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1、20072007级五年制本科生级五年制本科生免疫学实验课免疫学实验课杨 巍单单个核个核细细胞分离胞分离第四次实验课第四次实验课人外周血单个核细胞分离人外周血单个核细胞分离单单个核个核细细胞分离胞分离实验内容l l人外周血单个核细胞的分离（实验）人外周血单个核细胞的分离（实验）l l淋巴细胞分离与检测技术（讲解）淋巴细胞分离与检测技术（讲解）单单个核个核细细胞分离胞分离实验目的l l掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法l l熟悉淋巴细胞的检测技术熟悉淋巴细胞的检测技术单单个核个核细细胞分离胞分离细胞分离纯化的目的l l 测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或
2、测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取组织中获取组织中获取组织中获取有活性有活性有活性有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细的细胞，如淋巴细胞、巨噬细的细胞，如淋巴细胞、巨噬细的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。胞、粒细胞等。胞、粒细胞等。胞、粒细胞等。l l 根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑虑虑虑(1)(1)(1)(1)细胞细胞细胞细胞纯度纯度纯度纯度；(2)(2)(2)(2
3、)细胞细胞细胞细胞获得量获得量获得量获得量；(3)(3)(3)(3)细胞细胞细胞细胞活力活力活力活力；单单个核个核细细胞分离胞分离Ficoll密度梯度离心法l l常用来分离人外周血单个核细胞（常用来分离人外周血单个核细胞（常用来分离人外周血单个核细胞（常用来分离人外周血单个核细胞（PBMCPBMCPBMCPBMC）的分层液比重是）的分层液比重是）的分层液比重是）的分层液比重是 1.0771.0771.0771.077左右的左右的左右的左右的 聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖(Ficoll)-(Ficoll)-(Ficoll)-(Ficoll)-泛影葡胺泛影葡胺泛影葡胺泛影葡胺(Urografin(Ur
4、ografin(Urografin(Urografin）分）分）分）分层液。层液。层液。层液。l l红细胞、粒细胞比重大红细胞、粒细胞比重大红细胞、粒细胞比重大红细胞、粒细胞比重大( ( ( (1.0921.0921.0921.092) ) ) )，离心后沉于管底；淋巴，离心后沉于管底；淋巴，离心后沉于管底；淋巴，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重( ( ( (1.0701.0701.0701.070) ) ) )，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分
5、层液液面的细胞，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。就可从外周血中分离到单个核细胞。就可从外周血中分离到单个核细胞。就可从外周血中分离到单个核细胞。单单个核个核细细胞分离胞分离 比重：比重：1.0701.070比重：比重：1.0771.077 比重：比重：1.0921.092 FicollFicoll密度梯度离心法单单个核个核细细胞分离胞分离实验材料分分分分组组：两人一：两人一：两人一：两人一组组器材器材器材器材数量数量数量数量试剂试剂试剂试剂数量数
6、量数量数量滴管滴管滴管滴管2 2 2 2支支支支/2/2/2/2人人人人分层液分层液分层液分层液0.5ml /20.5ml /20.5ml /20.5ml /2人人人人EPEPEPEP管管管管1 1 1 1个个个个/2/2/2/2人人人人血液血液血液血液1ml /21ml /21ml /21ml /2人人人人计数板计数板计数板计数板1 1 1 1块块块块/2/2/2/2人人人人PBSPBSPBSPBS1 1 1 1瓶瓶瓶瓶/4/4/4/4人人人人1ml1ml1ml1ml刻度吸管刻度吸管刻度吸管刻度吸管1 1 1 1支支支支/4/4/4/4人人人人计数液计数液计数液计数液1 1 1 1管管管管/
7、4/4/4/4人人人人加样器加样器加样器加样器(tip)(tip)(tip)(tip)1 1 1 1把把把把/4/4/4/4人人人人显微镜显微镜显微镜显微镜1 1 1 1台台台台/2/2/2/2人人人人单单个核个核细细胞分离胞分离实验步骤1. 1. 1. 1. 加样：加样：加样：加样：吸取吸取吸取吸取1ml1ml1ml1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部( ( ( (距距距距1cm1cm1cm1cm处处处处) ) ) ) NOTENOTENOTENOTE：不要打破血液与分层液的界面
8、；不要打破血液与分层液的界面；不要打破血液与分层液的界面；不要打破血液与分层液的界面；2. 2. 2. 2. 分离：分离：分离：分离：2,000r/min2,000r/min2,000r/min2,000r/min离心离心离心离心17min17min17min17min，离心后管内液体可分为四层，离心后管内液体可分为四层，离心后管内液体可分为四层，离心后管内液体可分为四层; ; ; ;3. 3. 3. 3. 回收：回收：回收：回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，将
9、吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入放入放入放入EPEPEPEP管中管中管中管中( ( ( (NOTENOTENOTENOTE：尽量少吸分层液：尽量少吸分层液：尽量少吸分层液：尽量少吸分层液););););加入加入加入加入PBSPBSPBSPBS至至至至1ml1ml1ml1ml，洗涤，洗涤，洗涤，洗涤1 1 1 1次，次，次，次，4,000rpm/min4,000rpm/min4,000rpm/min4,000rpm/min，离心，离心，离心，离心5 5 5 5分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；分钟，弃上清；4. 4. 4. 4. 计数：计数：计数：计数：用用用用5
10、00ul PBS500ul PBS500ul PBS500ul PBS重悬细胞，取重悬细胞，取重悬细胞，取重悬细胞，取10ul10ul10ul10ul加到计数板内，计数。加到计数板内，计数。加到计数板内，计数。加到计数板内，计数。 （NOTENOTENOTENOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）5. 5. 5. 5. 调细胞浓度：调细胞浓度：调细胞浓度：调细胞浓度：细胞终浓度为：细胞终浓度为：细胞终浓度为：细胞终浓度为：110
11、1101101106 6 6 6/ml /ml /ml /ml 。（NOTENOTENOTENOTE：一般每：一般每：一般每：一般每mlmlmlml健康成人血可分离健康成人血可分离健康成人血可分离健康成人血可分离12101210121012106 6 6 6个单个核细胞，其中个单个核细胞，其中个单个核细胞，其中个单个核细胞，其中90%90%90%90%以以以以上为淋巴细胞，部分是单核细胞）上为淋巴细胞，部分是单核细胞）上为淋巴细胞，部分是单核细胞）上为淋巴细胞，部分是单核细胞）单单个核个核细细胞分离胞分离示意图单单个核个核细细胞分离胞分离细胞计数方法l l查出四个大方格的总细胞数查出四个大方格
12、的总细胞数查出四个大方格的总细胞数查出四个大方格的总细胞数( ( ( (X)X)X)X)l l算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数：Y=X/4Y=X/4Y=X/4Y=X/4l l每个大方格的体积为每个大方格的体积为每个大方格的体积为每个大方格的体积为V=1mm1mm0.1mm=0.1mmV=1mm1mm0.1mm=0.1mmV=1mm1mm0.1mm=0.1mmV=1mm1mm0.1mm=0.1mm3 3 3 3=10=10=10=10-4-4-4-4mlmlmlmll l制备的细胞悬液的细胞浓度（制备的细胞悬液的细胞浓度（制备的细胞悬
13、液的细胞浓度（制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y 10/ml)=Y 10/ml)=Y 10/ml)=Y 104 4 4 4稀释倍数稀释倍数稀释倍数稀释倍数(50)(50)(50)(50)4单单个核个核细细胞分离胞分离淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞分离及检测技术单个核细胞分离单个核细胞分离巨噬细胞巨噬细胞淋巴细胞淋巴细胞DCDCDC细胞细胞细胞细胞细胞细胞单个核细胞分离免疫细胞的分离免疫细胞的分离 免疫细胞的分离原理及方法免疫细胞的分离原理及方法 单个核细胞分离免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞的总称。的所有细胞的总称。直接参与免疫
14、应答的细胞主要为：直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、细胞、B细胞、巨噬细胞细胞、巨噬细胞单个核细胞分离一一. . 外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（PMBCPMBC）分离）分离二二.淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群的的分分离离及及鉴鉴定定（表表面面标标志志选选择性纯化淋巴细胞亚群）择性纯化淋巴细胞亚群）vE E花环分离法花环分离法v 尼龙纤维分离法尼龙纤维分离法v 免疫荧光法免疫荧光法v 流式细胞术流式细胞术( (flow flow cytometrycytometry, FCM), FCM)v 磁珠分离术磁珠分离术免疫细胞的分离免疫细胞的分离 单个核细胞分离1.1.细胞膜脆性：低渗液分离细胞膜
15、脆性：低渗液分离2.2.细胞密度：密度梯度离心法细胞密度：密度梯度离心法3. 3. 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术4. 4. 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛免疫细胞分离的依据免疫细胞分离的依据 单个核细胞分离（一）外周血单个核细胞（一）外周血单个核细胞（PBMCPBMC）的分离）的分离血中的细胞血中的细胞单个核单个核PBMC无核无核红细胞红细胞多核多核多核白细胞多核白细胞单个核细胞分离PBMC的比重的比重1.075 红细胞红细胞多核白细胞多核白细胞平均比重平均比重1.092Ficoll淋巴细胞分层液淋巴细胞分层液比
16、重比重1.077密度梯度离心法分离原理密度梯度离心法分离原理密度梯度离心法分离原理密度梯度离心法分离原理单个核细胞分离离心前示意图离心前示意图稀释的抗凝血稀释的抗凝血Ficoll分离液分离液单个核细胞分离血浆血浆PBMC（白膜状）（白膜状）1.075Ficoll分离液分离液1.077红细胞、多核白细胞红细胞、多核白细胞1.092离心后示意图离心后示意图单个核细胞分离（二）（二）T T、B B 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离1、单核细胞的去除：、单核细胞的去除：（1）黏附去除法）黏附去除法*原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。（2
17、）L亮氨酸甲酯去除法亮氨酸甲酯去除法（3）羰基铁吞噬离心法）羰基铁吞噬离心法单个核细胞分离2、T、B淋巴细胞的分离纯化淋巴细胞的分离纯化（1）尼龙毛柱法）尼龙毛柱法*原理：原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏附细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏附性的性的T细胞。细胞。（2）E花环分离法花环分离法*原理：人成熟原理：人成熟T细胞表面的细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受分子为绵羊红细胞受体（体（E受体），可结合绵羊红细胞形成受体），可结合绵羊红细胞形成E花环，比重花环，比重增大，沉于管底。增大，沉于管底。（3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分
18、离法单个核细胞分离E花环分离法 人成熟人成熟T T细胞表面的细胞表面的CD2CD2分子是绵羊红细胞受体（分子是绵羊红细胞受体（E E受受体），能结合绵羊红细胞形成体），能结合绵羊红细胞形成E E花环，经淋巴细胞分离液花环，经淋巴细胞分离液分离后，因分离后，因E E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低渗法裂解渗法裂解T T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T T细胞。细胞。单个核细胞分离（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或塑
19、料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞，细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞，即为巨噬细胞。即为巨噬细胞。单个核细胞分离免疫细胞的功能检测免疫细胞的功能检测 功能检测的原理及方法功能检测的原理及方法 单个核细胞分离免疫免疫细胞功能胞功能检测的意的意义 免疫系统或其他系统的疾病，免疫接免疫系统或其他系统的疾病，免疫接种，某些临床措施或外界环境的影响，均种，某些临床措施或外界环境的影响，均可使免疫细胞的数量和功能发生变化。可使免疫细胞的数量和功能发生变
20、化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对因此，免疫细胞数量，功能检测，对于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、预防接种的效果评估及环境因素对机体免预防接种的效果评估及环境因素对机体免疫功能影响的判定，都具有重要意义。疫功能影响的判定，都具有重要意义。单个核细胞分离一、一、免疫细胞的数量检测免疫细胞的数量检测二、免疫细胞的功能检测二、免疫细胞的功能检测淋巴细胞增殖检测淋巴细胞增殖检测淋巴细胞亚群检测淋巴细胞亚群检测免疫细胞自发增殖活性测定免疫细胞自发增殖活性测定免疫细胞增殖检测免疫细胞增殖检测免疫细胞检测的分类免疫细胞检测的分类单个核细胞分离一一.免疫细胞的数
21、量检测免疫细胞的数量检测检查的项目有：检查的项目有：血中血中T细胞与细胞与B细胞的分类计数细胞的分类计数血液白细胞的计数血液白细胞的计数血液中白细胞的分类计数血液中白细胞的分类计数实验方法实验方法E玫瑰花环实验玫瑰花环实验(检测检测T细胞细胞)B细胞膜免疫球蛋白检测细胞膜免疫球蛋白检测单个核细胞分离E玫瑰花环实验玫瑰花环实验原理原理:绵羊红细胞绵羊红细胞T细胞细胞形如花环，比重变大，离心形如花环，比重变大，离心沉淀沉淀B细胞膜免疫球蛋白检测细胞膜免疫球蛋白检测原理：荧光素原理：荧光素抗抗Ig特异性抗体特异性抗体B细胞表面膜细胞表面膜免疫球蛋白免疫球蛋白(mIg)返回单个核细胞分离二二.免疫细胞
22、的功能检测免疫细胞的功能检测刺激物刺激物非特异性非特异性:有丝分裂原有丝分裂原PHA、ConA微生物及其代谢产物微生物及其代谢产物葡萄球菌葡萄球菌蛋白物质蛋白物质胃蛋白酶胃蛋白酶抗体抗体抗抗CD3、CD4抗体抗体淋巴因子淋巴因子特异性：特异性抗原物质特异性：特异性抗原物质淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。单个核细胞分离淋巴细胞转化试验的检测方法淋巴细胞转化试验的检测方法(一一)形态学方法形态学方法淋巴细胞淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞染色镜检染色镜检(二二)3HTdR掺入法掺入法有丝裂原或抗原有丝裂原或抗原淋巴细胞淋巴细胞染色体复制染色体
23、复制3HTdR掺入掺入淋巴细胞摄取淋巴细胞摄取测定放射量测定放射量(三三)MTT比色法比色法返回单个核细胞分离(一一)免疫荧光法免疫荧光法(二二)免疫酶标法免疫酶标法(三三)荧光激活细胞分类仪检测荧光激活细胞分类仪检测T细胞亚群细胞亚群（T细胞和细胞和B细胞检测方法相同细胞检测方法相同,现以现以T细胞为例进行讲解细胞为例进行讲解.）淋巴细胞亚群检测的方法淋巴细胞亚群检测的方法单个核细胞分离(一一)免疫荧光法免疫荧光法直接法直接法:荧光素荧光素单克窿抗体单克窿抗体淋巴细胞淋巴细胞间接法间接法:荧光素荧光素第二抗体第二抗体(羊或兔的抗鼠羊或兔的抗鼠IgG)McAb介导介导淋巴细胞淋巴细胞单个核细胞
24、分离(二二)免疫酶标法免疫酶标法ABC法法:亲和素酶标生物素亲和素酶标生物素复合物复合物生物素化的二抗生物素化的二抗McAb介介导和酶催化底物作用导和酶催化底物作用T细胞着色细胞着色APAAP复合物复合物兔抗鼠兔抗鼠IgGMcAbAPAAP法法:T细胞细胞单个核细胞分离(三三)荧光激活细胞分类仪荧光激活细胞分类仪(FACS)检测检测T细细胞亚群胞亚群FACS是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器,其操作程其操作程序在无菌条件下进行序在无菌条件下进行,不影响细胞活性不影响细胞活性,所以分离、收集的细胞可所以分离、收集的细胞可继续其他细胞功能的研究。继续其他细胞功能的研究。单个核细胞分离单个核细胞分离
