淀原(precipitonogen)(precipitonogen)。用于沉淀反用于沉淀反应应中的抗体称沉淀素（中的抗体称沉淀素（precipitin) precipitin) 。 3、补补体体结结合合试验试验(Complement fixation test ,CFT) 有有补补体参与，并以体参与，并以绵绵羊血羊血红细红细胞和溶血胞和溶血素（素（红细红细胞的特异抗体）作指胞的特异抗体）作指标标系系统统的灵的灵敏度很高的抗原抗体反敏度很高的抗原抗体反应应。