CD147CD147在胃癌细胞在胃癌细胞SGC7901SGC7901增殖增殖 报告内容l 研究背景l 研究目标l 实验方法与结果l 实验结论 一、 研究背景 胃癌概况 胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位 其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而死死亡率较高亡率较高 MMP简介 肿瘤的侵袭和转移侵袭和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤这与细胞外基质金属细胞外基质金属蛋白酶蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的参与密不可分 MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种MMP的主要功能是降降解解细细胞胞外外基基质质肿瘤细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达 20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上分离得到了一种58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿肿瘤瘤胶胶原原酶酶刺刺激激因因子子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。
进一步研究表明TCSF不仅能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细细胞胞外外基基质质金金属属酶酶诱诱导导因因子子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN) 第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将EMMPRIN命名为CD147 CD147的结构 CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成2个典型的半球形Ig结构域 细 胞 内 的 CD147存 在 低低 糖糖 基基 化化 （ low glycosylated CD147， LG）和高高糖糖基基化化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分别是32~44kDa、45~65kDa只有HG形式能刺激MMP的产生 CD147的功能 CD147是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移肿瘤的侵袭和转移、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能多功能的分子。
免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等并且肿肿瘤瘤的的恶恶性性程程度度越越高高，，CD147的的表表达达水水平平也越高 CD147在肿瘤发生发展中的作用 1. 促进肿瘤的侵袭和转移促进肿瘤的侵袭和转移 CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的 2. 诱导肿瘤血管生成诱导肿瘤血管生成 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程 CD147可以诱导可以诱导VEGF的表达的表达 3. 促进肿瘤细胞多药耐药促进肿瘤细胞多药耐药 在多种多多药药耐耐药药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达CD147可激活PI3K/AKT细胞存活信号通路在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活 胃癌中CD147的表达 日本Toyama大学的Zheng HC等研究表明：在正正常常胃胃黏黏膜膜发展为增增生生性性或或化化生生性性胃胃黏黏膜膜，最后发展为胃胃癌癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。
胃癌组织中CD147的表达CD147在胃癌在胃癌组织中高表达中高表达 二. 研究目标 本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用 三、研究方法及结果 CD147shRNA真核表达载体的构建与鉴定↓转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株↓MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化↓明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌的变化↓SGC7901细胞体外侵袭力测定↓MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化技技术路路线技技 术 路路 线 胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤研究表明其侵袭能力强，恶性程度高我们前期研究表明，该细胞表面CD147是高表达的是高表达的 shRNA（short hairpin RNA）表达载体的构建pSilencer3.1-H1 neo shRNA模板的设计示意图 干扰靶序列的选择 参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA 370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。
另外，设计一个阴性对照shRNA-control RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置• 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC • 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG •101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA •151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG •201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA •251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC•301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC•351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAACA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA •401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG •451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC •501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA •551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC•601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG •651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG •701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC •751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA•801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG •851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG•901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC •951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT 设计好的shRNA插入序列shRNA15'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3'shRNA2 5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’ 5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’shRNA-control5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3' 5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’ 2、CD147 shRNA表达载体的构建： 将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用，与经BamH I和Hind III双酶切的pSilencer3.1-neo质粒连接，构建成CD147 shRNA表达载体，重组质粒分别命名为pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。
重组质粒测序鉴定结果DNA测序表明，测序表明，3个重组质粒构建个重组质粒构建正确pSilencer/shRNA1测序图（红线为插入片段） 转染及筛选 脂质体转染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培养基筛选2周，然后改为半量维持将抗G418的阳性细胞克隆用有限稀释法分离出来并逐步扩增以待进一步分析筛选出的细胞克隆分别命名为SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control Real-time PCR检测CD147 mRNA表达水平 与SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2细胞中CD147 mRNA相对表达量分别下降至72.4%和和17.3% 1 2 3 4HGLGCD147β-actinLane 1: SGC7901.Lane 2: SGC7901/shRNA-controlLane 3: SGC7901/shRNA1Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。
Western blot结果与结果与Real-time PCR结果相符结果相符 接种接种细胞胞 培养培养细胞胞 加入加入MTT呈色呈色 终止培养止培养 比色比色 结果果计算算 抑制率抑制率(%)=(对照照组A 值-实验组A 值)／／对照照组A 值×100% 24h、、48h、、72h 时间点点MTT细胞增殖实验 与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细细胞胞增增殖殖能能力力均均显显著著降降低低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变 明胶酶谱法检测细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明胶酶包括72 kDa的明胶酶A（基质金属蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明胶酶B (基质金属蛋白酶-9，MMP-9)其作用底物为基底膜中的Ⅳ型胶原和变性的间质胶原（明变性的间质胶原（明胶），胶），其活性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关 明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。
明胶酶谱结果MMP-2MMP-9 1 2 3Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control.Lane 3:SGC7901/shRNA2**BSGC7901/shRNA2细胞上清液中胞上清液中MMP-2和和MMP-9的活性明的活性明显降低降低 Transwell原理 Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构 Transwell结果穿过穿过Transfer侵袭小室的染成紫色的细侵袭小室的染成紫色的细胞（胞（×400））SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2 SGC7901/shRNA2细胞细胞 体外侵袭能力显体外侵袭能力显著降低著降低B* 顺铂敏感性实验 抗肿瘤药物顺铂的使用浓度以血浆峰浓度（ Peak Plasma Concentration，PPC) 为标准参照Sondak等的报道，顺铂的PPC为3.0 μg/ml。
本实验中使用的顺铂浓度为：0.01PPC，0.1PPC，10PPC细胞生长抑制率（%）=[1-OD(cisplatin＋）/OD(cisplatin－)] ×100% 与与 SGC7901和和 SGC7901/shRNA-control相相 比比 ，， 顺顺 铂铂 对对SGC7901/shRNA2的抑制率显著增加的抑制率显著增加*** 四、实验结论 l成功构建了靶向CD147的shRNA真核表达载体；l成功转染了人胃癌细胞SGC7901，并获得了稳转细胞株，经Real-time PCR、Western Blot检测，CD147在mRNA和蛋白水平均被显著抑制；lCD147表达沉默后SGC7901的增殖能力明显降低，细胞的MMP-2和MMP-9的活性明显降低，细胞的体外侵袭能力明显降低，细胞对化疗药物顺铂的敏感性增强 我们的研究表明：我们的研究表明：CD147在胃癌细胞在胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；CD147可可能是胃癌治疗的一个有效的靶点能是胃癌治疗的一个有效的靶点。
下一步的研究方向1.动物水平的实验（裸鼠移植瘤模型，体内肿瘤细胞侵袭实验）；2.CD147自身的表达调控；3.CD147在其他消化系统肿瘤中的作用；4.CD147多药耐药的机制 Thanks for your attention! 结束结束 。