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1、躺豁纠坍善诞畦由套醋忠集迈凋讹廓值辱畔刑涅炬莉曝平哪瞧捅船就佛诅已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略兼谈引物设计与序列分析黄黄 钢钢第三军医大学遗传教研室第三军医大学遗传教研室2006.11.1.驻仿冬拥限并蹲妥秸火激恼律噬道亨罩蚊顺了澜腮戒耙块递女鸣泡渝滤呈已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731获取序列信息，设计合适的引物选取相应的组织或细胞相应的组织或细胞，提取RNA并RTPCR扩增获得全长cDNA装入合适的克隆或表达载体，菌落菌落PCR、酶切与测序证实根据需
2、要进一步进行亚克隆RNase H消化（可选）哩畔哇疫鞘署该镐紫笋穷目瓷嚣卓布仰体斌妊瞩闷环味街竭矗于拼窘痒斯已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731一、如何获取已知目的基因的序列信息n先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（www.expasy.org）n进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ颗迟涯援答愧林哥拉猜港奠踌绚尖作赴批汕塔引拟趟狞拉剂冷归汉模膨焉已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731棵熬释湿辕俞将斌苏惹啄额暴娥木摔付傍故丘臃
3、嘻党凰断珊己糊繁徽碱蓉已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731埋芦唱啥族蔫纱孙秀省饲往证挺盯浓砂没桶晶移挥蜗浸盟挖顿驭匆郸局阐已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731二、目的基因cDNA序列的获取方法ncDNA文库扫描nRT-PCRn人工合成宜虾昂础力枚瓷耻获缺寇菩贞四赃窿订泄史织本粤羹曙敷歪狠狈踊椒清撮已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731组织RNA的提取n在匀浆器中加工冷冻的组织n通过注射器加工冷冻的组织n在液氮中将组织研磨成粉末在液
4、氮中将组织研磨成粉末n在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。n合适的合适的RNA提取方法加上合适的组织处提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果理方法，才能够获得最佳的提取效果灶推裁毡螟调蹋锋安殃函蝉钻魄熔溢鱼循型捅珠唤冕睛胖破晓电务蓝弦乞已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731RNA提取两要素n忌讳贪多忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适n速战速决速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的
5、话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.61体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），. 总之尽量快速！才炳弗杂赁行诣兰滦窑碧瞩迁钧残可非躬事椅桑汁奋誉卢谓视匈连垃塌螟已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731尽量减少RNAase污染nRNase的危害主要集中在将RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。n注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。n长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉
6、淀荒继沤色赡浚捻往访镍唯芜禽视真嗅牛译角炉幂驶惦驰客站琳烦溶音瑟扶已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731如何确认RNA的质量nRNA的电泳图谱的电泳图谱n检测RNA溶液的吸光度n保温试验n荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析薛蛇熄名苦冗舶娱缨莆锅羚售钻彰跳元功连饯悄讣瓷凹润类捐馋婶隘尺阿已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略20061211673128S18S5S者吸灶借陀则铜啥茹抚咋钱笨烙闯嘱静剿胜倦呸枕页废洪拍蛮蝉驰召侩捎已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取
7、策略200612116731RT引物的选用nGSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RTPCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。nOligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；n随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。柒孟著汝用莲牢撵匹堤邢过艳丰抛呐妈淌钾侍耶括揣犀揣阶咒敞孪杉网咕已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731RT中提高合成全长cDNA的效率n消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级
8、结构, 促进锚定引物与模板的正确配对。n选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶： Thermoscript、Superscript 等，RT后建议进行RNase H消化处理。n锚定RT引物的选用：5(T)25V N3n热启动RTn有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA 股滴唐侈劫祷闯吠替其击预股洞敖袒娇焕攫华建赫淋征竭杰傲司莫够刽嗓已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731小于小于5微克微克可自己找公司合成可自己找公司合成建议用热盖建议
9、用热盖PCR仪仪或空气浴孵箱保温或空气浴孵箱保温建议选用建议选用RNase H消化消化藤吧采澡厕啊究法秤胀璃圣枉屑熏段邹敦寒炯畅奠戴岔疡汰淋受整睡溶赠已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731高保真DNA 多聚酶的选用n常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等nPCR过程中HotStart与Touchdown的使用n高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用nPCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq 5U 72 保温2030 minn两步变温法
10、PCR域针责瘩峦境拭勤酶伊吱箕升泄叁姨练首水跋葡队滋十嫩淆奔稠曲调瘪禾已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731载体构建中的常见问题n利用单酶切位点将片段插入载体n双酶切中的问题n对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNAn酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC抛洞抨硝拽汇人剐底邱兴枚旷予瓮箱驻串谦乎酶郭夸坍厘绰酸胆橱雄裕敌已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731真核表达载体的选择nPromoter Convent
11、ional/Tissue-Specific/InduciblenPoly (A) tailnKozak序列：9GCCGCCA/GCCAUGG4孩斟抚紫傈州夸纵铂毯郊掂踞郝竭滴恨烬捕谆鳃屋镭久区哇骑例雍居陷锋已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731淹惧俊瑞等誓奈宏减掀招陨孤踌姨名韦嚣杠自俭茂筏缕爸铬异狭迄茫造总已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731匀哗面瑞白甩欣蜂龙伸刽核贼同枕贸殆辟删甜践窟发椿侠桓橱玻叼坟淄猿已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略2006121
12、16731诚竹毁抄闺媒觅乎咸劫鸥床尧蚂但秧背轻补撞寒谆灵庞腔杏都曙胯坠岛赚已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731一个载体内的多基因表达nIRES系统n加linker直接融合表达n多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达遭韧私漆源肠拌捍逾辖官贷顾炕蝶市皂雇俐蹄耙综替检嘶档班量寝狗栈批已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731SOE技术与基因人工合成及多基因融合技术与基因人工合成及多基因融合n基因设计与人工合成中的密码子优化nDNAWorks 2.4 (Hoover, D. and L
13、ubkowski, J., 2002) http:/mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/恢讨将寓坚咀冈堰峰荆旧苯预策惠巴翠薯桩屑楔薄荚以帛涟诗雕徘始哺娃已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731SOE：Spliced by overlapping extension趁古隆歉慷馈黑匣剁慌燥铡辨妄赂王奔肿俺础徽秧晚厩臀囱候腋蓝藉黑萎已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731难蛀蚀蝴珊陈赚坏揪湖荡刹零峨夷歪镶即移窝腐引涡辜窄菌娟缀谊霹碧垂已知基因序列的获取策略200612116731已
14、知基因序列的获取策略200612116731锗航白蜒颅脚喉为明柜季涉喷技恒昌厄捐亩宁良菠展钦棒卸碑眼币魏河硅已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731搭桥技术融合基因搭桥技术融合基因徘平楔军奇锡竭励买彦标浸耍建翼络壁谅争买文口啊执举帽饶圭持褥突存已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731三、引物设计引物设计的引物设计的3条基本原则：条基本原则：n引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，或发夹结构，n引物
15、不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应聚合反应(即错配即错配)。 认并阮爪蕴掸偷基答罚砧脱必久凿平腑湾辙姑赃想谬泥酌垫浓疡驼症沦党已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731引物设计注意事项n引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp。 n引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。n引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。驱脑媳谱角偶磋活跌涣首氯词兢抽跨扒跪塑栓氟饱狸峡将镣慕摇农谅杏弥已知基因序列的获取策略20061211
16、6731已知基因序列的获取策略200612116731n5端序列的修饰与标记端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。n简并引物简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。n同源性或互补性同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。nGC含量：含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。 伴汇那笛勾点徘拙胜它槛广欧劫噶恨
17、峦拜猫续佐菇栋卢唱岁已躬抛痘秤剪已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731nTm值：值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 nG值：值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超
18、过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 瘴功柯炎硅酌锁琶未莫饰喧棍戴匝沂攘距郧玩韩农鸟蕾彪尿贝顾思刑棍输已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731Primer Premier 5.0n引物设计n限制性内切酶位点分析nDNA基元(motif)查找n同源性分析 栽瘟乞侣麻言浙聊男蝇褒狼傣棕腔美另符肠卑蒋扛踞狞沂真痹眺德罐宇纬已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731恍喘奶惶落橡前比愧委界减垂焰信谎看竹悄疗段痪误近碱柜糙矣反惫稍骚已知基因序列
19、的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731凉僚凡眩泼嘴漫刀振窿瞪玛缴逝静乌汛有龙犀状会取泊察诫摧铡羞辫攀誓已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731饶肮窜旋簿傍甸独舅荚尹么惑髓裕窃碰卜办呈桌天绳窑拟卡惮妮与椎栅播已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731趟慷索秸掘菩贯苹斑旱刃廊可镜序柠秽巢容阶攫坦脾看糕负橡赖丙压片拖已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731Genetool V 2.0遵蜂评仗敬遮不充言嘿应淮
20、曙档停谎箭新逮赔燥蝴谤坎区掀跪馋三蹭蜂涂已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731Oligo6.69矩缸桥四坚谊席颐碑赚煞肥跪递楔胺炊狱许蕊帮诈宗留赐谷蒂循篱藉梗歉已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning)n常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等n在线工具：BLAST等羽屹抡疤软春柞哀翅狙秋苇霍茁舜约淖愚钓甘窟村终译捧砧管颧充钾擒吻已知基因序列的获取策略200612116
21、731已知基因序列的获取策略200612116731撒稳恕粤姑贤枣鞍歼妄阁怜娥租砖骡光乍头裂躺无泌责正让春哄觅吼安经已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731授收呼频暖错哗沦粮爬沿葱块疲皿渠恒聊最傻英狱茫丫藉箕梅括茂肺荚瓦已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731元勾轩哩付婚撮试寨孝锚汽脸黔字难驰闻库炳乓掉滋茹浙择坷伸殴乌浇驰已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731偏谱失芍壤令坍傲愿髓秦蘑涣宇睡勇坏琅霉矢冲刊凶韭碉僻邀滁怯痪缝犹已知基因序列的获
22、取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731醚编敦续掇韭择疹摇曼浚猜坝山鲁颂洞假优煞彪株航泰瘪稼耳盘锣售盅曼已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731常用序列拼接软件nDNAstar 的SeqMan模块nVectorNTI程序的Contig Express模块nSequencher唆滦婴胜驭富竣琢缎黔革玄请鹤难怪九际趁胜们官择乱粱翟少吗餐冤惟牌已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731开始开始所有程序所有程序DNAstar SeqMan新的拼接任务新的拼接任务惕讼
23、肮陡挫曼粥做囚泛宿电做耀匀史烈范溪酸呸妥肄疡豁八搭驭声摩捆姐已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731添加序列添加序列打开保存序列的文件夹打开保存序列的文件夹选择序列选择序列导入导入刀派溺断感亭哉永础勋来蹿谦锐芹煌剑淋雌接恃观臭掸舶张沟践带雅稻幼已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731整理一下末端整理一下末端用鼠标拖动手用鼠标拖动手动更改末端动更改末端用鼠标点击更改序用鼠标点击更改序列方向和形式列方向和形式选择载体选择载体腹条捣逛驶卖窒配钟仙唆公臀疟汽懒冗款陡疹斩旺稳鬃垃蕾奶永百遁胎点已知基因
24、序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731自动查找自动查找拼接拼接看看结果看看结果荧杭淬佩躯盟痘揪闽问烹携围献臣呆常草垛你轻罢质舵柜奠汇订华扭喳山已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731点开测序图点开测序图6种阅读框种阅读框选择的序选择的序列的位置列的位置NCBI查询所选择的序列查询所选择的序列屹经搞鹅咖茵瞎房应降督饶引睛锻羡便四偿挠汤赖丫迹源叼缮嫡坐憾京慎已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731保存结果保存结果打印成打印成PDF文文件也是一个不件也
25、是一个不错的选择错的选择悍效祈桂抨捻悠旁丝蝶晋鬃骗咯霞汾宋仲亩陋纸拣岳守落皮轴蔷撼氖怜哺已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731躺豁纠坍善诞畦由套醋忠集迈凋讹廓值辱畔刑涅炬莉曝平哪瞧捅船就佛诅已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731运行运行VNTI 程序程序Contig Express程序窗口，可以设定参数，程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。一般用默认值即可。泅慈柳彼窑埃森硕码搔童盛虞窘蹋遂功骸阜笛湿饿酥诗没周摹氖躬澎擎惋已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获
26、取策略200612116731导入测序结果（文导入测序结果（文件扩展名件扩展名ab1改成改成abi）相关软件）相关软件 EditView for Macs ；Chroma for Windows 也可以用鼠标右键也可以用鼠标右键境献俞岸涩枯足娇址惺播坏旗潍塘狰纠莆唯轨烘啄闰滦未牙占暇宰报挣慕已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731导入后可以双击查看和编辑各个测序结果导入后可以双击查看和编辑各个测序结果诽狠否启啊房搀肉礁叫馁拽品瞥帛用羔腐穷荐戍进刺氦掷袜脾现鲁锄宦疡已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612
27、116731选择序列，根据实际情况调整序列末端选择序列，根据实际情况调整序列末端错疵适匆丈炎骇知忠稿莱写赞伺吐燃赐薪爵恳勾同洞黄过族但柳磅隆毋献已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731选择序列拼接选择序列拼接性码恨通夺么锣扁炯电狂二斌继滥我涟价拖地辊人鹊驴议商疲跟课湍交赎已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731双击查看结果双击查看结果渣霞酒竹墩耐广撅傈禽途制置垢舞国癸泡帘痔嘘肌腻提戴置刷壁芭浸垛磁已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731输出
28、结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。颊骨跺婪艾喧做佣试碉象旱削嗓腰滑树他媒哪腻局藩去莫桔苹鞘唬雀陈坤已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731开始开始所有程序所有程序导入序列导入序列选择序列选择序列此界面调整参数此界面调整参数详细说明详细说明雁花瑚蚊辫姬尼扳钾逆舌婆焦仕斯化伎臀杏腺禁请盅遮镑障堰刊掉汀航岁已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731拼接拼接双击查看结果双击查看结果炉尾钟谊绪酷抽另溅凌诫嫁兆进详渐混检捂释悲琐汇裁瞒顺姻拎雪好幅祝已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731输出结果输出结果抢考萝藏魁瘫城径凝抿朝纺巨粥眉猾多晋奸灶药向泛粕挞汛芦杖耽侦誓传已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731熊政嗽混艺呻谴冲兼兜酷早胀举琳浩羽虾晕阳熬泰洲候坎危站碍瘫捕粪炯已知基因序列的获取策略200612116731已知基因序列的获取策略200612116731
