米曲霉的培养及蛋白质的分析

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1、米曲霉的培养及蛋白质的分析米曲霉的培养及蛋白质的分析 一、实验目的一、实验目的n通过固态三角瓶培养曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法二、实验原理、过程和方法二、实验原理、过程和方法 1、实验原理、实验原理2、实验过程、实验过程3、实验方法、实验方法1、实验原理、实验原理n固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。n固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。n固态制曲设备：实验室主要采

2、用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。n固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染菌问题未得到根本解决。n本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征： 米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，

3、反面无色。2、实验过程、实验过程n米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。 3、实验方法、实验方法米曲霉的培养米曲霉的培养n本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。n试管斜面培养基： 豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH

4、。n或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。米曲霉的培养基1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；米曲霉的培养基2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；n装料厚度：1cm左右；n灭菌：120，30-60min； 三角瓶培养基制备：三角瓶培养基制备：接种及米曲霉的培养条件：n米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。n固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30，培养20小时后，菌丝

5、应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为48-70小时。三、实验仪器、设备和材料实验仪器、设备和材料 n恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。n米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）四、实验分析项目和方法四、实验分析项目和方法 1、 米曲霉培养效果测定：n米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上； 2、干物质失重的测定干重失重发酵前干重发酵后干重干重失重发酵前干重发酵后干重3、米曲霉蛋白酶活力的测定3.1 3.1 原理原理（1 1）、福林试剂在）、福林

6、试剂在碱性碱性情况下极不稳定，可被情况下极不稳定，可被酚类酚类化合物还化合物还原而呈蓝色反应。原而呈蓝色反应。（2 2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。（3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三三氯醋酸氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取物分开，经过滤后取滤液滤液。用。用碳酸钠碱化碳酸钠碱化，再加入，再加入福林试剂福林试剂使之发色，用分光光度计测定。

7、使之发色，用分光光度计测定。（4 4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 3.2 3.2 试剂试剂（1 1）福林试剂）福林试剂 于于20002000mlml磨口回流装置内加入磨口回流装置内加入钨酸钠钨酸钠( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g，钼酸钠钼酸钠( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水70070

8、0mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，浓盐浓盐酸酸10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加入加入硫酸锂硫酸锂( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水5050m1m1，混匀取去冷凝器，加入几滴混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴液体溴，再煮沸，再煮沸l5minl5min，以以驱逐残溴及除去颜色，溶液应驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色呈黄色而非绿色。若溶液仍有。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至10001000mlml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加过滤，置于

9、棕色瓶中保存。此溶液使用时加2 2倍蒸馏倍蒸馏水稀释水稀释，即成稀释的福林试剂。，即成稀释的福林试剂。 （2 2）0.4mol/L0.4mol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 称取三氯醋酸称取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。（3 3）0.4mol/L0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。（4 4）0.05mol/L0.05mol/L pH2.5 pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液 A A液：液：称取

10、称取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸馏水定容至乳酸加蒸馏水定容至10001000mlml。 B B液：液：称取称取1616克克70%70%乳酸钠加蒸馏水定容至乳酸钠加蒸馏水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml与与B B液液1 1mlml稀稀释释1 1倍倍即即成成0.050.05mol/L mol/L pH2.5 pH2.5 乳乳酸酸- -乳酸钠缓冲液。乳酸钠缓冲液。（5 5）2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 称称取取干干酪酪素素2 2g g加加入入0.10.1mol/Lmol/L氢氢氧氧化化钠钠2020mlml在在水水浴浴中中加加热热使使溶溶解解(

11、(必必要要时时用用小小火火加加热热煮煮沸沸) )，然然后后用用pH2.5pH2.5乳乳酸酸- -乳乳酸钠缓冲液定容至酸钠缓冲液定容至10001000mlml即成。即成。 配配制制后后应应及及时时使使用用或或放放入入冰冰箱箱内内保保存存。否否则则极极易易繁繁殖殖细菌，引起变质。细菌，引起变质。 配配制制酪酪蛋蛋白白溶溶液液定定容容时时，若若泡泡沫沫过过多多，则则可可加加1212滴滴酒酒精精消消泡泡。33503350酸酸性性蛋蛋白白酶酶酪酪蛋蛋白白溶溶液液的的配配制制，应应加加弄弄乳乳酸酸2323滴湿润。滴湿润。（6 6）100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精确称取在精确称取在l05

12、烘箱中烘至恒重的酪氨酸烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步逐步加入加入0.1mol/L盐酸盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为其浓度为1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸馏水定容至以蒸馏水定容至100ml即配成即配成100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。殖细菌而变质。 3 3.3 .3 操作步骤操作步骤3.3.1 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 （1 1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(2)(2)

13、测定步骤测定步骤 另另取取6 6支支试试管管按按上上表表编编号号分分别别吸吸取取不不同同浓浓度度的的酪酪氨氨酸酸1 1mlml，各各加加入入0.40.4mo1/Lmo1/L碳碳酸酸钠钠5 5m1m1，再再加加入入已已稀稀释释的的福福林试剂林试剂1 1m1m1。 摇摇匀匀置置于于水水浴浴锅锅中中，4040保保温温发发色色2020minmin，在在波波长长660660nmnm处测定吸光度。一般测处测定吸光度。一般测3 3次，取平均值次，取平均值 以以吸吸光光度度为为纵纵座座标标，酪酪氨氨酸酸的的浓浓度度为为横横座座标标，绘绘制制成标准曲线。成标准曲线。 准准确确称称取取蛋蛋白白酶酶固固态态发发酵酵

14、的的湿湿曲曲2 2g g，用用10102020mlml蒸蒸馏馏水水，3030浸浸提提半半小小时时，用用滤滤纸纸过过滤滤。将将滤滤液液稀稀释释一一定定倍数倍数( (使其测定光密度在使其测定光密度在0.20.20.40.4范围内为宜范围内为宜) )。3.3.2 3.3.2 酶液的制备酶液的制备 取取四四支支试试管管，分分别别加加入入1 1mlml稀稀释释酶酶液液，其其中中一一支支为为空空白白管，三支为平行试验管管，三支为平行试验管，置入置入4040水浴中预热水浴中预热3 35 5minmin。 在在三三支支平平行行试试验验管管中中分分别别加加入入1 1ml ml 2% 2% 酪酪蛋蛋白白溶溶液液，

15、准准确确计计时时保保温温1010minmin。立立即即加加入入2 2ml ml 0.4M0.4M三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液，l5minl5min后后用用滤滤纸纸过过滤滤。分分别别吸吸取取1 1mlml清清液液，加加5 5ml ml 0.4M0.4M碳碳酸酸钠钠溶溶液液，最最后后加加入入1 1mlml福福林林- -酚酚试试剂剂，摇摇匀匀，于于4040水水浴浴中中显色显色2020minmin。 空空白白管管中中先先加加入入2 2ml ml 0.4M0.4M三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液，再再加加l l m ml l 2%2%酪酪蛋蛋白白溶溶液液，1515minmin后后用用滤滤纸纸过过滤滤。以以下下操操作

16、作与与平平行行试试验验管管相同。相同。 以以空白管为对照，在空白管为对照，在680纳米纳米波长下测波长下测光密度光密度，取其平，取其平均值。均值。 3.3.3 3.3.3 测定测定 蛋蛋白白酶酶活活力力单单位位定定义义：在在4040，pH2.5pH2.5下下，每每分分钟钟水水解解酪蛋白释放酪蛋白释放1 1微克酪氨酸的酶量定义为微克酪氨酸的酶量定义为1 1个蛋白酶单位。个蛋白酶单位。 式中式中： K K：标准曲线中标准曲线中O OD D值为值为1 1所相当的酪氨酸的微克数；所相当的酪氨酸的微克数； OD OD：平行试验管的平均光密度；平行试验管的平均光密度； 4 4：试管中反应液总体积：试管中反

17、应液总体积( (毫升毫升) )； 10 10：反应：反应1010分钟；分钟； N N：稀释倍数；稀释倍数；W W：曲的称取量曲的称取量( (克克) )3.3.4 3.3.4 计算计算 （1 1）对对于于同同一一台台分分光光光光度度计计与与同同一一批批福福林林- -酚酚试试剂剂，其其工工作作曲曲线线K K值值可可以以沿沿用用，当当另另配配福福林林- -酚酚试试剂剂时时，工工作作曲曲线应重作。线应重作。 （2 2）当当用用不不同同产产品品的的酪酪蛋蛋白白对对同同一一蛋蛋白白酶酶测测定定时时，其其结结果果会会有有差差异异，故故蛋蛋白白酶酶活活力力表表示示时时应应注注明明所所用用酪酪蛋蛋白白的生产厂。的生产厂。3.3.5 3.3.5 说明说明五、实验报告内容和数据处理五、实验报告内容和数据处理两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。