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1、细胞周期及其调控徐朝阳徐朝阳细胞生物学教研室细胞生物学教研室前言细胞周期及其调控的重要性细胞周期及其调控的重要性细胞周期及其调控的复杂性细胞周期及其调控的复杂性细胞周期细胞周期调控细胞周期与医学经过三部分的学习了解细胞周期细胞周期根本概念1.细胞周期同步化1.1代谢抑制法原理：选用原理：选用DNADNA合成的抑制剂，可逆地抑制合成的抑制剂，可逆地抑制DNADNA合合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在胞群阻断在S S期或期或G/SG/S交界处。交界处。优点：同步化程度高，适用于任何培育体系。可优点：同步化程度高，适用于任何培育体系。可将
2、几乎一切的细胞同步化。将几乎一切的细胞同步化。缺陷：容易产生非平衡生长，个别细胞体积增大。缺陷：容易产生非平衡生长，个别细胞体积增大。 1.2细胞分裂收获法方法：使单层培育的细胞处于对数增殖期，此时方法：使单层培育的细胞处于对数增殖期，此时分裂活泼，有丝分裂细胞变圆隆起，与培育皿的分裂活泼，有丝分裂细胞变圆隆起，与培育皿的附着性低，此时悄然振荡，附着性低，此时悄然振荡，M M期细胞脱离器壁，悬期细胞脱离器壁，悬浮于培育液中，搜集培育液，再参与新颖培育液，浮于培育液中，搜集培育液，再参与新颖培育液，依法继续搜集，那么可获得一定数量的中期细胞。依法继续搜集，那么可获得一定数量的中期细胞。优点：操作
3、简单，同步化程度高，细胞不受药物优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物损伤。损伤。缺陷：获得的细胞数量较少。分裂细胞约占缺陷：获得的细胞数量较少。分裂细胞约占1%1%2%2% 2.1有关名词TG1TG1：G1G1期的继续时间期的继续时间 TG2TG2：G2G2期的继续时间期的继续时间 TSTS： S S期的继续时间期的继续时间 TMTM： M M期的继续时间期的继续时间 TCTC： 一个细胞周期的继续时间一个细胞周期的继续时间 PLMPLM：标志的有丝分裂细胞所占的比例：标志的有丝分裂细胞所占的比例 TDRTDR：胸腺嘧啶核苷：胸腺嘧啶核苷Thymine Deoxyriboside, Th
4、ymine Deoxyriboside, TDR TDR ，是，是DNADNA的特异前体，能被的特异前体，能被S S期细胞摄入，期细胞摄入，而掺进而掺进DNADNA中。通常运用的是中。通常运用的是3H3H或者或者14C14C标志的标志的TDRTDR。 2.细胞周期时间的测定细胞周期时间的长短因细胞的类型、形状细胞周期时间的长短因细胞的类型、形状和环境而异。和环境而异。标志有丝分裂百分率法标志有丝分裂百分率法percentage percentage labeled mitoseslabeled mitoses，PLMPLM是一种常用的测是一种常用的测定细胞周期时间的方法。定细胞周期时间的方法。
5、其原理是对测定细胞进展脉冲标志、定时其原理是对测定细胞进展脉冲标志、定时取材、利用放射自显影技术显示标志细胞，取材、利用放射自显影技术显示标志细胞，经过统计标志有丝分裂细胞百分数的方法经过统计标志有丝分裂细胞百分数的方法来测定细胞周期。来测定细胞周期。2.1有关名词TG1TG1：G1G1期的继续时间期的继续时间 TG2TG2：G2G2期的继续时间期的继续时间 TSTS：S S期的继续时间期的继续时间 TMTM：M M期的继续时间期的继续时间 TCTC：一个细胞周期的继续时间：一个细胞周期的继续时间 PLMPLM：标志的有丝分裂细胞所占的比例：标志的有丝分裂细胞所占的比例 TDRTDR：胸腺嘧啶
6、核苷，是：胸腺嘧啶核苷，是DNADNA的特异前体，能被的特异前体，能被S S期期细胞摄入，而掺进细胞摄入，而掺进DNADNA中。通常运用的是中。通常运用的是3H3H或者或者14C14C标志的标志的TDRTDR。2.2PLM法原理待测细胞经待测细胞经3H-TDR3H-TDR标志后，一切标志后，一切S S期细胞均期细胞均被标志。被标志。S S期细胞经期细胞经G2G2期才进入期才进入M M期，所以一段时间期，所以一段时间内内PLM=0PLM=0。开场出现标志开场出现标志M M期细胞时，表示处于期细胞时，表示处于S S期最期最后阶段的细胞，已渡过后阶段的细胞，已渡过G2G2期，所以从期，所以从PLM=
7、0PLM=0到出现到出现PLMPLM的时间间隔为的时间间隔为TG2TG2。S S期期细细胞逐胞逐渐进渐进入入M M期，期，PLMPLM上升，到达最高上升，到达最高点的点的时时候候阐阐明来自明来自处处于于S S最后最后阶阶段的段的细细胞，胞，已完成已完成M M并并进进入入G1G1期。所以从开期。所以从开场场出出现标现标志志的的M M期期细细胞到胞到PLMPLM到达最高点到达最高点 100%100% 的的时间时间间间隔就是隔就是TMTM。当当PLMPLM开开场场下降下降时时，阐阐明明处处于于S S期最初期最初阶阶段段的的细细胞也已胞也已进进入入M M期，所以出期，所以出现现LMLM到到PLMPLM
8、又又开开场场下降的一段下降的一段时间时间等于等于TSTS。 从从LMLM出现到下一次出现到下一次LMLM出现的时间间隔就等出现的时间间隔就等于于TCTC，根据，根据TC=TG1+TS+TG2+TMTC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的即可求出的TG1TG1长度长度现实上由于一个细胞群体中现实上由于一个细胞群体中TCTC和各时相不和各时相不尽一样，第一个峰常达不到尽一样，第一个峰常达不到100%100%，以后的，以后的峰会发生衰减，峰会发生衰减，PLMPLM不一定会下降到零，所不一定会下降到零，所以实践丈量时，常以以实践丈量时，常以TG2+1/2TMTG2+1/2TM-TG2-TG2的的方式
9、求出方式求出TMTM。细胞周期各时相的动态1.G1期动态早早G1G1期：细胞生长期：细胞生长R R点：分裂决议点：分裂决议晚晚G1G1期：复制预备期：复制预备细胞周期时间的长短主要由细胞周期时间的长短主要由G1G1期决议期决议2.S期动态DNADNA合成合成染色质组装染色质组装中心粒复制中心粒复制3.G2期动态复制检查复制检查分裂预备分裂预备G1-G2G1-G2期主要物质的合成期主要物质的合成4.M期动态染色体分别染色体分别胞质分裂胞质分裂细胞周期调控细胞周期驱动力细胞周期驱动力1.引擎：cyclin-CDK系统1.1Cyclin-Cdk的类型1.2Cylin-CDK的激活Cdkactivat
10、ingkinase(CAK)Cdk7Cdk7和和CyclinH CyclinH 一同构成一同构成CAK;CAK;催化催化cdk2cdk2和和cdk4cdk4分子第分子第161161位苏氨酸的磷酸位苏氨酸的磷酸化，从而激活这些蛋白激酶的活性。化，从而激活这些蛋白激酶的活性。1.3Cdk/Cyc在细胞周期中的调控作用A.G1期B.S期和G2期C.M期Cdc25近来的研讨资料阐明,3种Cdc25 亚型在G1/ S、G2/ M 转变和M 期中都有作用。3 种亚型能协同启动细胞进入S 期和调控G2/ M 的转变。Cdc25A 对于有效地促进细胞进入S 期是必需的, Cdc25A 表达量的添加可促进G1/
11、 S和G2/ M 检验点之间的转变。Cdc25B和Cdc25C 在控制进入M 期和G2/ M 检验点具有重要的作用。然而,Cdc25B 在G2/ M 检验点早期阶段似乎具有更突出的作用,而Cdc25C控制G2/ M 检验点的后期阶段。Cdc25的作用机制Cdk 激酶活性经过Thr-14 和Tyr-15 (在Cdk1中) 的磷酸化作用而被负调控。Cdk1 的抑制性激酶在高等真核细胞中是wee1 和myt1 蛋白激酶。 这些激酶经过Cdc25 磷酸酶的催化作用而发生去磷酸化,导致Cdk1/ cyclin B 发生活化作用。2.原动力：周期性基因表达3.清道夫：泛素化蛋白质降解系统泛素介导的细胞周期
12、调控蛋白的降解泛素介导的细胞周期调控蛋白的降解泛素被称为蛋白质降解泛素被称为蛋白质降解标签，结合了泛素的蛋标签，结合了泛素的蛋白质能被白质能被26S26S蛋白酶体识蛋白酶体识别并分解成短肽；别并分解成短肽；这是短命蛋白质和一些这是短命蛋白质和一些异常蛋白质降解的普遍异常蛋白质降解的普遍途径。途径。a.蛋白质的泛素化修饰过程泛素先被合成为一种没有泛素先被合成为一种没有活性的前体，之后在活性的前体，之后在C C端端水解酶的作用下暴露双水解酶的作用下暴露双GlyGly位点而进展成熟化。位点而进展成熟化。以后泛素依次被泛素激活以后泛素依次被泛素激活酶酶E1E1活化，转移至结合酶活化，转移至结合酶E2E
13、2的半胱氨酸残基上，被的半胱氨酸残基上，被衔接酶衔接酶E3E3衔接到靶蛋白外衔接到靶蛋白外表的赖氨酸残基上。表的赖氨酸残基上。 b.蛋白质的泛素化修饰作用4.外动力：生长因子信号系统生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种，物质，目前发现的生长因子多达几十种，多数有促进细胞增殖的功能。多数有促进细胞增殖的功能。生长因子不由特定腺体产生，主要经过旁生长因子不由特定腺体产生，主要经过旁分泌作用于临近细胞。分泌作用于临近细胞。细胞在生长因子的刺激下，细胞在生长因子的刺激下，G1G1期期cyclin Dcyclin D表达表达 。 表皮
14、生表皮生长因子因子 转化生化生长因子因子/ / 骨构成蛋白骨构成蛋白 神神经生生长因子因子 成成纤维细胞生胞生长因子因子 粒粒细胞集落刺激因子胞集落刺激因子 粒粒细胞胞- -巨噬巨噬细胞集落刺激因子胞集落刺激因子 血小板衍生生血小板衍生生长因子因子 红细胞生成素胞生成素 血小板生成素血小板生成素 肝肝细胞生胞生长子子 . .生长因子的分类细胞周期检控点细胞周期检控点简介检控点是检查和控制细胞周期进程的信号通路。主要是检查和控制细胞周期中的一些关键转换。在细胞周期程序出现问题或者环境条件变化时被激活，经过加强对Cdk的结合抑制和磷酸化来阻滞细胞周期进程，同时启动DNA修复、细胞凋亡等应对机制。1
15、.Cdk抑制因子CKI2.2.细胞周期检控点细胞周期检控点细胞周期检控点的作用主要是调理细胞周期的时序转换，以确保DNA复制、染色体分别等细胞重要生命活动的高度准确性，并对DNA损伤、DNA复制受阻、纺锤体装配和染色体分别异常等细胞损伤及时做出反响，阻滞细胞周期的运转，诱导相关基因表达，使细胞有充分的时间对损伤进展修复，以防止突变和遗传不稳定的发生。如细胞损伤过大而无法修复，检控系统那么启动相应的细胞凋亡机制将损伤细胞加以去除，以确保细胞基因组的完好性和遗传的稳定性。2.1G1/S:DNA损伤检控点DNA损伤ATM/ATR细胞周期检测点激酶1/2 Cdc25激活激活磷酸化出核降解，不能解除细胞
16、核内Cdk2的磷酸化抑制，防止细胞进入S期Mdm2磷酸化不能结合p53，p53留在细胞核内被磷酸化P21表达抑制cdk2/4/6活性，使细胞停滞在G1期非p53依赖途径P53依赖途径DNA损伤检控的两个途径P53: gene regulatory protein. DNA damage activates p53 by an indirect mechanism. Mdm2 acts as a ubiquitin ligase that targets p53 for destruction by proteasomes. Phosphrylated p53 reduce its bindin
17、g to Mdm2.P21(CKI protein) binds to G1/S-Cdk and S-Cdk and inhibits their activities, thereby helping to block entry into S phase.2.2 G2/M: DNA2.2 G2/M: DNA复制检控点复制检控点DNA过失信号ATM/ATR细胞周期检测点激酶1/2 Cdc25激活激活磷酸化出核降解，防止Cdk1磷酸化抑制的解除Waf1/Cip1磷酸化激活Cdk1磷酸化抑制2.32.3中期中期/ /后期：分裂检控点后期：分裂检控点 Anoverviewofthecell-cyc
18、lecontrolsystemG1aG1bG1cG1dSG2MG0PDGFREGFRp53p16, p15p21p27pRBp21p27Cyclin DCDK4,6Cyclin ECDK2Cyclin ECDK2Cyclin ACDK2Cyclin A,BCDK1E2FAppendix:细胞周期调控蛋白细胞周期与医学1.周期蛋白表达异常Cyclin D over-expressed or amplified in a variety of human cancers. Breast 50% Head & Neck 43%* Esophageal 30% Bladder 15% Liver 10
19、% S.C. Lung 10%*over-expression at time of surgery associated with increased risk of recurrence2.周期蛋白降解异常Over-expression of Cyclin A or Cyclin E may result from failure to undergo ubiquitin-mediated degradation.InsertionalMutagenesisofCyclinAinLiverCancerCurr. Opin. Genet. Dev. 3:11, 1993Consequence
20、:Protein is not degradedCyclin A over-expressed3.磷酸酶过表达cdc25A, cdc25B mRNA and protein over-expressed in: Aggressive Lymphomas (40-100%) Head and Neck tumorsNo over-expression in indolent lymphomas.cdc25C levels relatively low in all cancers.Deactivation of CDK activity by phosphorylation of ATP bin
21、ding site or reactivation by phosphatases. Cancer Res. 57:2366, 2019Int. J. Cancer 89: 148, 20004.CAK活性异常Cdk7 moderately elevated in a variety of human tumor cell lines and biopsy specimens. Retinoblastoma Fibrosarcoma Osteosarcoma Cervix Soft Tissue SarcomaInt. J. Cancer 66: 732, 20195.CKI缺失p16 Del
22、etion (9p21)Most common deletion in Glioblastoma (GBM)More common in primary than secondary GBMAssociated with EGFR amplificationNot associated with p53 mutationConfers significantly higher rates of proliferation,and poor prognosisScience 264:436, 1994p27-/-Increased animal size and organ overgrowth(particularly spleen and thymus ) Female infertility, Disorganization of retina Pituitary hyperplasia (adenoma) No defect in response to TGF-Bp27KnockoutMouseLittermates at 12 weeks Thymus GlandsCell 85:710, 2019p27 +/+p27 -/-6.生长因子及其受体突变
